人體表觀基因組圖譜揭示非規(guī)范DNA甲基化變異逊躁。
? 了解人類組織的多樣性是疾病的基礎(chǔ)砸逊，需要將遺傳信息（在大多數(shù)個(gè)體細(xì)胞中是相同的）與可能具有組織特異性作用的表觀遺傳機(jī)制聯(lián)系起來佑淀。人類組織中DNA甲基化的調(diào)查已經(jīng)建立了一個(gè)復(fù)雜的景觀志于，包括組織特異性和不變的甲基化模式1留瞳，2胡陪。在這里，我們報(bào)道了高覆蓋率的甲基組颤练，在主要人類器官系統(tǒng)的所有情況下既忆，與匹配的轉(zhuǎn)錄組和基因組序列整合，對(duì)胞嘧啶甲基化進(jìn)行分類嗦玖。通過將這些不同的數(shù)據(jù)類型與每個(gè)個(gè)體的階段性基因組3相結(jié)合患雇，我們確定了幾乎所有人類組織中廣泛存在的組織特異性差異CG甲基化（MCG）、部分甲基化結(jié)構(gòu)域宇挫、等位基因特異性甲基化和轉(zhuǎn)錄苛吱，以及非CG甲基化（MCH）的意外存在。MCH與組織特異性功能相關(guān)捞稿，利用該標(biāo)記又谋，我們對(duì)在特定組織中逃避X染色體失活的基因進(jìn)行了新的預(yù)測(cè)。 總體而言娱局，幾種基因組環(huán)境中的DNA甲基化在人類組織中存在顯著差異彰亥。
? 為了更好地理解人類組織中DNA甲基化的變異性，我們獲得了來自4個(gè)個(gè)體的18種組織類型的死后樣本衰齐，（5個(gè)單份樣本任斋、8個(gè)重復(fù)樣本和5個(gè)三份樣本。圖1A耻涛，補(bǔ)充方法和補(bǔ)充表1）并進(jìn)行深度轉(zhuǎn)錄組分析（36個(gè)信使-RNA-seq樣品废酷；每個(gè)樣本120–475億個(gè)讀數(shù)），堿基分辨率甲基組（36個(gè)甲基C-SEQ4樣本抹缕；每個(gè)樣本的基因組覆蓋率為30–80X）和基因組測(cè)序（4個(gè)全基因組序列澈蟆；）每個(gè)樣本的基因組覆蓋率為20–45X。我們將最初的分析集中在CG背景下的胞嘧啶上卓研，并使用先前發(fā)表的方法2來鑒定差異甲基化（補(bǔ)充方法）趴俘。我們發(fā)現(xiàn)，在26奏赘，474寥闪，560個(gè)位點(diǎn)中，15.4%的（4磨淌，073疲憋，896（在這些實(shí)驗(yàn)中）CG位點(diǎn)測(cè)試）是強(qiáng)差異甲基化的（最小甲基化差異$0.3；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1）與之前的研究類似2梁只。 為了鑒定差異甲基化區(qū)域（DMR）缚柳，我們將500個(gè)堿基對(duì)（BP）內(nèi)的位點(diǎn)組合在一起埃脏，發(fā)現(xiàn)了1，198喂击，132個(gè)DMR剂癌。即使有這些嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)淤翔，我們確定的719翰绊，837（60.1%）的DMR是新的2，5旁壮。
? 正如預(yù)期的那樣监嗜，DMRS的低甲基化與組織特異性功能相關(guān)2，6抡谐。例如裁奇，主動(dòng)脈中強(qiáng)烈低甲基化的DMR與MYH10周圍的主動(dòng)脈特異性超級(jí)增強(qiáng)子7重疊，MYH10是參與血管功能的基因8（圖1B）麦撵。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的DMR刽肠，我們對(duì)它們的加權(quán)甲基化水平進(jìn)行了分級(jí)聚類9（補(bǔ)充方法，圖圖1C和擴(kuò)展數(shù)據(jù)1b免胃，C）音五。屬于同一器官系統(tǒng)的組織聚集在一起（例如，心臟和肌肉組織）羔沙。我們將這些結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中鑒定的差異表達(dá)基因的聚類進(jìn)行比較躺涝，并發(fā)現(xiàn)器官系統(tǒng)（補(bǔ)充方法的類似分離。1D和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1D）扼雏。此外坚嗜，對(duì)最低甲基化的組織特異性DMR的注釋Tool10分析的基因組區(qū)域富集揭示了許多組織特異性功能（擴(kuò)展數(shù)據(jù)。 1e诗充，f苍蔬，補(bǔ)充方法和補(bǔ)充表2-3）。
