Scoring model based on the signature of non-m6A-related neoantigen-coding lncRNAs assists in immune microenvironment analysis and TCR-neoantigen pair selection in gliomas
基于非M6A相關(guān)新抗原編碼lncRNAs特征的評分模型有助于膠質(zhì)瘤的免疫微環(huán)境分析和TCR-新抗原配對選擇
發(fā)表期刊：J Transl Med
發(fā)表日期：2022 Oct 29
影響因子：8.440
DOI:? 10.1186/s12967-022-03713-z
一辜荠、研究背景
????????膠質(zhì)瘤是最普遍的腦腫瘤其障，5年生存率不超過3%帖努。導致膠質(zhì)瘤難治的一個因素是相對較低的免疫反應(yīng)蔚叨，即"免疫冷"或免疫抑制的反應(yīng)奥务。在大多數(shù)情況下乡括，癌癥產(chǎn)生于基因突變或DNA損傷的積累泪电。新抗原來源于這些非同義的基因突變弊知，包括單核苷酸變異（SNV）握牧、染色體缺失和插入容诬、基因融合和替代剪接。由于所呈現(xiàn)的新抗原可能會引起T細胞介導的抗腫瘤免疫沿腰，專門針對腫瘤細胞览徒，因此它們被認為是有前途的免疫治療目標。
????????lncRNAs的翻譯可以被許多因素調(diào)節(jié)颂龙，包括小的或短的開放閱讀框架（smORF或sORF）习蓬、eIF4E和N6-甲基腺苷（m6A）修飾。eIF4E是一種翻譯起始因子厘托，在磷酸化后與RNA的5′帽弱結(jié)合友雳，從而誘導抑制mRNA的翻譯，促進lncRNA和核糖體之間的相互作用铅匹。此外押赊，m6A修飾已被證明可以影響mRNA的翻譯。研究表明，m6A修飾的位點可作為環(huán)狀RNA的翻譯起始點流礁。
二涕俗、材料與方法
1、數(shù)據(jù)來源
1）mRNA測序數(shù)據(jù)從TCGA數(shù)據(jù)庫下載：169個多形性膠質(zhì)瘤（GBM）樣本和529個低級別膠質(zhì)瘤（LGG）樣本
2）驗證數(shù)據(jù)從中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜（CGGA）數(shù)據(jù)庫下載："mRNAseq_325 "和 "mRNAseq_693"神帅，在此分別標為CCGA325和CCGA693再姑；在CGGA693數(shù)據(jù)集中包括249個GBM樣本和444個LGG樣本
3）單細胞測序（scSeq）數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫：GSE84465，包含3589個細胞
4）還包括來自CGGA數(shù)據(jù)庫的另一個數(shù)據(jù)集找御，包含6148個細胞
5）GSE129671被用于SCENIC分析
6）細胞的注釋與一項同樣使用GSE84465數(shù)據(jù)集的研究中描述的一樣元镀，經(jīng)過輕微的修改
7）TCR測序數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫獲得，兩個數(shù)據(jù)集GSE79338和GSE188620被用于分析
8）LN229霎桅、U118MG栖疑、A172、U251MG和Jurkat細胞
9）患者和組織：WHO II級（n = 3）滔驶、III級（n = 3）和IV級（n = 3）的石蠟包埋膠質(zhì)瘤組織遇革；正常腦組織（n = 3）來自顱腦外傷患者；WHO II級（n = 4）和IV級（n = 4）的冷凍膠質(zhì)瘤組織
2揭糕、分析流程
三萝快、實驗結(jié)果
01 - 非m6A修飾在高等級膠質(zhì)瘤中被激活，NAS預測膠質(zhì)瘤患者的預后
