今天分享一篇來自nature communications的文章：The genetic basis of sex determination in grapes

Massonnet, M., Cochetel, N., Minio, A. et al. The genetic basis of sex determination in grapes. Nat Commun 11, 2902 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-16700-z

Abstract

對(duì)于植物性別分化基因及突變的鑒定至今仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)遥皂。在此，本文研究了葡萄物種中性別決定區(qū)域（SDR）的結(jié)構(gòu)和演化聋溜。并報(bào)道了一個(gè)改進(jìn)的、染色體級(jí)別的赤霞珠（Cabernet Sauvignon）葡萄的基因組序列信息及逐步組裝了9個(gè)野生和栽培葡萄的基因組责静。通過解析20個(gè)葡萄品種的SDR單倍型徽缚，我們比較了雄性、雌性和雌雄同體的單倍型結(jié)構(gòu)驱富，并確定了性別決定相關(guān)區(qū)域锚赤。結(jié)合基因表達(dá)數(shù)據(jù)，我們確定了VviINP1基因中的一個(gè)候選雄性不育突變褐鸥，以及與轉(zhuǎn)錄因子VviYABBY3相關(guān)的潛在雌性不育功能线脚。數(shù)據(jù)表明，在雌雄同體單倍型之間很少發(fā)生重組事件叫榕，導(dǎo)致雌雄異株在馴化過程中丟失浑侥。這項(xiàng)工作顯著地促進(jìn)了對(duì)葡萄性別決定遺傳基礎(chǔ)的理解，并提供了在葡萄育種計(jì)劃中快速鑒定性別類型所必需的信息晰绎。

Introduction

植物具有多種交配系統(tǒng)寓落。有些是雌雄同株異花的，在同一株植物上有單獨(dú)的雄花和雌花荞下；還有一些是雌雄同體的伶选，有兩性花。有時(shí)植物具有單獨(dú)的雄性和雌性個(gè)體尖昏，這種交配系統(tǒng)稱為雌雄異株仰税。雌雄異株需要保證異交，但這只發(fā)生在5-6%的被子植物中抽诉。盡管雌雄異株比較罕見陨簇，但它在系統(tǒng)發(fā)育上是廣泛存在的，表明它在多種情況下都是獨(dú)立進(jìn)化的迹淌。

由于雌雄異株的多種進(jìn)化起源和一些重要的經(jīng)濟(jì)作物具有雌雄異株的特性河绽，因此雌雄異株一直是眾多進(jìn)化和遺傳研究的焦點(diǎn)。關(guān)于雌雄異株起源的一個(gè)常見的假設(shè)是雙基因座模型巍沙，該模型要求雌雄異株從一個(gè)雌雄同體的祖先分兩步演化而來葵姥。第一步包括阻斷雄性性別決定功能的隱形突變。具有純合雄性不育突變的個(gè)體只保留雌性功能句携，而具有這種突變的種群中既有雌性也有雌雄同株的個(gè)體榔幸。第二步需要一個(gè)顯性突變來抑制雌性的功能，從而產(chǎn)生雄性。這種雙基因座系統(tǒng)只有在兩個(gè)基因座完全連鎖的情況下才能保持雌雄分離削咆，因?yàn)樗鼈冎g的重組可以恢復(fù)雌雄同體牍疏。對(duì)包括木瓜（Carica papaya）、草莓（Fragaria virginiana）拨齐、白花蠅子草（Silene latifolia）鳞陨、獼猴桃（Actinidia spp.）、葡萄（Vitis spp.）等物種的研究發(fā)現(xiàn)瞻惋，支持了這一雙基因座模型厦滤。然而，導(dǎo)致雌雄異株的不育突變尚未在任何物種中被完全鑒定出來歼狼。到目前為止掏导，對(duì)于不育突變基因最可能的候選來自于對(duì)蘆筍和獼猴桃的研究。例如羽峰，在蘆筍中趟咆，雌性缺少一種與絨氈層發(fā)育相關(guān)的基因，而突變的雄性缺少一種假定的雌性抑制基因梅屉，因而無法恢復(fù)雌雄同體值纱。

在此，我們研究了葡萄屬的性別決定區(qū)域（SDR）坯汤。約有70種野生葡萄都是雌雄異株的虐唠，表明該屬自起源以來，雌雄異株一直是保守的玫霎。栽培葡萄（Vitis vinifera ssp. vinifera; hereafter Vv vinifera）凿滤，葡萄的一種妈橄，已恢復(fù)為雌雄同株庶近，盡管其野生（Vitis vinifera ssp. sylvestris (hereafter Vv sylvestris)）祖先是雌雄異株的。這種交配系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變發(fā)生在大約8000年前的馴化時(shí)期眷蚓，可能是雄性(M)和雌性(F)單倍型之間發(fā)生了一次罕見的重組事件所導(dǎo)致的鼻种。因此，葡萄有三種類型的個(gè)體（Fig. 1a, b）：（i）雌蕊減少的雄花沙热，沒有柱頭或花柱發(fā)育叉钥；（ii）雌花含有反折的花藥和能釋放不育花粉粒的雄蕊；（iii）栽培葡萄中的雌雄同花個(gè)體篙贸，其具有完美的花朵投队，帶有功能性的雌蕊和雄蕊，具有可育的花粉爵川。這三種類型由SDR區(qū)域中的基因型決定敷鸦。其中雄性類型為雄性和雌性單倍型（MF）的雜合子，雌性類型為純合子（FF），以及栽培葡萄（Vv vinifera）的雌雄同花要么是雌雄同花單倍型（HH）的純合子扒披，要么是雜合子（HF）值依。

