引物設(shè)計是PCR成功與否的關(guān)鍵因素之一。目前已經(jīng)發(fā)表了上百種引物設(shè)計的軟件蒲列，該如何選擇這些PCR引物設(shè)計軟件呢？此前《Bioinformatics》發(fā)表了一篇題為“Classification and review of free PCR primer design software”的綜述文章组底，對目前可用的免費(fèi)PCR引物設(shè)計軟件進(jìn)行分類和回顧性總結(jié)糜工。
Primer3
考慮到本文總結(jié)的軟件有一半以上是基于Primer3，所以把Primer3本身歸為一個類別鬼悠。這個開源軟件在20世紀(jì)90年代末的發(fā)布可以被認(rèn)為是一個里程碑式的事件删性。Primer3的獨(dú)特之處在于它為PCR引物設(shè)計提供了第一個免費(fèi)、可靠和通用的工具焕窝。為了滿足不同應(yīng)用的需要蹬挺，Primer3的設(shè)計提供了許多選項來控制引物的位置、大小它掂、GC含量巴帮、Tm和產(chǎn)物大小。其經(jīng)歷過兩次重大修訂，結(jié)合其他生物信息學(xué)工具榕茧，Primer3可用于本文討論的所有PCR應(yīng)用垃沦。
Sanger sequencing
PCR的一個應(yīng)用是產(chǎn)生Sanger測序所需的大量DNA模板。為了克服Sanger測序技術(shù)帶來的有限讀長雪猪，這一類的所有軟件都設(shè)計了引物對栏尚，以產(chǎn)生一個擴(kuò)增子組覆蓋指定的目標(biāo)區(qū)域。PrimerZ可根據(jù)基因名稱或Ensembl登錄號只恨，為基因的外顯子和啟動子設(shè)計重疊引物译仗；JCVI primer designer允許研究者指定任意的基因組區(qū)域；ExonPrimer（未發(fā)表）需要cDNA和相應(yīng)的基因組序列作為輸入官觅，將這些序列對齊并設(shè)計PCR引物來擴(kuò)增每個外顯子纵菌；MPDP3（未發(fā)表）將序列作為輸入，并設(shè)計具有自定義長度的引物對休涤；ConservedPrimers 2.0通過將EST與進(jìn)化相關(guān)的參考基因組對齊來設(shè)計內(nèi)含子克隆引物咱圆；PrimerDesign-M針對高度可變的基因組（如HIV序列），基于多重序列比對功氨，在保守區(qū)設(shè)計測序引物序苏。
RT-qPCR
RT-qPCR的主要功能是測量基因表達(dá)水平。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)捷凄，最好是擴(kuò)增從mRNA產(chǎn)生的cDNA忱详，而不是從被污染的基因組DNA模板上擴(kuò)增。引物對的選擇應(yīng)使其中一個引物與基因組水平上不存在的外顯子-外顯子邊界序列相匹配跺涤⌒僬觯或者，在設(shè)計引物對時桶错，應(yīng)將每個引物放在不同的外顯子中航唆，這樣基于基因組序列的產(chǎn)物將包括一個長的內(nèi)含子序列。Autoprime院刁，Quantprime和Primer-BLAST是為自動設(shè)計擴(kuò)增cDNA但不擴(kuò)增基因組DNA模板的PCR引物而定制的糯钙。此外，Primer-BLAST避免了引物中的單核苷酸多態(tài)性黎比。
SNP detection
SNP可以通過引物引入限制性分析（PIRA）PCR或四引物擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)（ARMS）PCR檢測超营。PIRA PCR designer（即PCR designer）搜索所有可能產(chǎn)生人工限制位點(diǎn)的錯配，并使用它們設(shè)計引物阅虫。除了SNP檢測演闭，PCR designer還可以檢測缺失和插入；PRIMER1是專為ARMS PCR開發(fā)的颓帝，它允許用戶輸入目標(biāo)DNA序列米碰，指定多態(tài)性位點(diǎn)并定義引物和產(chǎn)物大小的標(biāo)準(zhǔn)窝革。
Splicing variant detection
高等真核生物中的大多數(shù)多外顯子基因是選擇性剪接的，這在基因功能和病理過程中具有重要意義吕座。為了研究這一現(xiàn)象虐译，PCR被應(yīng)用于外顯子剪接事件的檢測和定量。RASE定義了特定擴(kuò)增剪接異構(gòu)體的引物設(shè)計規(guī)則吴趴，并將其整合到RASE自動流程中漆诽；PRIMEGENS-V2還通過設(shè)計引物對提供幫助，這些引物對可以在存在同源和剪接變異的情況下锣枝，獨(dú)特地放大單個目標(biāo)基因厢拭。?此外，該軟件設(shè)計了多重引物對撇叁，可以放大所有剪接和復(fù)制基因模型的變異供鸠；PrimerSeq通過在設(shè)計過程中加入用戶提供的轉(zhuǎn)錄組配置文件，使其與上述軟件程序不同陨闹。PrimerSeq利用用戶提供的RNA-seq數(shù)據(jù)來定義剪接模式楞捂，以選擇放置RT-PCR引物所需的合適區(qū)域。