????????首先著角，收集TCGA數(shù)據(jù)集中非M6A相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達水平揪漩。非m6A修飾根據(jù)其水平分為以下三類：1）高到中等水平的修飾，有數(shù)百到數(shù)千個修飾位點（Ψ和m5C）吏口；2）超低水平的修飾氢拥，有少數(shù)修飾位點（m1A）；3）未知水平的修飾锨侯，需要進一步確認（如N4-乙酰胞苷[ac4C]，2'-O-甲基化[Nm]冬殃，和7-甲基鳥苷[m7G]）囚痴。
????????接下來，前兩類的修飾审葬，包括Ψ深滚、m5C和m1A，被選為要研究的主要非m6A修飾涣觉。通過相關(guān)性分析并在R中用“igraph”包構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)選擇與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者總生存時間顯著相關(guān)的lncRNA痴荐，根據(jù)TransLnc，確定了潛在的肽編碼lncRNAs官册，其中的肽可以被MHC I呈遞生兆，因為MHC I是內(nèi)源性抗原的主要貢獻者，包括腫瘤衍生的抗原膝宁⊙荒眩總共發(fā)現(xiàn)了13個lncRNAs根吁，其中5個的HR大于1，8個的HR小于1合蔽。
????????建立新抗原活化評分（NAS）模型的過程見圖1A击敌。根據(jù)非M6A相關(guān)的新抗原編碼lncRNAs的表達進行共識聚類。來自TCGA的膠質(zhì)瘤樣本被分為兩個聚類拴事，以獲得每個聚類中最高的相關(guān)性沃斤，主成分分析（PCA）顯示了聚類1和聚類2之間的分布差異。作者確定了這兩個簇中選定的非m6A調(diào)節(jié)因子的表達刃宵，結(jié)果表明衡瓶，大多數(shù)writers和readers在簇2中被上調(diào)（圖1B）。對于erasers组去，F(xiàn)TO和TET2在群集1中明顯升高鞍陨，而ALKBH1和ALKBH3的水平在兩個群集之間沒有明顯差異（圖1B）。這表明與群集1相比从隆，群集2中的非m6A修飾狀態(tài)增強诚撵。在群集2中，HR大于1的lncRNAs表達水平明顯高于群集1键闺，而HR小于1的lncRNAs表達水平明顯較低（圖1C）寿烟。然后用SVM算法學習群集1和群集2的基因表達特征，并在驗證數(shù)據(jù)集中重現(xiàn)聚類模型辛燥，在CGGA325數(shù)據(jù)集中觀察到類似的結(jié)果筛武。此外，集群模型有效地預測了所有膠質(zhì)瘤和LGG的預后挎塌。在該模型中徘六，群集2表現(xiàn)出比群集1明顯更差的預后，而在GBM方面榴都，群集之間沒有明顯差異待锈。然而，在ROC分析中嘴高，集群模型的預后效果并不理想竿音，非M6A相關(guān)的新抗原集群模型的AUC值為0.72（圖1G），甚至低于年齡（AUC=0.82）和grade（AUC=0.82）拴驮。
????????作者假設(shè)聚類模型的準確性受到其對TCGA樣本二元分類的限制春瞬。為了提高非M6A相關(guān)的新抗原聚類模型的準確性，在聚類1和聚類2之間的DEGs基礎(chǔ)上建立了一個NAS模型套啤。該公式包括基因表達水平及其由PCA產(chǎn)生的權(quán)重宽气，所以它提供了一個量化的參數(shù)。根據(jù)對聚類模型的分析，聚類2比聚類1顯示出更差的預后抹竹，與聚類1相比线罕，所有HR>1的具有明顯預后效果的DEGs在聚類2中都有所升高。HR>1也表明一個基因的高表達與預后惡化有關(guān)窃判。另外钞楼，所有HR<1的具有明顯預后效果的DEG在聚類2中都下調(diào)。因此袄琳，該公式基本上反映了RNA-seq樣本的基因表達模式與聚類2之間的相似程度询件。與集群模型相比，NAS模型更精確地區(qū)分了不同層次的膠質(zhì)瘤亞型唆樊，并與選定的調(diào)節(jié)器或lncRNAs的表達高度相關(guān)（圖1B宛琅，C）。