之前的遺傳和基因組上的研究已經(jīng)確定了葡萄中SDR的大致邊界。在葡萄屬中碟案，SDR在遺傳上映射到2號(hào)染色體上約150 kbp的區(qū)域愿险，這其中包含15到20個(gè)基因。在野生葡萄（sylvestris Vv）中价说，該區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性具有高度的連鎖不平衡辆亏，表明M和F單倍型之間存在很低或不存在重組。假設(shè)該區(qū)域包含由雙基因座模型預(yù)測(cè)的隱性雄性不育等位基因和顯性雌性不育等位基因鳖目，并且已通過基因表達(dá)比較分析嘗試對(duì)其進(jìn)行鑒定褒链。其中一個(gè)候選基因，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因VviAPT3疑苔，在雄花的心皮原基中表達(dá)甫匹，表明其與雌蕊敗育有關(guān)。

直到最近惦费，葡萄的性別決定研究中兵迅，一個(gè)主要的限制是，栽培葡萄（Vv vinifera）的參考基因組僅代表部分組裝的F單倍型薪贫。最近的研究解析了四種SDR單倍型的部分序列信息恍箭，包括三種H單倍型和一種F單倍型。然而瞧省，盡管在這方面取得了重大進(jìn)展扯夭，但是由于缺乏M單倍型的信息，我們對(duì)SDR區(qū)域和性別決定因素的理解一直受到阻礙鞍匾。

為了填補(bǔ)這一空白交洗，我們逐步組裝了包括雌雄同花栽培葡萄、雄株和雌株野生葡萄在內(nèi)的9個(gè)二倍體基因組橡淑。所有這些基因組都是基于高覆蓋率的PacBio長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序构拳。對(duì)于每個(gè)基因組，手動(dòng)校正了遺傳定義的單倍型中SDR區(qū)域梁棠，并已在雄株置森、雌株和雌雄同花個(gè)體的花朵發(fā)育早期和晚期測(cè)定了從該區(qū)域表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。有了這些廣泛的序列和表達(dá)數(shù)據(jù)符糊，我們比較了F凫海、H和M單倍型，以更好地定義SDR區(qū)域男娄，確定候選的性別決定基因行贪，并評(píng)估H單倍型是否源于重組事件把兔。

Fig 1. 葡萄花形態(tài)及野生和栽培種的系統(tǒng)發(fā)育分析

Results

性別特異性單倍型在整個(gè)葡萄屬中都是保守的

我們對(duì)8個(gè)葡萄品種的完整基因組進(jìn)行了測(cè)序和組裝，其中包括3個(gè)雌雄同花的栽培葡萄（Vv vinifera）品種(Merlot, Black Corinth seedless and Black Corinth seeded)瓮顽、4個(gè)野生葡萄品種（sylvestris Vv）（兩個(gè)雌株和兩個(gè)雄株）县好、和一個(gè)（V. arizonica）雄株。此外暖混，還對(duì)雄株圓葉葡萄（Muscadinia rotundifolia）的基因組進(jìn)行了測(cè)序缕贡，并將其作為葡萄雌雄異株的外群（Fig. 1c）。每個(gè)基因組都是基于單分子實(shí)時(shí) DNA 測(cè)序和 FALCON-Unzip從頭組裝拣播，產(chǎn)生部分倍型的二倍體基因組晾咪。我們還使用了包括赤霞珠（Cabernet Sauvignon）和金粉黛（Zinfandel）兩個(gè)可公開獲得的基因組，并對(duì)這兩個(gè)品種以相同的方法進(jìn)行了測(cè)序和組裝贮配。所有的二倍體組合都是高度連續(xù)的谍倦，并且大約覆蓋了預(yù)期單倍體基因組大小的兩倍（Supplementary Data 1）。通過HiC染色質(zhì)互作圖譜泪勒、光學(xué)圖譜和多種輔助組裝手段進(jìn)行輔助掛載和組裝昼蛀，赤霞珠（Cabernet Sauvignon）基因組的組裝得到進(jìn)一步改進(jìn)，從而得到了全部19條染色體和兩個(gè)階段性拷貝hap1和hap2圆存。

通過將性別連鎖標(biāo)記的引物與赤霞珠2號(hào)染色體階段性拷貝hap1參考序列進(jìn)行比對(duì)叼旋，首次鑒定了SDR區(qū)域。然后將赤霞珠hap1拷貝中SDR區(qū)域的蛋白質(zhì)編碼序列與其他10個(gè)基因組組裝序列進(jìn)行比對(duì)沦辙，以識(shí)別同源區(qū)域夫植。接著，我們手工標(biāo)注了每個(gè)基因組中每個(gè)單倍型的SDR區(qū)域油讯，并根據(jù)已知的基因型（Fig. 1c）和已知的H vs. F單倍型結(jié)構(gòu)來指定性別類型(M详民、F或H)。通過這些方法陌兑，我們解決了20個(gè)葡萄品種的SDR單倍型（5H沈跨、12F、3M 單倍型）和M. rotundifolia的M和F單倍型诀紊。