Methylation detection
胞嘧啶甲基化是調(diào)節(jié)基因組功能的重要機(jī)制趋厉。檢測甲基化模式已成為了解基因表達(dá)調(diào)控和診斷甲基化相關(guān)疾病的重要手段寨闹。植物在CG、CHG和CHH位點(diǎn)存在胞嘧啶甲基化君账，而CG甲基化是哺乳動物中唯一存在的形式鼻忠。基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的PCR方法是甲基化檢測的常用技術(shù)杈绸，如BS-PCR、MS-PCR矮瘟、COBRA和MSRE-PCR等瞳脓。MethPrimer預(yù)測CG島并設(shè)計用于BS-PCR和MS-PCR的引物；BiSearch設(shè)計了BS-PCR引物澈侠，同時避免了亞硫酸氫鹽處理基因組的錯誤引物劫侧；Bisprimer主要是為在植物中進(jìn)行BS-PCR的研究人員設(shè)計的，但它也可用于哺乳動物樣品或其他只有CG甲基化的樣品哨啃；與其他工具不同烧栋，MSP-HTPrimer在設(shè)計甲基化檢測引物對時考慮了全基因組的SNP和重復(fù)注釋。MSP-HTPrimer能為BS-PCR拳球、MS-PCR审姓、COBRA和MSRE-PCR分析設(shè)計引物。
Microsatellite detection
微衛(wèi)星是常用的分子標(biāo)記祝峻，因為它們的高度多態(tài)性可以作為唯一的識別符魔吐。MSATCOMMANDER使用正則表達(dá)式模式匹配來定位微衛(wèi)星并設(shè)計引物扎筒，它允許在其5'端進(jìn)行引物標(biāo)記；WebSat允許序列提交酬姆、微衛(wèi)星可視化并設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增嗜桌；QDD被設(shè)計用來處理所有的設(shè)計步驟，從大量的原始序列開始到定位和設(shè)計用于微衛(wèi)星擴(kuò)增的PCR引物辞色。
Conserved/degenerate primers
在理想情況下骨宠，設(shè)計PCR引物以擴(kuò)增所有包含微小變異的模板只需識別保守/相同區(qū)域并從這些保守區(qū)域中選擇非簡并引物。然而相满，當(dāng)模板變異程度增加時层亿，保守區(qū)域可能變得過于碎片化，無法設(shè)計非簡并引物雳灵。在這種情況下棕所，必須使用簡并引物。GeneFisher2和PriFi目的是利用不同生物的同源基因進(jìn)行多重比對悯辙，分離目標(biāo)生物中的基因琳省。與此相反，HYDEN是為了破譯基因家族而開發(fā)的躲撰；Amplicon具有圖形交互界面针贬，允許用戶從多個序列校準(zhǔn)文件中查看、編輯和選擇序列拢蛋；Primaclade和PrimerIdent獲取一個alignment文件桦他，以查找alignment中每個序列的所有引物集；相比之下Gemi和easyPAC取一個alignment文件來構(gòu)建一個一致序列谆棱，然后從這個序列中搜索引物和探針快压。此外，easyPAC還可以選擇將設(shè)計的簡并引物映射到任意數(shù)量的參考文件或可能包含同源基因的整個基因組垃瞧；最后要提到的一個軟件程序是TOPSI蔫劣，它設(shè)計了一種細(xì)菌的多個菌株專門共享的實時PCR引物，用于病原體檢測个从。
Multiplex PCR and?targeted next generation sequencing
多重PCR是一種有效的方法脉幢，通過同時擴(kuò)增節(jié)省時間和DNA樣本。然而嗦锐，在為多重PCR設(shè)計引物時嫌松，還需要考慮其他標(biāo)準(zhǔn)，這包括避免引物二聚化和所有引物之間匹配的引物熔解溫度奕污。MuPlex是基于引物延伸技術(shù)為SNP基因分型而開發(fā)的萎羔；MultiPLX計算現(xiàn)有PCR引物的相容性評分，并對多重PCR引物進(jìn)行分組碳默；Oli2go將多個序列作為輸入外驱，為所有序列設(shè)計多重引物和探針育灸，其特異性檢查不僅限于單個物種，而且可以在多種物種上進(jìn)行昵宇；MPprimer和PrimerStation設(shè)計多重引物組磅崭，其擴(kuò)增子的大小不同，以便通過電泳分離瓦哎；MCMC-ODPR采用Markov chain Monte Carlo優(yōu)化方法砸喻，圍繞單核苷酸多態(tài)性設(shè)計多重簡并引物，注重引物的可重復(fù)使用性蒋譬，以降低成本割岛。