在CGGA325和CGGA693數(shù)據(jù)集中計算NAS時逗旁，也得到了類似的結(jié)果嘿辟。此外，NAS模型在預測TCGA（圖1D）片效、CGGA325（圖1E）和CGGA694（圖1F）數(shù)據(jù)集中GBM患者的預后時表現(xiàn)良好红伦，因為高NAS組呈現(xiàn)較短的平均生存時間。在這三個數(shù)據(jù)集中的所有膠質(zhì)瘤和LGG組都有類似的結(jié)果淀衣。非M6A相關(guān)NAS模型的AUC值為0.88昙读，遠遠高于集群模型，年齡和等級的值也是如此（圖1G）膨桥。
????????為了確定非m6A相關(guān)NAS模型和m6A相關(guān)NAS模型之間的差異蛮浑，以類似的方式構(gòu)建m6A相關(guān)NAS模型。m6A聚類模型的AUC值為0.59只嚣，而NAS模型為0.87（圖1G）沮稚。然后將所有3個數(shù)據(jù)集（TCGA、CGGA325和CGGA693）的數(shù)據(jù)合并册舞，再次計算所有模型的AUC值壮虫。結(jié)果表明，非m6A相關(guān)NAS模型的AUC值為0.76环础，比m6A相關(guān)NAS模型（AUC=0.66）大。這表明在所有三個數(shù)據(jù)集中剩拢，非m6A相關(guān)模型比m6A相關(guān)模型有更好的預后準確性线得。因此，非m6A相關(guān)的NAS模型被選為進一步研究的對象徐伐。
02 - 高NAS與膠質(zhì)瘤的侵襲性亞型相關(guān)聯(lián)
????????為了確定NAS與膠質(zhì)瘤亞型之間的關(guān)系贯钩，采用NMF聚類法，將樣本按照Verhaak分類分為三個聚類。結(jié)果顯示角雷，在三個亞型中祸穷，間質(zhì)（MES）亞型的平均NAS最高，而俯臥神經(jīng)（PN）亞型在所有三個數(shù)據(jù)集中的平均NAS最低（圖2A-C）勺三。MES亞型是最具侵略性的亞型雷滚，與不良的生存結(jié)果有關(guān)，而PN亞型顯示出最低的侵略性水平吗坚。因此祈远，NAS與膠質(zhì)瘤的侵襲性呈正相關(guān)，正如Verhaak分類法使用大量測序數(shù)據(jù)所預測的那樣商源。
????????GSE84465數(shù)據(jù)集中膠質(zhì)瘤細胞的scSeq數(shù)據(jù)被聚類和注釋（圖S6A）车份，每個聚類中的標記基因被確定（圖S6C）。使用同樣的程序在CGGA scSeq數(shù)據(jù)集上再現(xiàn)了結(jié)果（圖S6B牡彻，D）扫沼。此外，還使用SVM將細胞分為兩個聚類庄吼《谐基于聚類模型，使用R中的 "DEsingle "包探索DEGs霸褒，并計算NAS伴找。聚類2與t分布隨機鄰居嵌入（t-SNE）還原圖中NAS相對較高的細胞廣泛重疊（圖2D，E）废菱，Mann-Whitney檢驗證實了這些結(jié)果（圖2F）技矮。此外，還發(fā)現(xiàn)在GSE84465和CGGA數(shù)據(jù)集中殊轴，低腫瘤細胞的NAS明顯低于高腫瘤和炎癥相關(guān)的膠質(zhì)瘤細胞（圖2G）衰倦。然后將GSE84465數(shù)據(jù)集中的細胞分為四個先前建立的單細胞水平的分子亞型，然后通過分析剪接和未剪接RNA的豐度來計算GSE84465數(shù)據(jù)集中膠質(zhì)瘤細胞的RNA速度旁理，以便對膠質(zhì)瘤細胞的進化過程進行分析樊零。第2組中的大多數(shù)細胞處于其革命過程的末端（圖2H）。同時孽文，MES和少突膠質(zhì)細胞祖細胞樣（OPC）亞型位于革命途徑的末端（圖2I）驻襟，表明大多數(shù)膠質(zhì)瘤細胞隨著時間的推移變得更具侵略性。NAS隨著膠質(zhì)瘤細胞的發(fā)展而增加（圖2J）芋哭，表明NAS反映了膠質(zhì)瘤細胞革命的階段沉衣。這些結(jié)果也通過偽時間分析得到證實（圖S6I）。此外减牺，細胞軌跡分析顯示豌习，在GSE84465（圖S6E存谎，G）和CGGA數(shù)據(jù)集（圖S6F，H）中肥隆，OPCs和高新生膠質(zhì)瘤細胞處于細胞軌跡的頂端既荚，而低新生細胞處于細胞軌跡的上游。腫瘤性高的膠質(zhì)瘤細胞比腫瘤性低的細胞有更高的NAS栋艳，這一事實表明恰聘，當這種發(fā)展伴隨著更高的NAS時，膠質(zhì)瘤細胞會發(fā)展成更具侵略性嘱巾。這些數(shù)據(jù)共同表明憨琳，NAS和膠質(zhì)瘤的侵略性之間存在正相關(guān)關(guān)系。