Fig 2. 性別特異性單倍型在整個(gè)葡萄屬中都是保守的

所有的SDR單倍型都與赤霞珠hap1拷貝H單倍型比對(duì)谒出，以評(píng)估其結(jié)構(gòu)差異并鑒定性別特異性特征（Fig. 2; Supplementary Fig. 1）。不同性別類型邻奠，其長(zhǎng)度存在明顯差異。單倍型大小在約171.6-837.4 kbp之間（Fig. 2a-c）为居，但F單倍型（181.4 ± 10.2 kbp)）明顯短于M （425.9 ± 274.6 kbp碌宴；Mann-Whitney test, P value?=?0.0008403）單倍型和H（289.2?±?7.4?kbp； P value?=?0.0002334）單倍型蒙畴。這些長(zhǎng)度差異反映了性連鎖結(jié)構(gòu)變異的存在（SVs; >50?bp）贰镣。例如呜象，12個(gè)葡萄F單倍型與H單倍型赤霞珠相比，共有8個(gè)大的缺失碑隆，總長(zhǎng)度為117.4 kbp（Fig. 2b）恭陡。這些與F單倍型連鎖的大部分缺失（62.9%）由轉(zhuǎn)座元件（TE）構(gòu)成，包括 LTR上煤、 Gypsy休玩、 Copia 和 MuDR 元件。同樣劫狠，相對(duì)于參考序列H單倍型拴疤，這3個(gè)M單倍型共享兩個(gè)大SVs，包括在4,802,134處的22.6 kbp插入和在5,021,983到5,052,079處的30 kbp缺失独泞。此外呐矾，V. arizonica 的M單倍型有一個(gè)獨(dú)特的約400 kbp的插入，M. rotundifolia 的M單倍型包含的倒置涵蓋了SDR區(qū)域的57%（Fig. 2a）懦砂。不同性別類型的SDR單倍型中基因含量不同蜒犯。20個(gè)葡萄的SDR單倍型共有13個(gè)SDR基因，其中2個(gè)SVs的基因含量發(fā)生了變化荞膘。如前人觀察的一致（Zhou et al）愧薛，F(xiàn)單倍型具有與H單倍型和Vv sylvestris 的M單倍型相關(guān)的SV，該單倍型刪除了兩個(gè)編碼TPR-containing蛋白的基因衫画。此外毫炉，與F單倍型相比，H型和M型單倍型中缺失一個(gè)黃素單加氧酶（FMO削罩，FLAVIN-CONTAINING MONOOXYGENASE）基因瞄勾。（Vitis and M. rotundifolia）真葡萄屬和圓葉葡萄屬植物的總體結(jié)構(gòu)和基因含量較為保守。盡管存在較大的倒置弥激，但M. rotundifolia的M型基因含量和順序與Vitis的M型相似进陡，M. rotundifolia的F型基因含量和順序與Vitis的F型基因含量和順序相同（Fig. 2d）。最后微服，在SDR的前60kbp范圍內(nèi)趾疚，H單倍型的結(jié)構(gòu)與F單倍型相似，但在該區(qū)域下游以蕴，其結(jié)構(gòu)上與M單倍型更相似（Fig. 2d）糙麦。

與性別連鎖的多態(tài)性影響蛋白序列

我們利用赤霞珠H單倍型的序列做比對(duì)，來鑒定葡萄屬植物中與性別密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性SNPs丛肮。所有的F-和M-相關(guān)的多態(tài)性都是在赤霞珠2號(hào)染色體中hap1拷貝的4801876到5061548的位置發(fā)現(xiàn)的（Fig. 3a; Supplementary Data 2; Supplementary Fig. 2）赡磅，這些區(qū)域隨后確認(rèn)并界定為SDR區(qū)域。共有1275個(gè)SNPs被12個(gè)葡萄F單倍型與H和M單倍型共享宝与，270個(gè)SNPs被3個(gè)M單倍型與F和H單倍型共享焚廊。有趣的是冶匹，M單倍型連鎖的SNP在SDR區(qū)域的前8 kbp中最密集（4801876-4809592區(qū)間包含176個(gè)SNPs），而第一個(gè)與F單倍型連鎖的SNP在M單倍型連鎖的SNP密集群下游約40 kbp處（4842196; Fig. 3a）咆瘟。雖然由于兩屬間的差異嚼隘，性別特異性SNP的數(shù)量有所減少，但在比較中加入圓葉葡萄單倍型后袒餐，性別特異性SNP的分布基本一致（Supplementary Fig. 3）飞蛹。

許多與性別連鎖的SNPs會(huì)改變編碼的氨基酸（Fig. 3b）∧淠耍總的來說桩皿，我們發(fā)現(xiàn)了6個(gè)與M單倍型連鎖的非同義SNPs：其中兩個(gè)在YABBY轉(zhuǎn)錄因子（TF）編碼的基因VviYABBY327上，兩個(gè)在醛縮酶編碼基因中幢炸，一個(gè)在海藻糖-6-磷酸酶（TPP）編碼基因中泄隔，還有一個(gè)在第三個(gè)FMO基因中。這些非同義的與M單倍型連鎖的SNPs代表了潛在的雌性不育突變宛徊。同樣的佛嬉，我們?cè)?0個(gè)基因中檢測(cè)到了89個(gè)F單倍型特異性的非同義SNPs（Supplementary Data 2）。這些非同義SNPs分布在下列基因中闸天，其中TPP（1）暖呕、VWINP1（1）、exostosin-coding gene（7）苞氮、3-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III gene (KASIII)（3）湾揽、PLATZ TF-coding gene (PLATZ)（7）、first FMO gene（18）笼吟、the second FMO（26）库物、the third FMO（11）、the hypothetical protein VviFSEX（11）贷帮、VviAPT3（4）戚揭。其中3個(gè)SNPs在4個(gè)FMO基因的前兩個(gè)中引入了一個(gè)提前終止密碼子（Fig. 3e）。

