期刊：《Frontiers in Microbiology》
影響因子：5.640
近日仅孩，派森諾生物與上海交通大學農業(yè)與生物學院合作菜职，在微生物基因組領域《Frontiers in Microbiology》發(fā)表研究成果！本文首次報道一種新型假單胞菌1257菌株肉微，該菌株可以有效抑制水稻黃單胞菌（xanthomonasoryzae予权，Xoc）在水稻中的生長和遷移，從而預防細菌性葉斑病(bacterial leaf streak浪册，BLS)。
研究背景
假單胞菌是普遍存在于土壤岗照、水村象、動物和植物根際的革蘭氏陰性菌，其具有生長速度快并在植物根際持續(xù)存在的能力攒至，能夠產生廣泛的次生代謝產物(如抗生素厚者、鐵載體、揮發(fā)物和促生長物質)從而適應環(huán)境脅迫迫吐，適合作為植物病原生物防治劑库菲。假單胞菌屬的某些種已被證明是有效的生物防治或生長促進劑，人們對該菌在商業(yè)和生物技術上的應用越來越感興趣志膀。
水稻黃單胞菌(Xoc)可通過侵染寄主水稻引起細菌性葉斑病(BLS)熙宇，該病已逐漸成為我國南方部分水稻產區(qū)第四大病害鳖擒，嚴重時可導致減產10-30%。到目前為止烫止，還沒有發(fā)現(xiàn)對Xoc完全免疫的水稻品種蒋荚。目前，我國普遍種植的水稻品種均對弓形蟲敏感馆蠕，甚至一些雜交水稻品種也是高度敏感的期升，目前我國常用殺菌劑如雙美噻唑的使用，導致Xoc產生耐藥性互躬，因此播赁，急需一種有效的、環(huán)境友好的生物防治方法吼渡。
本研究從223株候選菌株中鑒定了一株假單胞菌1257菌株容为，系統(tǒng)發(fā)育、基因組學和生理生化特征表明1257菌株是一種具有代表性的新型假單胞菌诞吱。此菌是首次報道的一種新型假單胞菌可能對BLS生物防治具有較大作用舟奠。
研究材料與方法
1、實驗材料：上海市奉賢區(qū)莊航村古村采集的卷心菜根際土壤中分離得到的菌株1257房维；
2沼瘫、測序平臺：Illumina Miseq 、Pacbio
3咙俩、分析內容：細菌完成圖測序耿戚、系統(tǒng)發(fā)育樹構建、ANI分析阿趁、基因家族分析膜蛔、共線性分析、次級代謝產物基因簇預測分析等脖阵。
研究結果
1皂股、1257菌株分離和鑒定
在233株分離菌株中，發(fā)現(xiàn)其中一株1257菌株對Xoc RS105具有較強的抑制作用(抑制帶> 40 mm)命黔，另外8株Xoc分離自中國主要水稻產區(qū)(圖1A)呜呐。擴增1257菌株的16S rRNA基因，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)1257菌株屬于假單胞菌屬悍募，1257菌株的16S rRNA基因序列與P. entomophila?L48(99.54%)和P. mosseliiCFMT90-83(99.48%)的序列相似度均超過99%蘑辑。為了確定1257菌株的系統(tǒng)發(fā)育情況，對該菌株的全基因組進行了測序(圖1B)坠宴。根據(jù)MLSA（MLSA分析使用的基因為10個管家基因洋魂，分別為16Sr RNA、aroE、dnaA副砍、guaA衔肢、gyrB、mutL址晕、ppsA膀懈、pyrC、recA和rpoB）分析結果顯示谨垃，1257菌株位于一個單獨的分支启搂，其最接近的是P. entomophilaL48和P. mosselii型株CFMT90-83(圖1C)。ANI分析發(fā)現(xiàn)刘陶，該菌株與已知菌種見的ANI值在73.77~89.13%之間胳赌，表明該菌株是一個新種。
圖 1 |菌株 1257 的分離匙隔、鑒定和抗菌活性測定疑苫；（A）菌株 1257 的菌落形態(tài)和拮抗活性；(B) 菌株 1257完成圖纷责；(C) 菌株 1257 的基于 MLSA 的系統(tǒng)發(fā)育樹捍掺。
2、1257菌株基因組特征和比較基因組分析
對菌株1257進行高通量測序再膳，得到一條6,049,604bp的染色體挺勿，GC含量為63.76%，預測得到5,411個編碼基因喂柒、22個rRNA不瓶、76個tRNA和73個其他ncRNA，該菌株的基因組和P. entomophilaL48的親緣關系最近灾杰。從基因組大小上來看蚊丐，菌株1257的基因組比P. entomophilaL48大，比P. mosseliiCFML90-83小艳吠。對這三個基因組進行共線性分析和基因家族分析：1.共線性分析發(fā)現(xiàn)菌株1257與P. entomophilaL48的親緣關系最近麦备；2.基因家族分析發(fā)現(xiàn)這三個菌株的核心基因組由11791個基因組成，占每個基因組的83.6 ~ 87.1%(圖2C)昭娩，根據(jù)此分析發(fā)現(xiàn)菌株1257有957個基因家族是其特有的泥兰。