03 - 較高的NAS膠質(zhì)瘤與較高的免疫浸潤水平相關(guān)聯(lián)
????????為了確定參與NAS水平差異的生物功能旬昭，作者對低或高NAS的TCGA樣本的DEGs進行富集分析篙螟。GSVA富集分析顯示，在GO和KEGG途徑中问拘，高NAS的樣本在T細胞介導的免疫遍略、NK細胞介導的細胞毒性以及抗原處理和表達方面顯示出較高的富集分數(shù)（圖3A，B）骤坐。GO富集分析在T細胞相關(guān)功能绪杏、抗原處理和呈現(xiàn)方面有非常相似的結(jié)果（圖3C），以及在KEGG數(shù)據(jù)庫中富集的重要途徑纽绍，包括免疫相關(guān)途徑蕾久，如NK細胞介導的細胞毒性、趨化因子信號途徑和抗原處理和呈現(xiàn)（圖3D）拌夏。scSeq數(shù)據(jù)的GSEA富集分析顯示僧著，高NAS組的抗腫瘤免疫因子（圖3E）。然而障簿，在這個數(shù)據(jù)集中盹愚，細胞-細胞粘附力被下調(diào)。對CGGA數(shù)據(jù)集中scSeq數(shù)據(jù)的分析也顯示站故，高NAS組的T細胞相關(guān)功能得到促進（圖3F）皆怕。總之西篓，NAS和非M6A相關(guān)的新抗原編碼lncRNAs與T細胞相關(guān)的免疫和抗原處理和表達有關(guān)愈腾。
????????為了確定NAS和免疫浸潤之間的關(guān)系，采用了R中的 "ESTIMATE "包來評估TCGA數(shù)據(jù)集中樣本的免疫浸潤岂津。NAS與免疫評分呈正相關(guān)顶滩，與腫瘤純度呈負相關(guān)（圖4A），表明較高的NAS意味著較高的免疫浸潤水平寸爆。對CGGA325和CGGA693數(shù)據(jù)集的樣本分析顯示了類似的趨勢礁鲁。之后，用CIBERSORT詳細分析了浸潤的免疫細胞的變化赁豆，結(jié)果表明仅醇，雖然CD8 + T細胞和T輔助細胞的比例升高，但調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞的比例增加魔种，而激活的NK細胞的比例下降（圖4B析二，C）。鑒于較高的NAS提示較差的生存結(jié)果和更具侵略性的腫瘤节预，分析了不抑制膠質(zhì)瘤細胞的較高免疫浸潤的可能機制叶摄。當膠質(zhì)瘤等級上升時，PD-L1的表達升高安拟，表明免疫抑制程度更高（圖4D）蛤吓。還發(fā)現(xiàn)四個lncRNAs（即AC060766.4、AC0738962糠赦、LEF-AS1和LINC00893）的表達與PD-L1呈正相關(guān)（圖4E）会傲。因此，很明顯拙泽，高NAS組的免疫浸潤高于低NAS組淌山，PD-L1表達的增加可能抑制了T細胞介導的免疫的激活。
????????用IHC檢測了NAS相關(guān)基因和PD-L1的表達顾瞻。在NAS中泼疑，PC1+PC2是影響最終結(jié)果的主要指標。檢查了NAS與TMSB10荷荤、VIM和PD-L1的表達之間的相關(guān)性（圖5A）退渗。結(jié)果顯示，NAS與TMSB10梅猿、VIM和PD-L1的表達明顯相關(guān)氓辣。然后用IHC檢測TMSB10、VIM和PD-L1的表達袱蚓。結(jié)果發(fā)現(xiàn)钞啸，更高級別的膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出更高的TMSB10、VIM和PD-L1水平（圖5B喇潘，C）体斩。這些結(jié)果表明，與NAS和PD-L1正相關(guān)的基因在較高等級的膠質(zhì)瘤中表達較多颖低，這也表明較高的NAS可能與較多的PD-L1表達有關(guān)絮吵。