Fig 3. 與性別連鎖的多態(tài)性影響了蛋白的序列

為了更好地理解SDR區(qū)域的進(jìn)化歷程撵枢，進(jìn)一步鑒定雄性不育和雌性不育候選基因民晒，我們根據(jù)葡萄的序列構(gòu)建了每個(gè)SDR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（Fig. 3f; Supplementary Fig. 4）。在大多數(shù)SDR中锄禽，等位基因傾向于按性別分類潜必，聚類模式隨基因座的變化而變化（Fig. 3f; Supplementary Fig. 4）。從VviYABBY3到醛縮酶基因開始的4個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹將除F和H單倍型序列外的大多數(shù)M單倍型序列聚集在一起沟绪，VviYABBY3和醛縮酶等位基因形成了將M與F和H單倍型同源序列分開的分支（Fig. 3f）刮便。這種模式從TPP開始轉(zhuǎn)變；對(duì)于TPP绽慈、VviINP1恨旱、exostosin、KASIII坝疼、PLATZ搜贤、三個(gè)FMO、假設(shè)的蛋白質(zhì)基因VviFSEX和VviAPT3钝凶，F(xiàn)單倍型序列聚集在M和H等位基因之外（Fig. 3f）鹏溯。這些系統(tǒng)發(fā)育與觀察到的性別特異性多態(tài)性是一致的（Fig. 3a, b）胡本，F(xiàn)-like H單倍型位于該區(qū)域的開始，M-like H單倍型位于該區(qū)域的結(jié)束（Fig. 2）。該區(qū)域邊緣的基因不會(huì)按性別進(jìn)行單倍型的分類瑰艘，這進(jìn)一步支持了我們對(duì)SDR邊界的推斷（Fig. 3f; Supplementary Fig. 4）⌒婪叮總之巍耗，這些觀察結(jié)果與通過醛縮酶和TPP基因附近的重組事件而出現(xiàn)的H單倍型一致，在那里性別特異性的聚類模式發(fā)生了變化（Fig. 3e）嗜诀。

VviINP1基因上的一個(gè)INDEL在所有雌性單倍型中都是保守的

除了SNPs之外猾警，我們還分別鑒定出156個(gè)和25個(gè)小的INDELs（≤50 bp），這些小INDELs是所有F和M單倍型相對(duì)于赤霞珠H參考序列所共有的隆敢。這些INDELs中只有兩個(gè)位于外顯子區(qū)（Supplementary Data 3）：1) 第一個(gè)FMO編碼基因中的一個(gè)21bp的INDEL发皿，在H和M等位基因中引入了一個(gè)過早終止密碼子；2) 擬南芥INP1（AT4G22600）在葡萄中的同源序列上一個(gè)8bp的INDEL拂蝎，導(dǎo)致所有F等位基因移碼并引入一個(gè)提前終止的密碼子（Fig. 4a）穴墅。F單倍型上VviINP1等位基因中的一個(gè)8bp INDEL導(dǎo)致該蛋白序列被截?cái)酁?1個(gè)氨基酸（228 amino acids in H/M haplotypes）。因?yàn)樵趫A葉葡萄（M. rotundifolia）中的F單倍型中也發(fā)現(xiàn)了同樣的8 bp缺失（Fig. 4a）温自，這種F-特異性INDEL可能發(fā)生在葡萄和圓葉葡萄分化之前玄货，因此可能在葡萄中廣泛傳播。按性別類型對(duì)葡萄和圓葉葡萄的INP1蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析捣作，確定INP1等位基因的性別特異性（Fig. 4b; Supplementary Fig. 5）誉结。

Fig 4. VviINP1基因上的一個(gè)INDEL在所有雌性單倍型中都是保守的

INP1等位基因的性別特異性為估計(jì)M、F單倍型之間的分化時(shí)期和雌雄異株的潛在分化年限提供了可能券躁。我們計(jì)算了INP1的所有52對(duì)F和M等位基因之間的平均同義距離（Ds）為每個(gè)堿基0.0275個(gè)替換（95% 置信區(qū)間: 0.0258-0.0292）惩坑。假設(shè)一個(gè)世代時(shí)間為3年，每年每個(gè)堿基的核苷酸替代率為2.5 × 10^-9也拜，我們推斷以舒，M和F等位基因大約在1650萬年前分化（95% 置信區(qū)間: 15.5-17.5），這個(gè)值在葡萄屬和圓葉葡萄屬之間估計(jì)分裂時(shí)間的不確定范圍內(nèi)慢哈。

