摘要
??測(cè)了擬南芥整個(gè)生長(zhǎng)階段的來(lái)自27個(gè)不同組織或器官的小RNA渣淤。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析之后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的miRNA普遍存在，然而有少數(shù)的miRNA是特異表達(dá)的。相同miRNA家族的不同成員有特異的時(shí)空表達(dá)模式。還發(fā)現(xiàn)在不同的發(fā)育階段，相同發(fā)卡前體的不同臂都能產(chǎn)生miRNA残邀。
INTRODUCTION
- 小RNA的分類，有什么作用（轉(zhuǎn)錄后調(diào)控）障涯，以及發(fā)生過(guò)程（miRAN如何從前體發(fā)展到與AGO蛋白結(jié)合到形成RISC復(fù)合物）罐旗；
- miRNA與miRNA star由同一發(fā)卡結(jié)構(gòu)的兩條臂產(chǎn)生，通常miRNA star在形成后會(huì)被迅速降解唯蝶，但已有研究表明在不同的組織和階段九秀，miRNA star會(huì)積累和起作用—— arm switching；
- 提到了三個(gè)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)：
PMRD: plant microRNA database, 和PNRD一樣都是中農(nóng)做的粘我；
mirEX 2.0: expression profiling of plant microRNAs鼓蜒；
PmiRExAt: plant miRNA expression atlas database； - 共計(jì)353,686,537 reads征字，得到了全面的miRNA及一些突變體
- 基于觀測(cè)到的結(jié)果都弹，猜想miRNA雙鏈體的兩條鏈可能都有重要作用。
MATERIALS AND METHODS
我先看的方法部分匙姜，再看的結(jié)果和討論部分畅厢。計(jì)劃將文中的分析部分重復(fù)一遍。
1. Plant material and growth conditions
每個(gè)處理兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)氮昧，在一個(gè)生物學(xué)重復(fù)中還可能存在兩到三個(gè)技術(shù)重復(fù)框杜。
2. Small RNA library construction and deep sequencing
3. Bioinformatic analysis of sRNAs
在過(guò)濾掉低質(zhì)量的reads和接頭之后浦楣，將18-28nt的reads用bowtie比對(duì)到擬南芥的參考基因組（TAIR10）。不允許錯(cuò)配咪辱，且排除那些比對(duì)到產(chǎn)生rRNA-, tRNA-, snRNA-, snoRNA的區(qū)域的reads振劳。S-plots (small RNA plots)用于評(píng)估這些miRNA位點(diǎn)。
擬南芥成熟miRNA和miRNA前體序列從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)下載油狂。miRNA和miRNA star的豐度用RPM標(biāo)準(zhǔn)化历恐。
用R中的相關(guān)系數(shù)函數(shù)cor()計(jì)算cluster之間的相關(guān)系數(shù)并畫(huà)出聚類樹(shù)狀圖。計(jì)算中RPM取log2的值专筷。
arm switching事件的研究是通過(guò)miRNA/miRNA*的值取log2()后作圖來(lái)看的弱贼。
4. Small RNA Northern blot
Northern blot：是一種通過(guò)檢測(cè)RNA的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)的方法，通過(guò)northern blot的方法可以檢測(cè)到細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況仁堪。此處的基因包括編碼及非編碼蛋白基因哮洽。
UV cross-linked：254nm紫外輻射系統(tǒng),主要用于將核酸交聯(lián)于膜上填渠。尼龍膜上固定核酸的方法不限于烘烤弦聂，將吸印后的膜置于紫外燈下照射片刻也能使核酸與膜產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)。
提取出的小RNA用15% SDS-PAGE的凝膠分離氛什，后轉(zhuǎn)移至Hybond-N+膜上莺葫，這種是紫外交聯(lián)的，并且雜交了末端標(biāo)記有P32的寡核苷酸探針枪眉。探針序列如下：
5. Accession numbers
GSE79414
總的來(lái)看贸铜，以上方法部分較簡(jiǎn)單堡纬。重復(fù)出來(lái)的難度應(yīng)該不大。
RESULTS
1. 擬南芥中小RNA的特征
先是求出生物學(xué)重復(fù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)蒿秦，接近1烤镐，說(shuō)明強(qiáng)相關(guān)性，以此說(shuō)明好的可再現(xiàn)性和建庫(kù)測(cè)序質(zhì)量棍鳖。