04 - 高NAS組的T細胞陽性調(diào)節(jié)因子的異常表達可能導致T細胞功能失調(diào)
????????作者分析了T細胞的功能，它們是抗腫瘤免疫的直接執(zhí)行者忱屑。與Ca2+通量（AHNAK和CALML3）蹬敲、DNA修復（ZNF830）和自噬（HOMER1）相關(guān)的基因在TCGA數(shù)據(jù)集的高NAS組中被明顯下調(diào)（圖6A）暇昂。對CGGA325和CGGA693數(shù)據(jù)集的分析也取得了類似的結(jié)果，其他調(diào)節(jié)器在高NAS組中被上調(diào)伴嗡。
????????此外急波，TCGA樣本的SNV數(shù)據(jù)顯示，這33個基因的TMB在高NAS組高于低NAS組瘪校，沒有統(tǒng)計學意義澄暮，AHNAK對高和低NAS組貢獻了大部分的突變（圖6B，C）阱扬。同樣泣懊，第2組的樣本比第1組的樣本顯示出更多與這33個基因有關(guān)的突變負擔。高等級膠質(zhì)瘤的T細胞可能是對Ca2+通量麻惶、DNA修復馍刮、自噬和醛酮代謝的干擾。在這些基因的功能中用踩，由AHNAK介導的Ca2+通量被強調(diào)渠退，因為該基因在研究的33個基因中顯示了最多的突變。然后脐彩，作者試圖通過體外功能試驗來驗證Ca2+在T細胞功能中的作用碎乃。細胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM以0、10惠奸、20和40μM的濃度作用于Jurkat細胞48小時梅誓，然后檢測細胞內(nèi)鈣，在BAPTA-AM組中鈣明顯下降（圖6D）佛南。Jurkat細胞的增殖也受到BAPTA-AM處理的明顯抑制（圖6E）梗掰。對于共培養(yǎng)試驗，結(jié)果表明嗅回，IFN-γ的分泌在BAPTA-AM組也受到抑制（圖6F）及穗。BAPTA-AM組中剩余的LN229細胞的增加也表明激活的Jurkat細胞的功能受到抑制（圖6G，H）绵载。綜上所述埂陆，在高NAS樣本中，異常的Ca2+通量可能在T細胞介導的膠質(zhì)瘤生長抑制失敗中發(fā)揮了重要作用娃豹。
05 - 高NAS膠質(zhì)瘤與參與干性的轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)
????????為了確定TCGA焚虱、CGGA325和CGGA693數(shù)據(jù)集的上游調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，采用了X2K懂版。將低NAS組和高NAS組的DEGs導入X2K鹃栽，然后得到TCGA（圖7A）、CGGA325（圖7B）和CGGA693（圖7C）數(shù)據(jù)集的前20個上游調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子躯畴。注意到前20個轉(zhuǎn)錄因子中的一些在所有三個數(shù)據(jù)集中是共同的民鼓，如SUZ12薇芝、REST、EZH2丰嘉、SMAD4和AR恩掷。SUZ12、REST和EZH2基因有助于癌細胞的干性供嚎，它們在高NAS組中表現(xiàn)出更高的表達水平（圖7D）。這些結(jié)果表明峭状，在RNA-seq數(shù)據(jù)中克滴，較高的NAS與促進干性轉(zhuǎn)錄因子的表達有關(guān)。