為了進(jìn)一步研究VviINP1基因的性別特異性蔓钟，設(shè)計(jì)了PCR引物擴(kuò)增該基因的INDEL特異性等位位點(diǎn)。對(duì)另外7份栽培葡萄（HF和HH基因型）和兩個(gè)更遠(yuǎn)的中亞葡萄品種卵贱，V.piasezkii（雄株滥沫；MF）和V.romanetii（雌株侣集；FF）進(jìn)行了分析。推測(cè)功能性VviINP1等位基因只存在于含有H和M單倍型的基因型中兰绣，INDEL只存在于含有F單倍型的基因型中（Fig. 4c）世分。用同樣的 PCR 標(biāo)記對(duì)兩個(gè) F₁群體進(jìn)行篩選，在Vv vinifera×?V. arizonica F₁ 群體的218個(gè)個(gè)體中缀辩，雄株102個(gè)臭埋，雌株100個(gè)，不產(chǎn)生任何花序的16個(gè)臀玄；而Vv vinifera?×?Vv sylvestris F₁群體由92個(gè)雄株瓢阴、78個(gè)雌株和8個(gè)無花序植株組成。兩個(gè) F₁群體的性狀分離均為1:1健无，與 FF × MF 雜交結(jié)果一致（χ²?=?0.02, d.f.?=?1, P value?=?0.890; χ²?=?1.15, d.f.?=?1, P value?=?0.283）荣恐。在這兩個(gè)群體中，所有具有雌花的 F₁個(gè)體都是假定無功能的 VviINP1等位基因的純合子睬涧。所有 F₁代雄花都攜帶一個(gè)VviINP1的功能拷貝和一個(gè)非功能拷貝（Supplementary Figs. 6, 7; Supplementary Data 4?5）募胃。基于全基因組測(cè)序方法對(duì)120個(gè) Vv vinifera?×?V. arizonica F₁群體的基因型進(jìn)行了重復(fù)性整體分析畦浓，證實(shí)了VviINP1基因8bp 的缺失以及SDR中的所有其他性別連鎖序列的多態(tài)性（Supplementary Fig. 8）痹束。最后，值得注意的是讶请，VviINP1的位置對(duì)應(yīng)于50份Vv vinifera（HF）材料的連鎖不平衡峰值（r2?=?0.77）（Fig. 3c）祷嘶，說明這個(gè)位點(diǎn)的重組受到抑制。

因?yàn)?em>INP1的功能性拷貝是玉米可育花粉發(fā)育所必需的夺溢，這些結(jié)果支持了8?bp缺失導(dǎo)致純合葡萄雌性不育的假設(shè)论巍，并可能是Vv sylvestris雌性花粉粒表面萌發(fā)溝缺失的原因。綜上所述风响，序列嘉汰、系統(tǒng)發(fā)育、關(guān)聯(lián)分析和功能證據(jù)表明状勤，一個(gè)包含8?bp缺失的VviINP1隱性等位基因影響雄花發(fā)育功能鞋怀，這使得VviINP1成為一個(gè)可能的雄性不育候選基因。

性別連鎖基因具有不同的表達(dá)模式

為了評(píng)估性別連鎖多態(tài)性對(duì)SDR基因調(diào)控的潛在影響持搜，我們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3 kb 區(qū)域內(nèi)尋找性別連鎖的TF結(jié)合位點(diǎn)（Fig. 3d; Supplementary Fig. 9; Supplementary Data 6）密似。在編碼含PPR蛋白VviYABBY3、醛縮酶葫盼、KASIII残腌、FMOs和VviFSEX基因的上游發(fā)現(xiàn)與M單倍型連鎖的TF結(jié)合元件。VviYABBY3啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)與M單倍型連鎖的TF結(jié)合元件與開花和花發(fā)育有關(guān)，其中包括短營(yíng)養(yǎng)期（SHORT VEGETATIVE PHASE抛猫，SVP）蟆盹，SVP 參與溫度調(diào)控開花時(shí)間，BES1-INTERACTING MYC-LIKE1（BIM1）邑滨，一種油菜素甾體信號(hào)成分日缨，參與擬南芥雄性生殖钱反。同樣掖看，我們鑒定了VviINP1、exostosin面哥、KASIII哎壳、PLATZ、FMOs尚卫、VviFSEX归榕、WRKY和VviAPT3上游F單倍型所特有的TF結(jié)合序列（Fig. 3d; Supplementary Data 6）。與此相反吱涉，所有F單倍型在VviAPT3啟動(dòng)子區(qū)附近都缺乏bHLH TFs和AGAMOUS-LIKE 3的TF結(jié)合位點(diǎn)（Supplementary Fig. 10a）刹泄。

其中一個(gè)WRKY基因，因其潛在的功能怎爵，而對(duì)性別特異性TF結(jié)合位點(diǎn)特別感興趣特石。在H和M單倍型中，WRKY啟動(dòng)子區(qū)有11個(gè)TF結(jié)合元件鳖链，而在所有的F等位基因中均不存在姆蘸。這些TF結(jié)合位點(diǎn)與影響擬南芥開花時(shí)間和發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。性別特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的顯著多樣性表明芙委，位于SDR之外的轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)SDR內(nèi)的基因進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控逞敷，這可能受到環(huán)境因素的影響。此外灌侣，單倍型間轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分布表明推捐，許多SDR上基因可能受到性別特異性的差異調(diào)控。

