一床佳、細胞培養(yǎng)支原體污染來源及主要支原體種類

支原體（Mycoplasma）是一種大小介于細菌和病毒之間（0.1 - 0.6μm）赃梧，沒有細胞壁玫坛、并獨立生活原核生物到千，形態(tài)呈高度多形性，呈圓形齐邦、絲狀或梨形椎侠。由于支原體直徑較小，進行除菌過濾是措拇，約1%的支原體可以直接穿過常規(guī)的0.22μm的微孔除菌濾膜我纪，造成細胞的支原體污染。支原體污染的來源包括：（1）工作環(huán)境的污染丐吓，實驗器材帶來的污染浅悉；（2）操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）；（3）已受污染的培養(yǎng)基券犁、血清术健，或用來制備細胞的原始組織或器官的污染；（4）污染支原體的細胞造成的交叉污染粘衬。

?目前荞估，已發(fā)現(xiàn)的支原體品種有100多種咳促，但根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大約有二十多種支原體能污染細胞勘伺，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體跪腹。以下13種支原體污染在全部支原體污染中所占比例超過99%。（1）M. orale飞醉、（2）M.Arginini冲茸、（3）M.Hyorhinis、（4）A.Laidlawii缅帘、（5）M.Fermentans噪裕、（6）M. salivarium、（7）M.pirum股毫、（8）M. hominis膳音、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis铃诬、（11）M. buccale祭陷、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis趣席。其中尤其是前四種：M.orale（口腔支原體）兵志、M.arginini（精氨酸支原體）、M.hyorhinis（豬鼻支原體）和A.laidlawii（萊氏無膽甾原體）所占污染比例超過95%宣肚，前8種占比超過98%想罕。

二、支原體污染對細胞培養(yǎng)的危害

1霉涨、支原體污染的普遍性

支原體污染是細胞培養(yǎng)領(lǐng)域遇到的性問題按价，據(jù)文獻報道，綜合美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）笙瑟、美國模式菌種收集中心(ATCC)等機構(gòu)收到的相關(guān)數(shù)據(jù)楼镐，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。該數(shù)據(jù)未統(tǒng)計中國大陸的數(shù)據(jù)往枷，但可以確定框产，大陸地區(qū)的支原體污染比例與此相當(dāng)，或更嚴重错洁。

表1.部分國家及機構(gòu)細胞系污染數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Cell?LineUSA-ATCCUSA-FDAGermany-DSMArgentinaJapan-IFO

Rate14%15%15%65%80%

2秉宿、支原體污染的危害

根據(jù)已發(fā)表的支原體污染研究文獻，支原體污染細胞后屯碴，幾乎能影響每一個細胞參數(shù)描睦。

（1）支原體污染可能導(dǎo)致細胞染色體的異常和損傷，改變細胞的代謝窿锉、生長酌摇、形狀膝舅、附著嗡载。

（2）支原體影響被污染細胞的基因表達窑多。相關(guān)研究表明，支原體污染的細胞系與對照組比較洼滚，有多達200個基因表達差異達2倍以上埂息。

（3）導(dǎo)致MTT等細胞毒性實驗結(jié)果嚴重錯誤。支原體對MTT有額外還原作用遥巴。

（4）支原體污染能耗盡營養(yǎng)物千康，促進代謝積累，重度支原體污染導(dǎo)致pH改變铲掐。

（5）誘導(dǎo)或抑制細胞因子表達拾弃，并改變培養(yǎng)細胞的代謝、增殖特征及形態(tài)摆霉。支原體污染可以直接影響L-arginine的代謝

（6）支原體污染可以誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟豪椿，這對于開展人體免疫細胞的腫瘤治療的影響將是災(zāi)難性的。

3携栋、支原體污染的隱蔽性

? 原體大小約0.1 - 0.6微米搭盾，體積比病毒稍大，輕度到中度的支原體污染不會明顯改變細胞培養(yǎng)液的渾濁度和pH值婉支，也不會導(dǎo)致細胞形態(tài)或生長速度的明顯改變鸯隅，所以科研人員很難及時發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的細胞已經(jīng)被支原體污染，進而改變了基因表達譜向挖，顯示虛假的實驗數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果蝌以。通常情況下，如果不排除支原體污染因素何之，很多實驗結(jié)果往往缺乏說服力饼灿。2013年，*期刊《Nature》明確要求帝美，在涉及細胞培養(yǎng)的科研工作中碍彭，必須進行支原體檢測，并排除其影響悼潭。

三庇忌、支原體污染檢測

1、支原體檢測方法概述

支原體污染嚴重干擾細胞實驗結(jié)果舰褪，檢測有無支原體污染的方法較多皆疹，可以根據(jù)自身實驗室條件、檢測方法便捷性等作出選擇占拍。

①電子顯微鏡略就，相差顯微境觀察捎迫。用掃描電鏡或透射電鏡，直觀觀察支原體形態(tài)表牢≌蓿或者在細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)置蓋玻片，接種細胞在蓋玻片上崔兴，培養(yǎng)24小時后取出用油鏡觀察彰导。如有支原體，因支原體與細胞在不同平面敲茄，可發(fā)現(xiàn)支原體呈現(xiàn)暗色顆粒裝位谋。缺點：設(shè)備要求嚴格，檢測成本高堰燎，不適合普通實驗室日常常規(guī)檢測掏父。

③DNA熒光染色法，利用支原體沒有細胞膜（壁）的特性秆剪，用熒光染料Hoechst 33258染色赊淑， Hoechst 33258能與支原體DNA結(jié)合著色，在熒光顯微鏡下觀察鸟款，呈現(xiàn)綠色小點膏燃。缺點：靈敏度太低，當(dāng)檢測成陽性時何什，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染组哩。?