? 為了檢測(cè)甲基化和轉(zhuǎn)錄之間的關(guān)系蝴蜓，我們將DMRS的甲基化水平與最接近基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)（圖碟绑。2A，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a励翼、B和補(bǔ)充方法）蜈敢。正如預(yù)期的那樣，DMR中的甲基化與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)汽抚，并且這種相關(guān)性在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)時(shí)變得更強(qiáng)抓狭。最強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性不是在基因啟動(dòng)子中，而是在啟動(dòng)子下游8kb（）（基因內(nèi)（0.3kb至8kb）與啟動(dòng)子區(qū)和上游區(qū)UNK622kb至0.3kb UNK7 Spearman相關(guān)系數(shù)差值的中位數(shù)為20.07造烁；曼恩-惠特尼第54.23 10217頁否过；圖）午笛。該分析表明，在我們檢測(cè)的組織中苗桂，轉(zhuǎn)錄與基因內(nèi)DMR密切相關(guān)药磺，擴(kuò)展了在癌癥甲基組中的類似觀察結(jié)果11。這些基因內(nèi)甲基化差異先前被認(rèn)為是標(biāo)記基因內(nèi)CG島（CGIs）或CGI海岸5煤伟，12–14癌佩。 然而，只有一小部分基因內(nèi)DMR具有這些特征便锨，（19%围辙；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2C）。此外放案，預(yù)測(cè)的增強(qiáng)子和推定的啟動(dòng)子分別僅占基因內(nèi)DMR的23%和22%姚建，這表明剩余的DMR（我們稱之為未定義的基因內(nèi)DMR（UIDMRS））代表了一組未識(shí)別的功能元件（35%；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2C和補(bǔ)充方法）吱殉。這些UIDMRS的甲基化水平與含有它們的基因的表達(dá)密切相關(guān)掸冤。為了檢測(cè)它們的調(diào)節(jié)潛力，我們繪制了它們的組蛋白修飾譜（組蛋白3 Lys 4甲基化（H3K4me1）友雳、H3K4me3稿湿、H3K27ac、H2K9me3沥阱、H3k27me3和H3k36me3）缎罢，它們來自相同的組織樣本15，并發(fā)現(xiàn)了五類：弱增強(qiáng)子考杉、啟動(dòng)子近端策精、轉(zhuǎn)錄的、平衡的增強(qiáng)子和未標(biāo)記的（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2D–H崇棠、3A咽袜、B和補(bǔ)充方法）。具有強(qiáng)枕稀、活性組蛋白修飾的類別與表達(dá)（弱增強(qiáng)子和近端啟動(dòng)子UIDMRS中度負(fù)相關(guān)询刹；斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)中位數(shù)為20。 ）分別為32和20.16萎坷；然而凹联，具有較低活性組蛋白修飾的UIDMRS表現(xiàn)出弱的負(fù)相關(guān)性（轉(zhuǎn)錄和平衡增強(qiáng)子UIDMRS）。值得注意的是哆档，啟動(dòng)子近端UIDMRS的表達(dá)和甲基化之間的相關(guān)性與與強(qiáng)啟動(dòng)子重疊的基因內(nèi)DMRS的相關(guān)性一樣強(qiáng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充方法）蔽挠，表明基因內(nèi)啟動(dòng)子和啟動(dòng)子近端序列比那些富集增強(qiáng)子樣染色質(zhì)修飾的序列更能預(yù)測(cè)甲基化的變化。
? 相反瓜浸，未標(biāo)記的UIDMRS顯示與表達(dá)的弱正相關(guān)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4D）澳淑。值得注意的是比原，我們發(fā)現(xiàn)許多在組織特異性UIDMRS中富集的基序存在于組織特異性增強(qiáng)子中（例如，HNF4A（參考文獻(xiàn)16）在肝臟特異性UIDMRS中）杠巡，表明這些DMR是組織特異性調(diào)節(jié)元件（補(bǔ)充方法和補(bǔ)充表4和5）量窘。最近，在小鼠6中發(fā)現(xiàn)了低甲基化區(qū)域氢拥，該區(qū)域在成人組織中不活躍蚌铜，但在胎兒發(fā)育過程中活躍。 我們檢查了匹配的胎兒組織17中未標(biāo)記的UIDMRS的DNase I超敏反應(yīng)譜兄一，并發(fā)現(xiàn)超敏反應(yīng)的富集（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5和補(bǔ)充表6）厘线，這表明在發(fā)育早期识腿，無活性DMR的低甲基化可以維持在活躍區(qū)域出革。