為了研究性別特異性調(diào)控侧啼，我們用RNA-seq定量分析雌雄同花Vv vinifera Chardonnay （HH）和雄花牛柒、雌花、Vv sylvestris DVIT3351.27（MF）和O34-16（FF）花芽的轉(zhuǎn)錄豐度慨菱。先前的研究已經(jīng)分析了 SDR 中的基因表達(dá)焰络，并比較了不同性別的花。然而符喝，這些數(shù)據(jù)是從花的早期發(fā)育階段取樣的闪彼，可能錯(cuò)過了性別決定的后期階段。因此，我們采集了花的三個(gè)發(fā)育階段: (i)生殖結(jié)構(gòu)的早期發(fā)育階段畏腕；(ii)花粉成熟前期缴川；(iii)開花期。測(cè)序reads被比對(duì)到赤霞珠基因組的兩個(gè)單倍型上并比較每個(gè)發(fā)育階段的個(gè)體之間的表達(dá)水平描馅。我們關(guān)注的是那些表現(xiàn)出性別特異性表達(dá)譜的基因把夸，例如：與雄花和兩性花相比，雌花中表達(dá)較高(或較低)的基因铭污。

在至少一個(gè)發(fā)育階段恋日，有十三個(gè)基因符合這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（Fig. 5a; Supplementary Data 7）。例如嘹狞，令我們吃驚的是岂膳，VviINP1在開花前后的雌花中的表達(dá)明顯高于雄花和兩性花（adjusted P value?≤?0.05）。同樣磅网，WRKY在雄花和兩性花中各發(fā)育階段的表達(dá)均高于雌花谈截。三個(gè)基因僅在一個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)差異表達(dá): TPP，aldolase and beta-fructofuranosidase （BFRUCT）（Fig. 5a）涧偷。兩個(gè)基因在雄花中兩個(gè)或兩個(gè)以上發(fā)育階段表達(dá)增強(qiáng): VviAPT3在雄花三個(gè)發(fā)育階段表達(dá)增強(qiáng)簸喂，VviYABBY3在后兩個(gè)發(fā)育階段表達(dá)更高。VviAPT的結(jié)果與先前的研究一致燎潮，即高VviAPT3轉(zhuǎn)錄本豐度是Vv sylvestris雄花的心皮原基所特有的喻鳄，這表明VviAPT3在心皮敗育中起作用（Supplementary Fig. 10b）。值得注意的是跟啤，VviAPT3在雄花中的高表達(dá)在H和M單倍型等位基因是特異的诽表，而F等位基因在不同性別類型中的表達(dá)在各個(gè)發(fā)育階段都不斷降低（Supplementary Fig. 10b, c）。這表明M和H單倍型中隅肥，VviAPT3等位基因的表達(dá)水平或劑量可能影響性別決定竿奏。對(duì)于VviYABBY3，我們還通過將RNA-Seq的reads比對(duì)到DVIT3351.27參考基因組上腥放，證實(shí)了相對(duì)于F等位基因泛啸，雄性花中M等位基因的高表達(dá)是特異的（Supplementary Data 8）。鑒于VviYABBY3中的序列多態(tài)性與M單倍型是完全連鎖的（Fig. 3a）秃症，且該基因位于赤霞珠H單倍型的一部分候址，類似F單倍型（Fig. 2d），推測(cè)VviYABBY3的M等位基因可能與雌性不育有關(guān)种柑。

Fig 5. 性別連鎖基因具有不同的表達(dá)模式

差異表達(dá)的 SDR 基因包括 TFs 和與激素信號(hào)相關(guān)的基因岗仑，這些基因可能在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為了評(píng)估性別連鎖基因和其他基因組中可能影響發(fā)育的基因之間的關(guān)系聚请，我們進(jìn)行了跨發(fā)育階段的加權(quán)基因共同表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）（Supplementary Data 9）荠雕。六組共表達(dá)基因（共6830個(gè)基因）與三種性別表型之一呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)（|Pearson correlation|?>?0.9稳其，P value?<?8e-11; Supplementary Fig. 11）。例如炸卑，1176個(gè)共表達(dá)基因的洋紅模數(shù)與雄性表型有關(guān)（Pearson correlation?=?0.97既鞠；P value?=?2e-16）。這個(gè)模塊在SDR區(qū)包含兩個(gè)基因盖文，分別編碼PPR-containing protein and VviAPT3嘱蛋。該模塊還包括與激素信號(hào)相關(guān)的基因，如與AtUGT85A1和AtUGT85A3同源的2個(gè)尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）五续，它們可能參與活躍的細(xì)胞分裂素穩(wěn)態(tài)洒敏。WRKY的表達(dá)位于紅色模塊（1512 genes；Fig. 5c）的中心（即高度相關(guān)）返帕，與雌性性別決定呈負(fù)相關(guān)（Pearson correlation?=?-0.92桐玻；P value?=?6e-12）。該模塊包括一個(gè)對(duì)花器官發(fā)育必不可少的MADS-box基因荆萤，它是擬南芥SEPALLATA1 （SEP1；AT5G15800）的同源序列铣卡×淳拢總之，這些數(shù)據(jù)表明煮落，性別連鎖多態(tài)性影響某些SDR基因的調(diào)控敞峭，而且其中一些基因在參與性別決定和其他發(fā)育過程的共表達(dá)模塊中高度相關(guān)。