接著做了各個(gè)組織中小RNA長(zhǎng)度的分布柱形圖，21渡处，24nt的小RNA最多镜悉，符合先前的發(fā)現(xiàn)，分別對(duì)應(yīng)miRNA和hc-siRNA医瘫。在不同的組織和階段侣肄，二者又有比例高低的變化。在花組織中醇份，hc-siRNA比例比miRNA高很多稼锅。子葉叮喳，幼葉，莖葉中,miRNA比例略高于hc-siRNA缰贝。
然后分析了在不同組織中馍悟，21nt和24nt小RNA的5’的起始?jí)A基，發(fā)現(xiàn)21-nt sRNA傾向于以U開(kāi)始剩晴，24-nt sRNA傾向于以A開(kāi)始锣咒。而5'的堿基與AGO蛋白的結(jié)合有關(guān)。
2. 分析擬南芥中產(chǎn)生miRNA的基因
目的是評(píng)估m(xù)iRBase數(shù)據(jù)中已記錄的赞弥，以及發(fā)現(xiàn)新的毅整。
如何評(píng)估呢？其實(shí)就是比對(duì)到已有的前體序列上绽左。上圖就是一個(gè)例子悼嫉，橫軸為堿基位置，縱軸為標(biāo)準(zhǔn)化的reads數(shù)拼窥∠访铮可以看出miRNA明顯比miRNA*要多。
文章緊接著說(shuō)到依據(jù)其數(shù)據(jù)將之前判定為miRNA基因的cluster重新認(rèn)定為siRNA基因的cluster鲁纠∽芸茫基于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：sRNA豐度比，鏈比改含。豐度比：在一個(gè)cluster上兩個(gè)主要小RNA豐度/所有小RNA豐度的比值情龄；鏈比：比對(duì)到一條鏈上的reads數(shù)/比對(duì)到兩條鏈上的reads數(shù)。miRNA和miRNA*來(lái)源于一條鏈的折疊捍壤，因此鏈比接近1骤视；而siRNA來(lái)源于兩條鏈，鏈比接近0.5（之前分享的文獻(xiàn)中判定phasiRNA也用到了鏈比這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)）鹃觉。
那這兩個(gè)閾值如何界定呢专酗？
文章又比較了保守miRNA和非保守miRNA的這兩個(gè)指標(biāo)。
最終分別選了0.63和0.8作為閾值帜慢。到這兒我有個(gè)疑問(wèn)：區(qū)分siRNA-like cluster和miRNA笼裳，為何要比較保守和不保守miRNA？
3. miRNA表達(dá)的整體分析
miRNA表達(dá)量的計(jì)算粱玲，之前簡(jiǎn)單寫(xiě)過(guò)一篇筆記：計(jì)算已知miRNA的表達(dá)量
熱圖的繪制也有一篇筆記：用pheatmap畫(huà)個(gè)熱圖
B圖表示的是miRNA表達(dá)模式相似的樣本聚為一類躬柬。
因?yàn)閳DB的聚類結(jié)果非常好，因此文章得出結(jié)論：miRNA表達(dá)差異更多得由組織差異貢獻(xiàn)抽减，發(fā)育階段的差異貢獻(xiàn)相對(duì)小允青。
68%保守miRNA在所有樣本中表達(dá)，僅7%在低于25個(gè)樣本中表達(dá)卵沉，這與非保守miRNA明顯不同颠锉。事實(shí)也是如此：很多基礎(chǔ)的生命活動(dòng)由保守miRNA調(diào)控法牲，如營(yíng)養(yǎng)代謝，激素信號(hào)傳導(dǎo)（nutrition metabolism and hormone signaling）琼掠。
探究發(fā)育階段特異性對(duì)miRNA表達(dá)的影響拒垃，并做了Northern blot驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與生信分析結(jié)果一致瓷蛙。
接下來(lái)做了萼片悼瓮，花瓣，雄蕊和雌蕊四個(gè)花組織的表達(dá)分析艰猬。找了107個(gè)有差異的miRNA横堡，并聚類為四類。結(jié)果表明雄蕊中冠桃，特異表達(dá)的miRNA最多命贴。
隨機(jī)挑了一些miRNA做Northern blot，來(lái)比較四個(gè)組織中miRNA的差異表達(dá)食听。miR776, miR771都是22nt的胸蛛，又因?yàn)椤?2-nt的miRNA適合trigger phasiRNA的生成”，因此碳蛋，文章覺(jué)得胚泌，雌蕊發(fā)育需要secondary siRNA （應(yīng)該和phasiRNA差不多）。
4. 相同miRNA家族的不同成員顯示了組織間的表達(dá)差異
如下圖：
接著以miR156家族為例肃弟，繪制了其成員對(duì)應(yīng)的loci的分子進(jìn)化樹(shù)
然后是成熟序列的比較，其中miR156h變異太多零蓉，影響了與原本可以結(jié)合的mRNA的結(jié)合笤受，進(jìn)而影響（啟動(dòng)）mRNA的功能。
接著是不同家族成員的差異表達(dá)分析及驗(yàn)證
從AtGenExpress expression atlas獲取了SPL這幾種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平敌蜂，如下圖箩兽，Stamens，Carpels中SPL3表達(dá)水平有差異章喉，可能就是C圖Stamens汗贫，Carpels組織的miR156不同帶來(lái)的。
5. 不同組織和發(fā)育階段的Arm switching事件判定
這部分內(nèi)容較簡(jiǎn)單秸脱，就是比對(duì)的時(shí)候記錄清楚miRNA和miRNA*上的reads數(shù)即可落包。比值從>1變?yōu)?lt;1或是從<1變?yōu)?gt;1就是Arm switching事件。需要注意的是摊唇，文章在這里并沒(méi)有取1為閾值咐蝇，為了避免background fluctuations，文章選擇了1.2和0.8作為界定值巷查。