? 接下來，我們研究了甲基化變異是否與個(gè)體間的遺傳變異有關(guān)渡讼，這在健康的原代組織或使用全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序18骂束，19中尚未得到廣泛表征。為了鑒定個(gè)體特異性DMR成箫，我們使用了一種對(duì)這些差異敏感的方法20展箱，與上述方法（補(bǔ)充方法）不同。我們首先將我們的分析限制在三個(gè)樣本中蹬昌，并通過組織特異性甲基化異常值評(píng)分對(duì)DMR進(jìn)行排序混驰，當(dāng)一個(gè)個(gè)體的甲基化水平與其他兩個(gè)個(gè)體的甲基化水平不同時(shí)，該評(píng)分最大皂贩。我們發(fā)現(xiàn)栖榨，在所有組織中前2，500個(gè)甲基化異常評(píng)分排序的DMR中明刷，與甲基化變化相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）富集了1.6倍（補(bǔ)充方法）婴栽。 然后，我們使用警句Pipeline 21從這些DMR中的DNA基序預(yù)測(cè)組織特異性甲基化辈末，并發(fā)現(xiàn)它們高度預(yù)測(cè)（平均曲線下面積（AUC）0.79愚争；補(bǔ)充方法）。這些完整的模型平均使用了156個(gè)圖案挤聘；然而轰枝，每個(gè)組織僅使用20個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子基序獲得了0.74的平均AUC。
? 然后组去，我們通過對(duì)組織特異性基序的集合進(jìn)行聚類（補(bǔ)充方法）來識(shí)別相應(yīng)基序的組鞍陨。基序組通過其組織低甲基化和高甲基化特異性進(jìn)行聚類（圖2B）添怔。95個(gè)基序中有42個(gè)基序僅具有低甲基化特異性湾戳；例如贤旷，參與心臟發(fā)育22的MEIS在左心室、右心房和右心室中低甲基化砾脑。我們還鑒定了34個(gè)基序幼驶，這些基序在一些組織中的低甲基化DMR和其他一些組織中的高甲基化DMR中富集。這些基序中的三個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子家族（FOX韧衣，HOX和GATA）匹配盅藻，并且在低甲基化區(qū)域中最顯著地富集，這表明它們主要參與調(diào)節(jié)低甲基化畅铭。
? 除培養(yǎng)的人胎兒成纖維細(xì)胞系（IMR90）4氏淑、癌細(xì)胞23、24和胎盤（PLA）25外硕噩，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有高基因組水平的MCG假残。令人驚訝的是，胰腺甲基化（PA-2和PA-3）的大區(qū)域顯著低甲基化（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖炉擅。我們開發(fā)了一種鑒定全基因組部分甲基化結(jié)構(gòu)域（PMD）的方法（補(bǔ)充表7-8和補(bǔ)充方法）辉懒，并發(fā)現(xiàn)胰腺PMD小于IMR90和PLA（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6B），并覆蓋基因組（的較小部分谍失。圖2C）眶俩。所有的PMD對(duì)都明顯重疊，表明這些區(qū)域在很大程度上是共享的快鱼，（40%重疊颠印；P<0.001；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6C）抹竹。
具有PMD的樣品中的基因被轉(zhuǎn)錄抑制25线罕，26，但這些區(qū)域在我們調(diào)查的所有組織中也顯示出表達(dá)降低柒莉，無論是否存在PMD（圖2D）闻坚。在IMR90和PA-2中，這些區(qū)域顯示出（H3K27me3和H3K9me3的抑制性修飾的富集兢孝；中位差0.025–0.168讀取每千堿基每百萬（rpkm）窿凤；Mann–Whitney P<2.51*10-2161）和活性修飾（H3K4Me1，H3K27Ac和H3K36Me3跨蟹；中位差0.050–0.012 rpkm雳殊；Mann–Whitney P，2.03 310253）與混洗區(qū)域相比（圖2e窗轩，f夯秃，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6D、E和補(bǔ)充方法），這為它們的抑制提供了潛在的機(jī)制仓洼。為了試圖解釋這種整體低甲基化介陶，我們繪制了DNMT1、DNMT3a色建、DNMT3b和DNMT3L的表達(dá)水平哺呜，但沒有發(fā)現(xiàn)有和沒有PMDS的樣品之間的系統(tǒng)表達(dá)差異（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖。7A–D）箕戳。