Discussion

葡萄中的雌雄異株是很有趣的蝉仇，因?yàn)槠咸烟偈巧贁?shù)古老的雌雄異株植物之一旋讹，在馴化過程中恢復(fù)為雌雄同體。從結(jié)構(gòu)上看轿衔，野生葡萄有完整的花（Fig. 1a, b）沉迹，但雄花和雌花分別缺少功能性雌蕊和花粉。正如對(duì)大多數(shù)被子植物所推測(cè)的那樣害驹，這些野生葡萄花很可能起源于雌雄同體的祖先鞭呕，雌雄異株是由獨(dú)立的、連續(xù)的雄性不育和雌性不育突變引起的宛官。在雙基因座模型下葫松，第一步是隱性雄性不育突變的進(jìn)化，第二步是顯性雌性不育突變的形成底洗。

通過將Vitis-SD單倍型映射到赤霞珠的H參考序列上腋么，我們發(fā)現(xiàn)了不同的M連鎖和F連鎖多態(tài)性模式。M連鎖多態(tài)性發(fā)生在從PPR蛋白啟動(dòng)子到TPP基因的5′區(qū)亥揖。相比之下珊擂，F(xiàn)連鎖多態(tài)性從TPP到VviAPT3（Fig. 6a）。在雌雄異株起源的雙位點(diǎn)模式下，顯性雌性不育等位基因可能是M單倍型所獨(dú)有的未玻，因此位于M單倍型與F和H單倍型不同的區(qū)域灾而。這縮小了在M連鎖多態(tài)性升高區(qū)域?qū)ふ掖菩圆挥稽c(diǎn)的范圍（Fig.3a–e）。值得注意的是扳剿，與M連鎖的SNPs聚集在VviYABBY3附近旁趟，VviYABBY3蛋白序列清楚地區(qū)分了M與F和H單倍型（Fig. 3f）。此外庇绽，VviYABBY3還含有兩個(gè)M-特異性TF結(jié)合位點(diǎn)锡搜，在花發(fā)育過程中表現(xiàn)出M-連鎖基因表達(dá)模式（Fig. 5a）。因此瞧掺，我們推測(cè)耕餐，向雌雄異株轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟之一，要么是由VviYABBY3蛋白的氨基酸變化和/或VviYABBY3基因的上調(diào)引起的辟狈，從而在雄花中導(dǎo)致雌性不育肠缔。關(guān)于YABBY基因家族的功能信息與這一假說是一致的。在擬南芥中哼转，YABBY基因參與了植物花器官和側(cè)生器官的發(fā)育明未，尤其是心皮和胚珠外珠被的發(fā)育。雖然VviYABBY3還沒有被闡釋壹蔓，但V. pseudoreticulata VpYABBY1和VpYABBY2在擬南芥中的表達(dá)（以及VvYABBY4在番茄中的表達(dá)）暗示了這些基因在葉和心皮發(fā)育中的作用趟妥。

Fig 6. 葡萄性別決定的進(jìn)化模型

類似地，F(xiàn)連鎖多態(tài)性定義了SDR的一個(gè)區(qū)域佣蓉，該區(qū)域可能存在假設(shè)的隱性雄性不育突變披摄。從TPP到VviAPT3，SDR的后一部分存在F連鎖多態(tài)性（Figs. 3 and 6a）勇凭。在該區(qū)域的基因中疚膊，WRKY和VviINP1是最值得注意的。與雄花相比套像，WRKY基因在雌花中的表達(dá)較差（Fig. 5a）酿联，并且是與雌花性別決定呈負(fù)相關(guān)的共表達(dá)模塊中的一部分（Fig. 5c），因此從理論上講夺巩，WRKY的表達(dá)可能導(dǎo)致雄性不育贞让。然而，在我們看來柳譬，VviINP1基因中的8bp缺失才是導(dǎo)致雄性不育的最可能原因（Fig. 4a）喳张。這種純合子缺失導(dǎo)致的整個(gè)葡萄屬F等位基因移碼和密碼子的提前終止（Fig. 4c），表明其在葡萄種植史中一直保持著美澳。INP1參與了葡萄和玉米花粉孔形成销部，葡萄功能缺失突變可能解釋了雄性不育花粉的形成摸航。所有F1代雄性至少含有一個(gè)VviINP1功能基因（Fig. 4c; Supplementary Figs. 6 and 7），這表明如果VviINP1中的8bp缺失導(dǎo)致雄性不育舅桩，那么其則為隱形等位基因酱虎。特別是考慮到我們的假設(shè)，即缺失事件使VviINP1蛋白的F等位基因失去功能擂涛，但為什么VviINP1在雌花中的表達(dá)更高读串，目前尚不清楚（Fig. 5a）。一種可能是高表達(dá)構(gòu)成了一種補(bǔ)償效應(yīng)撒妈，類似于CRISPR基因敲除的報(bào)道恢暖。鑒于我們假設(shè)VviINP1缺失導(dǎo)致雄性不育，未來的一個(gè)重要步驟將是功能驗(yàn)證狰右，將純合子缺失改造成雌雄同體產(chǎn)生雌性花杰捂。

與VviINP1一樣，VviINP3位于SDR的后一部分棋蚌，并且具有F連鎖多態(tài)性嫁佳，因此其位置可能在雄性不育中發(fā)揮了作用。然而附鸽，VviAPT3在雄花中表達(dá)較高脱拼，其共表達(dá)模式與雄花性別有關(guān)。這些結(jié)果與Coito等人描述的基因表達(dá)模式一致坷备。這些數(shù)據(jù)表明VviAPT3參與了花的發(fā)育和性別決定，但它的作用機(jī)制使復(fù)雜的情臭，需要進(jìn)一步的研究來充分理解省撑。