????????在scSeq數(shù)據(jù)方面优床，應(yīng)用pySCENIC構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)劝赔。計算了GSE84465數(shù)據(jù)集中的差異性激活轉(zhuǎn)錄因子（圖7E）。前5個被激活的轉(zhuǎn)錄因子被證明胆敞，干性相關(guān)的基因着帽，在較高的NAS細胞中被激活，而在較低的NAS細胞中移层，前5個被激活的轉(zhuǎn)錄因子中沒有觀察到此類基因仍翰。然而，在CGGA scSeq數(shù)據(jù)中观话，得到了相反的結(jié)果予借。作者在數(shù)據(jù)集GSE129671中進行了另一次驗證。在五個最活躍的轉(zhuǎn)錄因子中频蛔，高NAS組的MYC結(jié)果為促進細胞干性灵迫。
????????為了研究膠質(zhì)瘤標本中干性相關(guān)和NAS相關(guān)基因的表達晦溪，作者應(yīng)用lasso來確定NAS的主要促成因素瀑粥。通過合并TCGA、CGGA325和CGGA693數(shù)據(jù)集三圆，確定了五個基因狞换，簡化的NAS可計算為：NAS=0.22864885*（COL5A2表達水平）+0.1083532*（PVP1表達水平）+0.07381116*（CHI3L2表達水平）+0.03597545*（SERPINE1表達水平）+0.02452755*（SOCS3表達水平）。得出的NAS與所有三個數(shù)據(jù)集的NAS高度相關(guān)（圖8A）嫌术。然后在4個II級和4個IV級膠質(zhì)瘤中用qRT-PCR檢測這五個基因哀澈。結(jié)果顯示，所有五個基因在IV級膠質(zhì)瘤中都有所升高度气，COL5A2和PVR1顯示出統(tǒng)計學意義（圖8B）割按，表明IV級膠質(zhì)瘤的NAS更高。而上述分析所確定的五個干性相關(guān)基因也被檢測到磷籍，包括EZH2适荣、SUZ12现柠、REST、SOX10和MYC弛矛。結(jié)果顯示够吩，只有EZH2在IV級膠質(zhì)瘤中明顯升高（圖8C）。這五個基因在病人衍生的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞和分化細胞中也被檢測到丈氓。它表明EZH2和SOX10在干樣細胞中明顯升高（圖8D）周循。這些結(jié)果表明，大多數(shù)樣本和數(shù)據(jù)集的高NAS組存在較高的干性万俗。而EZH2是檢測中最明顯升高的干性相關(guān)基因湾笛。
????????作者應(yīng)用R語言中的"celltalker "包來分析細胞間的交流，以確定高NAS組中T細胞功能被抑制的潛在機制闰歪。在低NAS組中嚎研，低腫瘤細胞在大多數(shù)重要的相互作用中是活躍的，通過ADAM12和ITGA9/SDC4途徑與樹突狀細胞和T細胞相互作用库倘，兩者在總的相互作用圖中沒有點（圖9A）临扮。相反，在高NAS組教翩，大多數(shù)相互作用發(fā)生在T細胞和OPC或炎癥相關(guān)膠質(zhì)瘤細胞之間（圖9B杆勇，C）。ADAM12和ITGA9/SDC4途徑是這些細胞之間的兩個主要途徑迂曲。
????????此外靶橱，還分析了T細胞與四種類型的膠質(zhì)瘤細胞之間的重要相互作用，結(jié)果顯示路捧，高NAS組的T細胞與低腫瘤性关霸、炎癥相關(guān)膠質(zhì)瘤細胞和OPC之間的相互作用比低NAS組多。此外杰扫，在CGGA數(shù)據(jù)集中队寇，T細胞沒有參與低NAS組的大多數(shù)重要的相互作用，而在高NAS組章姓，它們與其他免疫細胞相互作用佳遣。此外，關(guān)于顯著的相互作用凡伊，在高NAS組中零渐，只有一些T細胞和炎癥相關(guān)膠質(zhì)瘤細胞之間的相互作用是顯著的，表明炎癥相關(guān)膠質(zhì)瘤細胞參與了T細胞介導的免疫系忙。