? 先前的研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了在人類胚胎干細(xì)胞4某残、腦1、20和骨骼肌中PGC-1A基因（PPARGC1a）的啟動(dòng)子27中存在CG背景（MCH）之外的甲基化陵吸。我們?cè)谠S多這些組織中發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)數(shù)量的MCH的證據(jù)玻墅，（圖。圖3A和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖）壮虫。5-BP基序?qū)悠贩譃閮山M澳厢，一組為富含TNCAC基序的MCH，另一組為富含NNCAN基序的MCH（其中N為任意堿基）（補(bǔ)充方法）旨指。 TNCAC基序與先前在純化的膠質(zhì)細(xì)胞（GLA）和神經(jīng)元（NRN）（TACAC）中鑒定的基序高度相似赏酥。這些基序不同于在H1胚胎干細(xì)胞（H1）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（TACAG）4，26（中發(fā)現(xiàn)的基序谆构。3B–D）。我們通過繪制具有TNCAC基序的25個(gè)樣品中MCH位點(diǎn)的甲基化水平的分布來量化這些樣品中MCH的程度框都，這揭示了與GLA搬素、NRN和H1相似的甲基化水平（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8B）4，20魏保。大多數(shù)組織類型始終富集TNCAC或NNCAN基序熬尺，但有幾種（食管、肺谓罗、胰腺和脾）具有不一致的重復(fù)粱哼，這表明MCH在這些組織中分布不均勻。
? 為了檢測(cè)MCH在成人組織中的潛在功能效應(yīng)檩咱，我們繪制了基因體MCH不同分位數(shù)表達(dá)水平的分布圖揭措，因?yàn)橄惹皥?bào)道其與H1中的表達(dá)呈正相關(guān)（參考文獻(xiàn)4），與神經(jīng)元中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)20刻蚯。 該分析揭示了表達(dá)和MCH之間的負(fù)相關(guān)性（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8C和補(bǔ)充方法）绊含。接下來，我們通過CAS甲基化（的模式來組合我們的重復(fù)和聚類基因炊汹，其中S是其基因體中和周圍的G或C）（圖3E和補(bǔ)充方法）躬充。為了表征分配給每個(gè)聚類的基因，我們進(jìn)行了David功能注釋聚類（補(bǔ)充表9和補(bǔ)充方法），這揭示了幾個(gè)不同的類別充甚。簇1以政、2、16和19包含高度富集參與基本細(xì)胞過程的術(shù)語的基因伴找，并且在所有樣本中具有活躍的甲基化狀態(tài)（即妙蔗，胚胎樣本中的高甲基化和組織和腦樣本中的低甲基化）。簇5和6由與神經(jīng)元功能相關(guān)的術(shù)語主導(dǎo)疆瑰，并且該類別中的基因在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間具有不同的甲基化眉反，并且在其他樣本中具有失活的甲基化狀態(tài)（即，在胚胎樣本中為低甲基化穆役，而在組織和腦樣本中為高甲基化）寸五。 簇12富含心臟和肌肉相關(guān)的術(shù)語，其基因在三種心臟組織中具有活躍的甲基化狀態(tài)耿币，在腰大肌中具有弱活躍的甲基化狀態(tài)梳杏，但在其他樣本中表現(xiàn)為不活躍。最后淹接，簇14在腦和組織樣品中具有活躍的甲基化狀態(tài)十性，但在胚胎樣品中不活躍。盡管在H1樣本中不活躍塑悼，但這類基因在與發(fā)育相關(guān)的術(shù)語中高度富集劲适。
? 為了更好地確定MCH基序在發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)變，我們檢測(cè)了各種分化的（組織厢蒜、NRN和GLA）霞势、胚胎（H1UNK6和胚胎衍生的UNK7神經(jīng)祖細(xì)胞UNK8NPCUNK9、中內(nèi)胚層（0MES（1斑鸦、滋養(yǎng)層樣（2TRO（3愕贡、間充質(zhì)干細(xì)胞（4MSC（5（628細(xì)胞樣品（7中CAC和CAG（MCAC和MCAG）位點(diǎn)的甲基化水平的比率。3F）巷屿。除腦細(xì)胞外固以，MCH水平在分化過程中下降，并且MCAC/MCAG比率揭示了基序使用隨發(fā)育時(shí)間的變化（圖嘱巾。 3F）憨琳；雖然，MCAC和MCAG在同一基因內(nèi)在早期胚胎和分化組織中仍然緊密相關(guān)浓冒，（擴(kuò)展數(shù)據(jù)栽渴。8D,E）。