據(jù)推測(cè)，M和F單倍型之間的重組導(dǎo)致H單倍型的還原俯在。若干證據(jù)支持H單倍型產(chǎn)生于一個(gè)重組事件的假設(shè)竟秫，包括它們與SDR第一部分的F個(gè)單倍型和SDR后一部分的M個(gè)單倍型的中間長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和序列的相似性（Fig. 6a）跷乐。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)肥败，我們也可以定位假設(shè)的重組事件。系統(tǒng)發(fā)育證據(jù)表明愕提，醛縮酶與TPP基因發(fā)生重組馒稍，多態(tài)性信息表明TPP基因可能發(fā)生重組，因?yàn)樵摶蛐蛄邪琈-連鎖和F-連鎖的非同義SNPs（Figs. 3a–f, 6b）浅侨。然而纽谒，我們注意到，有證據(jù)表明H單倍型在馴化的葡萄中起源不止一次如输，著表明H單倍型中可能存在不同的重組斷點(diǎn)鼓黔。

最后央勒，我們還提出了一個(gè)關(guān)于重組的問題：如果F和M等位基因可以重組，那么是什么讓這兩個(gè)單倍型保持了這么長(zhǎng)時(shí)間的不同?既然自該屬起源以來澳化，雌雄異株就一直在野外存在崔步。這是一個(gè)特別重要的問題，因?yàn)楸蛔又参镏写菩郛愔晗∩偈怯捎诤苋菀谆謴?fù)到雌雄同體缎谷。我們推測(cè)M和F單倍型之間的重組是由葡萄屬SDR的至少三個(gè)特征決定的井濒。首先，性別決定基因的緊密聯(lián)系可能僅僅反映了生理上的親密關(guān)系慎陵。如果我們關(guān)于VviYABBY3和 VviINP1是不育基因的假設(shè)是正確的眼虱，那么重組事件必須發(fā)生在< 100kb席纽，這樣就可以將這兩個(gè)基因分開润梯，從而產(chǎn)生H單倍型。其次扫倡，并不是所有的重組活動(dòng)在自然界中都是成功的：只有50%正確的重組體會(huì)成為雌雄同株（Fig. 6b）锥累，而且可能會(huì)有與雌雄同株相關(guān)的適應(yīng)性代價(jià)语淘。最后蹬挺，我們推測(cè)M和F單倍型在結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度上的差異主要是由TE在基因間空間的積累造成的溯泣，限制了重組客给，因?yàn)榈任换蜷gTE含量的差異會(huì)減緩重組的速度池充。在這種情況下，M. rotundifolia的倒位作用相對(duì)于F單倍型中57%的M單倍型，可能是一種特別有效的威懾设凹，因?yàn)榈刮豢赡苁侵亟M的障礙钻洒。我們懷疑這三個(gè)特征導(dǎo)致了野生葡萄雌雄同體的明顯缺失航唆。

補(bǔ)充

關(guān)于泛基因組及基因組組裝退腥，近期在NG上發(fā)表的兩篇文章與本文有點(diǎn)類似，一篇來自黃三文團(tuán)隊(duì)疾就，該研究首次完成了雜合二倍體馬鈴薯的單倍體型組裝猜敢，獲得了兩套染色體的基因組序列鼠冕，并在此基礎(chǔ)上揭示了雜合基因組內(nèi)豐富的序列變異陨闹、等位基因表達(dá)差異、甲基化修飾差異以及有害突變的分布模式乡数。另一篇來自康奈爾大學(xué)Boyce Thompson Institute費(fèi)章君團(tuán)隊(duì)，該研究通過三代基因組測(cè)序手段對(duì)栽培蘋果 (Malus domestica cv. Gala)及其兩個(gè)主要的祖先種野生蘋果(M. sieversii 和 M. sylvestris)進(jìn)行基因組測(cè)序和組裝玖翅，同時(shí)對(duì)91個(gè)蘋果種質(zhì)進(jìn)行泛基因組研究翼馆，全面系統(tǒng)地解析了蘋果的起源、馴化歷程和遺傳學(xué)基礎(chǔ)金度。兩篇文章均涉及到雜合二倍體基因組的組裝应媚，均采用了Pacific Bioscience Sequel II platform平臺(tái)的HIFI模式〔录基于不同的單倍型中姜，結(jié)合單核苷酸多態(tài)性（SNPs）及結(jié)構(gòu)變異將長(zhǎng)測(cè)序讀長(zhǎng)拆分，然后分別組裝成contigs跟伏，再結(jié)合其他輔助手段掛載丢胚。

Haplotype-resolved genome analyses of a heterozygous diploid potato
Sun, X., Jiao, C., Schwaninger, H. et al. Phased diploid genome assemblies and pan-genomes provide insights into the genetic history of apple domestication. Nat Genet (2020). https://doi.org/10.1038/s41588-020-00723-9
Phased diploid genome assemblies and pan-genomes provide insights into the genetic history of apple domestication
Zhou, Q., Tang, D., Huang, W. et al. Haplotype-resolved genome analyses of a heterozygous diploid potato. Nat Genet 52, 1018–1023 (2020). https://doi.org/10.1038/s41588-020-0699-x