今天分享一篇發(fā)表在MP上面的一個paper，是中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心發(fā)表的鸯匹，題目為"Single-cell RNA sequencing reveals a hierarchical transcriptional regulatory network of terpenoid biosynthesis in cotton secretory glandular cells"的研究論文潭千。但是好像是Research report，我還特地查了一下research article和research report的區(qū)別，以前只見過MP的perspective遏考。Research report好像不能超過3500 words，4個圖蓝谨。
這個paper闡述灌具，他們首次利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對棉花真葉不同細胞的基因表達進行全面分析，揭示了棉花葉片中萜類化合物代謝的空間分布規(guī)律譬巫，并從單細胞水平探究了陸地棉真葉在發(fā)育過程中和生物脅迫下萜類代謝的級聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)咖楣，為深入了解其他植物中關(guān)鍵化合物組分的生物合成、儲存及調(diào)控機制提供了新的見解芦昔。
=========實驗設(shè)計=========
這個paper中诱贿，選用幼嫩（15天）的陸地棉真葉進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，3個重復(fù)，共獲得28,655個單細胞轉(zhuǎn)錄組珠十。
=========實驗結(jié)果===========
1. 棉花葉片單細胞圖譜構(gòu)建
經(jīng)質(zhì)量控制料扰、降維聚類后，最終鑒定到6種細胞類型（圖1A和1B）焙蹭，分別是葉肉細胞（MC）晒杈、表皮細胞（EC）、保衛(wèi)細胞（GC）孔厉、維管束細胞（VC）拯钻、增殖細胞（PC）和分泌型腺體細胞（SGC）【其實說實話，從示意圖來看撰豺，我不是特別確定什么是SGC粪般，是棉花特有的嗎？我也是第一次在leaf的示意圖中見到】污桦。然后又用原位雜交驗證了一些比較出名的marker基因（圖1C-1H）亩歹。然后作者又分析了每個cell類型特異表達基因的GO富集（圖2A），比如葉肉細胞大多數(shù)與光合作用相關(guān)寡润，腺體細胞大多數(shù)與類異戊二烯的合成相關(guān)捆憎。
2. 非揮發(fā)性和揮發(fā)性萜類在腺體中特異合成
接下來，作者探索了棉酚合成的單細胞表達特征梭纹。通過原位質(zhì)譜躲惰，研究人員發(fā)現(xiàn)棉酚、半棉酚和半棉酚酮等均在棉花腺體中特異性積累变抽，但這些化合物是否由腺體細胞合成础拨，或由其它細胞合成后運輸?shù)较袤w中尚不清楚（圖2B）。研究團隊分析發(fā)現(xiàn)已知棉酚合成途徑及其上游甲羥戊酸途徑(mevalonic acid pathway, MVA pathway)酶基因均在棉花分泌型腺體細胞中特異表達（圖2C）绍载，表明棉酚等代謝物由棉花腺體細胞合成诡宗，并暗示了棉酚途徑和上游的甲羥戊酸途徑可能是被共同調(diào)控的（圖2）。
另外击儡，作者還發(fā)現(xiàn)其它負責(zé)揮發(fā)性單萜和倍半萜合成的萜類合酶（附圖6A）同樣在分泌型腺體細胞中特異表達塔沃，證明揮發(fā)性萜類化合物也是在棉花分泌型腺體細胞中合成（圖2D）。通過TPS6的VIGS也證實了它在一些萜類化合物中的功能阳谍。
最后作者總結(jié)了一個從MVA到棉酚以及其它萜類化合物的合成模型（圖2E）蛀柴。
3. 揮發(fā)性和非揮發(fā)性萜類化合的合成是受HSFA4a和NAC42調(diào)控的
基于前面的發(fā)現(xiàn)，作者可以在SGC里面發(fā)現(xiàn)一大批特異表達的基因矫夯，而這些基因可能調(diào)控了萜類的合成鸽疾。用比較嚴格的標準，作者鑒定了20個特異表達的轉(zhuǎn)錄因子（附圖7）训貌。
最后制肮，作者落腳到了兩個新的轉(zhuǎn)錄因子GoHSFA4a和GoNAC42冒窍。GUS染色顯示他們在pigment 里面特異表達（圖3B）。VIGS敲除這2個基因之后發(fā)現(xiàn)棉酚相關(guān)的萜類（圖3C）以及發(fā)揮性的半倍萜（圖3D）豺鼻，MEP通路相關(guān)的一些單帖（圖3E）顯著下降综液。同時MVA途徑，棉酚合成以及一些TPS在VIGS植株中也顯著下降（圖3F）儒飒。亞細胞定位顯示GoHSFA4a和GoNAC42均位于細胞核（附圖13A）意乓。LUC實驗結(jié)果表明這2個轉(zhuǎn)錄因子激活了MVA和棉酚途徑上的基因（圖3G,3H和附圖13B）。酵母雙雜也表明HSFA4a可以直接和MVA途徑的HMGS以及棉酚途徑的CYP736A196互作（圖3I和附圖13C）约素。而NAC42則可以和HMGR以及DH1基因互作（圖3J和附圖13D）。
4. GoPGF在腺體細胞里面激活GoHSFA4a和GoNAC42的表達
GoPGF是已知的非常重要的一個調(diào)控腺體發(fā)育和棉酚合成的基因笆凌，因此作者接下來探索了GoPGF和這2個轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系圣猎。在GoPGF敲除的植株中，這兩個轉(zhuǎn)錄因子的表達明顯降低（圖4A）乞而。Chip-seq結(jié)果表明GoPGF可以直接結(jié)合到這2個轉(zhuǎn)錄因子的promoter區(qū)域（圖4B）送悔。酵母雙雜也表明可以和這2個轉(zhuǎn)錄因子直接互作，并且和HSFA4a的G-box爪模，和NAC42的E-box（圖4C欠啤，4D）。LUC實驗也獲得了同樣的結(jié)果（圖4E）屋灌。但是這2個轉(zhuǎn)錄因子之間并不互作洁段。
5. GoHSFA4a和GoNAC42介導(dǎo)生物脅迫下萜類的合成
一般萜類和棉酚在抗蟲和病原菌的防御上有著重要的作用。所以作者接下來又查看了這2個轉(zhuǎn)錄因子在蟲子和病原菌侵染下的功能共郭。在病原菌侵染和蟲子侵染的樣品中祠丝，這2個轉(zhuǎn)錄因子顯著升高，但是GoPGF則基本沒有變化（圖4F除嘹，4G）写半。也就是說這兩個轉(zhuǎn)錄因子可以獨立于GoPGF響應(yīng)病菌侵染和昆蟲取食等生物脅迫。也就是說HSFA4a和NAC42這2個轉(zhuǎn)錄因子起著生物脅迫和棉酚尉咕，萜類合成的橋梁叠蝇。
最后作者給出了一個總結(jié)模型（圖4H）。