? 甲基化先前已被證明可以預(yù)測(cè)神經(jīng)元中逃避X染色體失活的基因20稳懒。我們通過比較基因的啟動(dòng)子MCG和基因體MCH來研究這些樣品中的這種現(xiàn)象闲擦，這些基因先前已被鑒定為在11個(gè)具有MCH的組織中逃避X染色體失活29（圖4A）慢味。雌性特異性啟動(dòng)子MCG低甲基化和基因體MCH高甲基化以與神經(jīng)元20相似的水平存在于逃逸基因中（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9A）。使用這些組織甲基化組墅冷，基因體MCH可明顯預(yù)測(cè)雙特異性表達(dá)基因（AUC 0.89纯路；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9b和補(bǔ)充方法）。在較小程度上寞忿，我們觀察到雌性特異性啟動(dòng)子MCH和逃逸基因的基因體MCG超甲基化（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖驰唬。9a，C腔彰，d）叫编。盡管雌性特異性啟動(dòng)子MCG低甲基化、啟動(dòng)子MCH高甲基化和基因體MCG高甲基化可預(yù)測(cè)X染色體失活逃逸者霹抛，但雌性特異性基因體MCH高甲基化是X染色體失活逃逸者最具預(yù)測(cè)性的特征（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 9A搓逾，B–E）。我們?cè)?12個(gè)X連鎖基因中的109個(gè)中檢測(cè)到女性特異性MCH超甲基化杯拐，包括在所有11個(gè)組織中超甲基化的9個(gè)基因和僅在一個(gè)組織中超甲基化的72個(gè)基因（圖4B）霞篡。幾個(gè)基因，如FUNDC1端逼，在幾個(gè)組織中表現(xiàn)出雌性特異性的超甲基化朗兵，但在神經(jīng)元中沒有，這表明逃避X失活的組織依賴性調(diào)節(jié)顶滩。等位基因特異性甲基化和表達(dá)（分別為ASM和ASE）也可能在常染色體基因的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用余掖。
? 為了檢驗(yàn)人類組織中的這些現(xiàn)象，我們將RNaseQ和甲基C-seq數(shù)據(jù)集與本研究中每個(gè)個(gè)體的階段性基因型相結(jié)合3诲祸，15（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10A和補(bǔ)充方法）浊吏。使用三份組織樣本（脂肪（FT）、胃（GA）救氯、腰大肌（Po）歌憨、小腸（SB）和脾臟（SX））着憨，我們確定了CG背景下的8，464–48务嫡，560個(gè)ASM事件和這些組織中的48–403個(gè)ASE基因（補(bǔ)充表10甲抖、11和補(bǔ)充方法）。接下來心铃，我們尋找在組織類型（組織變量）內(nèi)的個(gè)體之間變化的ASM事件和在個(gè)體（個(gè)體變量）內(nèi)的組織類型之間變化的ASM事件准谚。 在變化的ASM事件中，4.1-7.5%和54.5-70.0%分別是組織和個(gè)體變量去扣；然而柱衔，在變化的ASE事件中，0.0-20.0%是個(gè)體可變的，13.3-48.8%是組織可變的（圖4C和補(bǔ)充方法）唆铐。在ASE事件中哲戚，38.4–87.4%的ASM事件在100kb內(nèi)，并且在這些位點(diǎn)中艾岂，76%的ASM和ASE事件匹配（即顺少，DMR在與更高表達(dá)的等位基因相同的單倍型上低甲基化）。此外王浴，我們發(fā)現(xiàn)在ASM事件附近觀察到更大比例的ASE基因脆炎，無論這些事件是否與（擴(kuò)展數(shù)據(jù)匹配。10 B氓辣、C和補(bǔ)充方法）秒裕。這些結(jié)果證明了人體組織中ASM和ASE之間的聯(lián)系。
? 在這里筛婉，我們展示了迄今為止最深的MCG和MCH的堿基分辨率圖譜簇爆，以及大量人類組織的染色質(zhì)修飾狀態(tài)、單倍型分辨的基因組序列和轉(zhuǎn)錄譜爽撒。這些數(shù)據(jù)集使我們能夠準(zhǔn)確地識(shí)別順式調(diào)控元件入蛆。 此外，他們揭示了在分化的人類組織的細(xì)胞亞群中存在MCH全基因組硕勿，這似乎是抑制性的哨毁。我們對(duì)人類組織中基因MCH的分析表明，其組織特異性分布與先前在胚胎干細(xì)胞和大腦中鑒定的基因不同源武。這些基因在各種功能上都很豐富扼褪，最令人驚訝的是那些與發(fā)育有關(guān)的基因。這些分析提出了一種有趣的可能性粱栖，即MCH用于成體干細(xì)胞30话浇，并可能有助于在細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槠浞只巧珪r(shí)抑制這些基因。