④培養(yǎng)法，用支原體培養(yǎng)基大量增殖支原體处渣，是相對可靠的支原體檢測技術(shù)伶贰。缺點：耗時長，需要數(shù)周時間才能得到結(jié)果罐栈，不適合作為細胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測黍衙。此外，該方法不能檢測豬鼻支原體荠诬，因為豬鼻支原體不能在固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落琅翻，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%。

⑤PCR法柑贞，提取細胞培養(yǎng)液方椎，提取支原體，制備樣品钧嘶，根據(jù)支原體高度保守的16SrRNA序列設(shè)計引物（避免真核細胞或細菌DNA干擾）棠众，設(shè)置陰性，陽性對照有决，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像觀察闸拿，可識別已發(fā)現(xiàn)的幾乎全部100余種支原體空盼。

⑥Quick Cell快速檢測法，拓撲酶環(huán)化支原體DNA新荤，在根據(jù)高保守區(qū)設(shè)計的引物引導(dǎo)下揽趾，采用特殊等溫DNA擴增酶，61℃條件下迟隅，連續(xù)滾環(huán)式擴增支原體DNA 60分鐘但骨，根據(jù)有無支原體污染励七，隨著擴增進程可目視實驗結(jié)果智袭。

⑦化學(xué)發(fā)光法，裂解支原體后掠抬，有底物情況下吼野，支原體特異性的酶，能將ADP轉(zhuǎn)化成ATP两波。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的過程瞳步，所以可以通過催化底物熒光素導(dǎo)致的生物發(fā)光（Bioluminescence）信號來判別支原體DNA存在與否。

綜上所述腰奋，在多種支原體檢測方法中单起，受實驗條件、實驗時長劣坊、便捷性等因素限制嘀倒，①-④僅在很少情況下得到應(yīng)用。實際科研工作中局冰，應(yīng)用的是⑤?PCR支原體檢測法测蘑；⑥Quick Cell快速支原體檢測法；⑦化學(xué)發(fā)光支原體檢測法康二。

2碳胳、幾種zui常用支原體檢測方法比較

檢測方法Quick Cell快速檢測法化學(xué)發(fā)光法PCR法

檢測原理環(huán)化DNA等溫連續(xù)擴增支原體特異性酶檢測根據(jù)支原體DNA序列設(shè)計引物進行PCR擴增

實驗條件恒溫水浴或PCR儀-80℃超低溫冰箱，多功能酶標儀或發(fā)光檢測儀常規(guī)PCR儀沫勿，電泳儀挨约，成像系統(tǒng)

靈敏度比PCR法高1-2個數(shù)量級與PCR法相當(dāng)較靈敏

檢測時長1小時25分鐘2-3小時

定性/定量定性定性，半定量定性产雹，半定量

污染假陽性率低低高

引物假陽性率零零高

樣品制備直接取上清诫惭，不需制備需要樣品制備離心

檢出正確率>99%>99.9%>80%

綜合評價1）簡便、快速洽故，任何實驗室均可操作贝攒；2）擴增不受細胞代謝產(chǎn)物影響，高準確率1）快速时甚，準確隘弊；2）有特定設(shè)備要求哈踱，物流儲存條件高。1）較高的檢出準確率梨熙；2）PCR反應(yīng)易受培養(yǎng)基成分抑制开镣，產(chǎn)生假陰性；3）需制備樣品咽扇。

代表性產(chǎn)品Quick Cell 快速支原體檢測（李記生物, CAT:C4056L1060）

*本產(chǎn)品由細胞專家李記生物*研發(fā)

Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測試劑盒（李記生物,CAT:C4056L1065）

MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit?(Lonza, CAT: LT07-710)

Quick Cell 支原體PCR檢測試劑盒（李記生物,貨號:?C4056L1062）

Lookout?Mycoplasma Detection Kit.（Sigma貨號:MP0035）

3邪财、支原體檢測策略及方法選擇

①單個方法獨立檢測支原體（正確檢出率80%-99.9%）

就單個檢測方法及原理而言，“化學(xué)發(fā)光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%）质欲，用時zui短树埠，應(yīng)為方法∷晃埃可選產(chǎn)品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit?(CAT:C4056L1065怎憋，價格：約9800元/100次），或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測試劑盒（CAT:C4056L1065九昧，價格：1250元/50次）”绊袋。