????????值得注意的是诵盼，T細胞與NAS相對高于上述的高腫瘤性膠質(zhì)瘤細胞之間沒有明顯的相互作用。因此推斷較少的T細胞結(jié)合和細胞-細胞粘附可能是基本機制。結(jié)果顯示风宁，與其他三種膠質(zhì)瘤細胞類型相比洁墙，IFNGR1和JAK1的表達明顯較高，但JAK2的表達沒有明顯差異（圖9D-F）戒财。此外热监，IFNGR1被發(fā)現(xiàn)與NAS有明顯的負相關(guān)（圖8G），而JAK1和JAK2則沒有饮寞。還發(fā)現(xiàn)在CGGA數(shù)據(jù)集中孝扛，低腫瘤細胞顯示出較高的IFNGR1表達，但JAK1在低腫瘤細胞中的表達略有下降幽崩，IFNGR1和NAS之間存在明顯的負相關(guān)疗琉。這表明T細胞和膠質(zhì)瘤細胞之間的相互作用增加，而高腫瘤細胞可能通過下調(diào)IFNGR1以減少T細胞的結(jié)合來逃避這種相互作用歉铝。
06 - 預測具有兩種模式的TCR會與非m6A相關(guān)lncRNA的新抗原結(jié)合
????????為了確定一些基于非m6A相關(guān)新抗原模型的膠質(zhì)瘤治療的可能方法，篩選了已發(fā)表的TCR測序數(shù)據(jù)集凑耻，以探索可能與13個選定的非m6A相關(guān)lncRNAs編碼的肽結(jié)合的TCR克隆型太示。來自GSE79338的LGG和GBM樣本，被用來識別GBM和LGG的獨特TCR克隆型香浩。在尋找MHC限制性肽抗原的過程中类缤，使用GLIPH2算法將TCR克隆型聚類為CDR3模式，在GBM和LGG樣本中發(fā)現(xiàn)了許多在正常組織中找不到的獨特的TCR CDR3模式邻吭。從這些TCR CDR3模式中餐弱，提取了52種LGG和GBM樣本中的常見模式（圖10A）。通過比較GBM和LGG中的模式的頻率囱晴，確定了兩組之間差異最大的10個模式（圖10A）膏蚓。其中五個氨基酸模式在GBM模式中被上調(diào)，從而暗示這些模式可能廣泛存在于膠質(zhì)瘤患者中畸写，并可能與膠質(zhì)瘤的進展有關(guān)驮瞧。接下來，應(yīng)用DLpTCR算法來評估13個選定的lncRNA編碼的MHC I呈遞肽與上述GBM或LGG樣本中5個選定模式的TCR克隆型之間的識別和結(jié)合可能性枯芬。MNEQ和HDEQ是具有最大結(jié)合概率的模式（圖10B）论笔。
????????為了探索5種選定的模式，檢查了GSE188620數(shù)據(jù)集中四個膠質(zhì)瘤患者在腫瘤細胞裂解液接種前后的膠質(zhì)瘤組織的scTCR數(shù)據(jù)千所。在接種疫苗后的樣本中發(fā)現(xiàn)了獨特的克隆型（狂魔。然而，對于5個選定的模式淫痰，雖然HDEQ和RNKQ表現(xiàn)出極低的表達量最楷，但其他三個模式的表達量卻明顯較高。此外，接種疫苗后管嬉，%GSTDTQYF和MNEQ的總表達量明顯升高皂林，同時FGEQ也有輕微的、統(tǒng)計學上不明顯的下降（圖10C）蚯撩〈”叮患者1、3和4中%GSTDTQYF的表達量升高胎挎，但只有患者4中發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義（圖10D）沟启。患者1和2顯示出MNEQ表達的升高（圖10D）犹菇。還確定了疫苗接種后擴大的克隆型（圖10E）德迹，這可能包括新抗原反應(yīng)性TCR克隆型。確定了擴大的TCR克隆型和肽的結(jié)合可能性揭芍，有44個TCR-肽對的結(jié)合概率超過0.98胳搞；這表明潛在的新抗原反應(yīng)性TCR克隆型和選定的肽之間有很高的結(jié)合可能性〕蒲睿總之肌毅，作者確定13個選定的lncRNAs可能編碼的肽與潛在的新抗原反應(yīng)性TCR克隆型有很高的結(jié)合概率，這些克隆型在膠質(zhì)瘤組織中廣泛存在姑原。
四、結(jié)論
????????作者建立了一個基于非M6A相關(guān)的新抗原編碼lncRNAs和NAS的預后模型锭汛，發(fā)現(xiàn)它們與T細胞免疫笨奠、抗原處理和表達以及免疫浸潤呈正相關(guān)關(guān)系。還篩選了由所選lncRNAs翻譯的普遍靶向的新抗原的可能TCR克隆型唤殴。這項研究詳細說明了non-m6A修飾在lncRNA編碼的多肽中的重要作用般婆，它提供了TCR克隆型，可用于未來潛在的CAR-T研究和治療朵逝。