在研究與性狀或疾病相關(guān)的有限基因組區(qū)域時，Targeted NGS是首選技術(shù)犯助。有兩個專門為TargetedNGS開發(fā)的多重PCR軟件程序癣漆。MPD接受文件中的基因組坐標(biāo)列表，并自動設(shè)計多重PCR引物剂买，同時避免將引物放在已知變異的位點(diǎn)上惠爽；Optimus Primer接受基因組坐標(biāo)列表或基因列表。它自動設(shè)計引物來擴(kuò)增不同的基因亞型和外顯子瞬哼。它還分割大的外顯子以保持所需的擴(kuò)增子大小婚肆。MPD和Optimus Primer都將引物匯集成兼容組，以促進(jìn)多重PCR坐慰。
Multifunctional software
PerlPrimer：在輸入序列中找到開放閱讀框(ORF)较性，圍繞ORF設(shè)計引物，并允許用戶在每個引物上附加額外的5'序列以用于克隆目的结胀；(ii) 發(fā)現(xiàn)CG島并設(shè)計MS-PCR引物赞咙；(iii) 找到內(nèi)含子/外顯子邊界并設(shè)計RT-qPCR引物；(iv) 設(shè)計用于Sanger測序的引物糟港。
The PCR Suite：設(shè)計Sanger測序引物人弓，并設(shè)計包含(i) SNP；(ii)?單個基因的所有外顯子着逐；(iii) cDNA列表中的所有ORF的引物。
BatchPrimer3：(i)?發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星并設(shè)計微衛(wèi)星側(cè)翼引物意蛀；(ii)?設(shè)計用于SNP基因分型的單堿基延伸耸别、等位基因特異性和tetra-primer ARMS PCR引物。
jPCR：設(shè)計(i)?多重PCR引物县钥；(ii)?保守區(qū)/簡并引物秀姐；(iii)?合成包含目標(biāo)序列的連續(xù)片段的引物（重疊延伸PCR）；(iv)?圍繞微衛(wèi)星的引物若贮。
Primo：設(shè)計(i) 基于單個蛋白質(zhì)或多個蛋白質(zhì)或核苷酸的保守區(qū)/簡并引物省有；(ii) 多個引物對痒留，每個引物特異性地擴(kuò)增一個家族中的一個基因；(iii) 幾個簡并引物蠢沿，用于擴(kuò)增一組數(shù)百或數(shù)千個基因中的大多數(shù)基因伸头。目的是讓用戶只用幾個PCR反應(yīng)就能對選定的一組基因進(jìn)行基因表達(dá)分析；(iv)?用于克隆基因以進(jìn)行表達(dá)研究的引物舷蟀；(v) 多重PCR引物恤磷；(vi)?用于定點(diǎn)突變的引物；(vii) MS-PCR和BS-PCR引物野宜。
Niche applications
除了用于普通PCR應(yīng)用的軟件外扫步，還有一些為特定應(yīng)用而設(shè)計的程序。RJPrimers發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座因子連接點(diǎn)（基因組中的獨(dú)特位點(diǎn)）并設(shè)計獨(dú)特的引物匈子；PrimerX（未發(fā)表）設(shè)計用于定點(diǎn)突變的引物河胎；AcePrimer專門為秀麗隱桿線蟲設(shè)計引物；PrecisePrimer設(shè)計用于分子克隆的引物虎敦，包括基于限制性內(nèi)切酶游岳、GoldenGate、Gibson和非連接性克略吭历；MultiMPrimer3從微生物中發(fā)現(xiàn)物種特異性重復(fù)序列，并自動為這些重復(fù)序列設(shè)計物種特異性PCR引物擂橘，以提高病原體診斷的敏感性晌区；AmplifX（未發(fā)表）除了基本的引物設(shè)計功能外，還用一個數(shù)據(jù)庫管理引物通贞。
本文中提到軟件的下載信息：https://pcrprimerdesign.github.io/
特別說明
> 如下軟件不在本文的總結(jié)范圍中：商業(yè)公司提供的免費(fèi)軟件（如PrimerQuest）朗若；引物數(shù)據(jù)庫匯編以前使用的引物；僅制備PCR模板或檢查引物質(zhì)量或特異性的軟件（如UCSC In-Silico PCR）昌罩；僅用于植物PCR的軟件哭懈；用于芯片引物設(shè)計的軟件。
> 本文發(fā)表于2020年10月茎用，如有未納入的軟件歡迎在留言區(qū)分享遣总。
首發(fā)公號：國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺
參考文獻(xiàn)
Guo J, Starr D, Guo H. Classification and review of free PCR primer design software[J]. Bioinformatics, 2020, 36(22-23): 5263-5268.?
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