測序數(shù)據(jù)拿回來之后叨粘，會給一些數(shù)據(jù)秒梅。那么這些數(shù)據(jù)代表什么呢旗芬？
1. 原始數(shù)據(jù)（Raw data）：一次測序產(chǎn)生的全部原始數(shù)據(jù)。理論上捆蜀，它們應(yīng)該是沒有經(jīng)過任何過濾的疮丛，無論好壞。
2. PF數(shù)據(jù)（PF data）：在測序過程中漱办，Illumina內(nèi)置軟件根據(jù)每個測序片段（read这刷，通常每個片段長100個堿基）前25個堿基的質(zhì)量決定該read是保留還是拋棄。如果沒有達到質(zhì)控標準娩井，則該read的全部堿基都被拋棄暇屋；達到標準、保留下來的數(shù)據(jù)叫做PF data洞辣。 PF代表pass filtering咐刨。
3. Q30數(shù)據(jù)（Q30 data）：Illumina內(nèi)置軟件根據(jù)統(tǒng)一設(shè)定的標準來評判堿基識別結(jié)果的可靠性，為每個堿基給予一個質(zhì)量評分（QV）扬霜。PF data里質(zhì)量評分>=30分的數(shù)據(jù)稱為Q30 data定鸟。 Q30的意思是該堿基的可靠性為99.9%。Q30數(shù)據(jù)通常占PF數(shù)據(jù)的80%左右著瓶。視樣本質(zhì)量联予、操作水平、試劑質(zhì)量材原、儀器狀態(tài)的不同沸久，這一比例有很大波動。
4. 干凈數(shù)據(jù)（Clean data余蟹。數(shù)據(jù)還有不干凈的卷胯？）：某些實驗室根據(jù)其自身的判斷標準，在PF data的基礎(chǔ)上威酒，進一步刪除質(zhì)量不好的reads后得到的數(shù)據(jù)窑睁。常見的刪除動作有：去接頭挺峡、去N含量高的reads、去質(zhì)量評分低的reads担钮、去掉每個read的最后幾個堿基橱赠，等等。
Clean data是國內(nèi)叫法裳朋；PF data是來自Illumina的概念病线，是廣為接受的國際通行標準。
PF算法實質(zhì)上是選取每個測序片段（read）前25個堿基的質(zhì)量來代表整條片段的質(zhì)量鲤嫡，從而決定該片段的去留。Illumina之所以這樣做绑莺，而不是逐個檢查整條片段所有堿基的質(zhì)量暖眼，一方面是為了節(jié)省電腦資源，不致于花費太多時間進行運算纺裁，拖累測序進程诫肠，另一方面也是在大量測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果基礎(chǔ)上選擇的平衡點，只要前25個堿基是正常的欺缘，后75個堿基出問題的概率比較小栋豫。
一次測序?qū)嶒炌瓿桑瑴y序儀上展示的數(shù)據(jù)量和%Q30都是以PF數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的谚殊。只要對數(shù)據(jù)質(zhì)量有足夠信心丧鸯，就不會對PF數(shù)據(jù)再進行加工，可以直接把PF數(shù)據(jù)交給客戶嫩絮，進行下游的生物信息學分析丛肢。
三、為什么要clean data?
如果二代測序?qū)嶒灣晒烁桑瑒tPF data已經(jīng)是質(zhì)量比較好的數(shù)據(jù)蜂怎，沒有必要進一步加工。從基本原理來講置尔，任何形式的加工過濾杠步，毫無例外都會引入額外的偏差(bias)，嚴重的時候會導致生物信息學分析結(jié)論失真榜轿。
把PF數(shù)據(jù)加工成“干凈數(shù)據(jù)”幽歼，原因有多種，其中常見的原因之一是使用山寨的試劑（非Illumina原廠正版試劑）構(gòu)建文庫差导，測序質(zhì)量不盡如人意试躏，Q30比例不高。在采用同種技術(shù)设褐、同種平臺的情況下颠蕴，文庫構(gòu)建的質(zhì)量是決定測序質(zhì)量的關(guān)鍵泣刹。只要去掉質(zhì)量差的數(shù)據(jù)，就可以提高Q30比例犀被，可是這樣做法目的性太強椅您，難免讓人心里打鼓。
讓我們來具體分析為了獲得clean data所做的4種常見動作是否有必要寡键，及其潛在副作用掀泳。
1、去接頭西轩。
使用正版試劑员舵、按標準流程進行操作，接頭序列是不會被測出來的藕畔，這是因為測序引物的結(jié)合位點位于接頭的3'端马僻，測序測到的第一個堿基就是插入片段的未知堿基，因此不需要去接頭注服。
在以下兩種特殊情況下韭邓，需要去接頭（adaptor），或者去標簽（barcode）：
一是自己合成寡核苷酸溶弟、自配文庫構(gòu)建試劑女淑，這類設(shè)計通常把barcode安排在接頭的3'端后面，而測序引物的結(jié)合位點仍然在接頭的3'端辜御，導致測序一開始測到的就是barcode序列鸭你，標簽測完了之后才是插入片段的未知序列。在這種情況下我抠，完成demultiplexing之后苇本，標簽序列完成了使命，就要把標簽序列刪除菜拓。
二是文庫的插入片段太短瓣窄，測序片段長度（通常是100堿基）大于插入片段長度，導致插入片段被測通纳鼎，一直測到下游接頭的部分或者全部序列俺夕。在這種情況下，要刪除下游的接頭序列贱鄙。
插入片段太短劝贸，除了改變打斷條件，增加插入片段長度以外逗宁，有些種類的樣本比如small RNA本身就很短映九。小RNA的長度只有20幾個堿基，測序試劑的包裝是50堿基和100堿基兩種瞎颗，都長于小RNA件甥；另外捌议，如果小RNA樣本數(shù)量少，湊不滿一張FC引有，就要與其他樣本一起測序瓣颅，為了將就同一張FC上的其他樣本，往往就對小RNA進行2x100堿基的測序譬正。在這種情況下宫补，去接頭是必要的。
去接頭和去標簽曾我，對測序數(shù)據(jù)本身不造成影響粉怕。
2、去含N多的測序片段抒巢。
一個測序片段里如果有很多堿基無法識別（用N表示）斋荞，提示測序質(zhì)量不高，或者測序過程中遭遇到問題虐秦，需要嚴肅對待，通過故障排除找到根本原因凤优，針對性地采取必要措施進行改正悦陋。刪除這些片段，只是使數(shù)據(jù)看起來比較漂亮筑辨，治標不治本俺驶。
3、去質(zhì)量評分低的片段棍辕。
PF算法本身去除的就是質(zhì)量評分低的片段暮现。如果要在PF之后再來一次“PF”，那就提示測序質(zhì)量沒有達到正常水準楚昭，實乃不得已而為之栖袋。
4、去末端一定數(shù)目的堿基抚太。
隨著測序讀長的增加塘幅，酶活性下降，熒光強度也在下降尿贫，因此測序數(shù)據(jù)質(zhì)量逐漸降低乃是自然趨勢电媳，片段末端的堿基質(zhì)量低于片段前端的。
即使存在這樣的問題庆亡，只要樣本質(zhì)量匾乓、試劑質(zhì)量、操作技能和儀器性能等有保障又谋，在廠家承諾的片段長度范圍內(nèi)拼缝，%Q30是完全能夠達到指標的娱局，并不需要人為去掉末端堿基。