若受實驗室條件所限沒有配備化學(xué)發(fā)光檢測儀，或多功能酶標儀铸鹰，建議選擇“Quick Cell快速檢測法”癌别，該方法1小時出結(jié)果，避免了PCR法因細胞代謝產(chǎn)物抑制PCR反應(yīng)導(dǎo)致的假陰性出現(xiàn)蹋笼，正確檢出率大于99%展姐，對設(shè)備幾乎無要求，可目測結(jié)果姓建。產(chǎn)品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（CAT:C4056L1060诞仓，價格：1250元/50次）”。

②多原理支原體檢測策略

市場在售的所有支原體檢測試劑盒速兔，目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染墅拭，如果從事細胞治療、進行干細胞培養(yǎng)涣狗、生產(chǎn)血清谍婉、胰酶、培養(yǎng)液工作的科研人員镀钓，強烈建議選擇兩種以上檢測方法穗熬，確保支原體正確檢出率達到100%，避免關(guān)鍵實驗不必要的損失丁溅。

細胞培養(yǎng)支原體污染是個普遍性問題唤蔗，污染來源很多，根據(jù)國外生物實驗室的規(guī)范做法，實驗室的支原體檢測要定期進行妓柜，一般一個月做一次支原體檢測箱季，可以*時間確定支原體污染情況，顯著降低或避免支原體污染對細胞培養(yǎng)相關(guān)實驗的影響棍掐。

?

四藏雏、支原體污染去除

1、支原體污染預(yù)防

根據(jù)可能的支原體污染來源作煌，在體外細胞培養(yǎng)過程中掘殴，要嚴格控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作粟誓；細胞培養(yǎng)基和實驗器材奏寨、耗材要保證無菌；在不影響實驗結(jié)果的前提下努酸，可在細胞培養(yǎng)基中加入適量的特定抗生素服爷；發(fā)現(xiàn)支原體污染后杜恰，要清除支原體获诈，防微杜漸。

2心褐、支原體污染的去除及預(yù)防

因為支原體沒有細胞壁舔涎，一般用于細胞壁合成的抗生素對支原體沒有作用，如青霉素逗爹、萬古霉素多粘菌素（polymycin）亡嫌、利福平、磺胺藥物普遍沒什么效果掘而。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環(huán)素類挟冠、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時袍睡，這些抗生素不會產(chǎn)生耐藥性知染，且對哺乳動物細胞的毒性較小。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯能結(jié)合30S和50S核糖體亞基斑胜，從而抑制支原體蛋白質(zhì)合成控淡，喹諾酮抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶。因此可以在細菌DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)合成兩個層面上抑制細菌生長止潘，明顯增強除菌效果掺炭。

3、支原體去除試劑選擇

選擇支原體去除試劑需要注意幾個關(guān)鍵幾點：①細胞毒性小凭戴，毒性大的試劑在去除支原體的同時涧狮，會殺死細胞；②支原體去除效果，選擇廣譜試劑者冤，去除多種支原體吧享，以及細菌，真菌等譬嚣；③操作簡便钢颂，沒有二次污染；要考慮操作使用是否方便拜银，因為如果使用起來比較麻煩殊鞭，首先是費時費力，另外可能會帶來二次污染尼桶。目前市場上有多種支原體去除&預(yù)防試劑可選操灿。包括李記生物的Quick Cell支原體預(yù)防/去除試劑，美國GenDEPOT公司的Cellmaxin泵督，羅氏公司的BM-Cyclin趾盐，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin? prophylactic和Plasmocin? treatment 等小腊。

Quick Cell支原體預(yù)防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個層面去除支原體救鲤，抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨或聯(lián)合使用兩種成分秩冈，分別或同時在蛋白或DNA層面去除支原體污染本缠，細胞毒性更小。作用周期1-2周入问，支原體去除率大于92%丹锹。去除預(yù)防兼顧

BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環(huán)素（BM-Cyclin 2）兩種成分，抑制支原體及細菌生長芬失，去除培養(yǎng)細胞中已感染的支原體楣黍。適用于多種培養(yǎng)細胞，無明顯副作用棱烂，又不影響細胞本身的代謝租漂，而且處理過的細胞不會重新感染支原體。BM-Cyclin需聯(lián)合使用垢啼，作用周期2周窜锯，可消除80%以上的支原體。不確定能否預(yù)防芭析。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素锚扎，由真菌pleurotus mutilus 產(chǎn)生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環(huán)素馁启，四環(huán)素衍生物驾孔。此兩種抗生素溶液通常按先后聯(lián)合使用2－3次循環(huán)約一周以上芍秆，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素環(huán)丙沙星翠勉，屬于氟喹酮類妖啥。許多支原體被證明對BIOMYC-3敏感，需要根據(jù)支原體種類使用对碌。處理周期2周荆虱，能去除90%的支原體。是否可以預(yù)防支原體

Plasmocin? prophylactic和Plasmocin? treatment也是兩種抗生素的混合物朽们，包含兩個針對支原體的有效成分怀读，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制階段，對許多細菌和真核細胞則沒有影響骑脱。作用周期2周菜枷，去除效率未知。有兩個濃度包裝叁丧，去除用高濃度啤誊，預(yù)防用低濃度