圖2P. oryziphila1257 與其密切相關的兩個假單胞菌物種的比較基因組學分析和抗菌表型。(A)拮抗實驗题禀；?(B)共線性分析；(C)基因家族分析膀捷。
3迈嘹、次級代謝產物基因簇分析
antiSMASH分析顯示P. oryziphila1257的基因組包含8個編碼二肽Nacetylglutaminylglutamine amidc (NAGGN)的候選基因簇、4個非核糖體肽合成酶(NRPS)和2個核糖體合成的抗微生物肽，芳基多烯(APE)型色素秀仲。Blast比對結果表明融痛，在P. oryziphila、P. entomophila和P. mosselii基因組中神僵，NAGGN雁刷、NRPS 3、APE和NRPS 4基因簇是保守的保礼，而P. entomophila的次生代謝產物生物合成候選基因簇比P. oryziphila和P. mosselii多沛励。
圖3 次生代謝物生物合成基因簇比較。
4炮障、Xoc抗菌機制的全基因組鑒定
Southern blot分析表明目派，所有突變體只攜帶一個轉座子副本。將Tn5轉座子插入到1257基因組13個不同區(qū)域的19個基因中胁赢，包括carAB企蹭、purMF、purCLDK智末、gntR-lgrD谅摄、sdhA、dsbB1系馆、tuf1送漠、serC、gph它呀、dnaK螺男、argG、sohB和rna2(圖4A)纵穿。作者構建了carA下隧、carB、purF和serC基因的完整功能片段谓媒，并將相關質粒導入相應的插入突變體中淆院。結果發(fā)現(xiàn)，互補菌株對Xoc RS105的拮抗活性恢復到野生型水平(圖4B)句惯，表明這些基因在生物合成抗Xoc RS105活性化合物中起著關鍵作用土辩。
圖4 |全基因組鑒定P.oryziphila1257對Xoc RS105的抗菌功能基因。(A)P. oryziphila?1257的Tn5插入突變體特征抢野。(B)野生型P. oryziphila1257拷淘、carA、carB指孤、purF启涯、serC和lgrD突變體及其互補菌株的抑菌活性測定贬堵。
為了明確上述功能基因所涉及的代謝過程，對其進行了KEGG注釋分析结洼。carA和carB基因編碼氨基甲趵枳觯基磷酸酯合成酶，該酶催化氨基甲跛扇蹋基磷酸酯(CP)的合成蒸殿，是精氨酸和嘧啶代謝的前體。ArgG基因編碼的ArgG是一種精氨酸琥珀酸合成酶鸣峭，負責從天冬氨酸中產生精氨酸琥珀酸宏所。sdhA基因編碼琥珀酸脫氫酶a亞基，是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶叽掘。這六個pur基因編碼（PurF楣铁、PurD、PurL更扁、PurM盖腕、PurC和PurK）是PPP中的代謝酶，將糖酵解途徑(PP)中的核糖- 5p轉化為5-羧基氨基-1-(5-磷酸- dribosyl)咪唑(CPR)浓镜。這些分析表明溃列，CP和CPR可能是合成活性化合物的重要前體，也為進一步鑒定目標化合物提供了重要的依據(jù)膛薛。
圖 5P. oryziphila1257抗菌活性相關基因的KEGG分析示意圖听隐。
5、稻瘟桿菌1257對細菌性葉斑病的生防效果
為研究水稻1257對Xoc RS105引起的BLS的生防效果哄啄，采用高感品種元豐早進行了田間試驗:僅Xoc RS105(對照)雅任，1257在Xoc RS105懸浮液(1257- tre)接種后12 h噴施，1257在Xoc RS105懸浮液(1257- pre)接種前12 h噴施咨跌。15天后調查BLS疾病嚴重程度：與對照處理相比沪么，1257- tre和1257- pre預處理顯著降低了稻田BLS的嚴重程度，相對防治效率分別為53.9%和39.7%锌半。結果表明禽车，1257-Tre處理具有較好的田間生物防治效果。
圖6P. oryziphila1257對水稻BLS的生防效果刊殉。（A)P. oryziphila1257和Xoc RS105菌在15天田間試驗中對水稻易感品種元豐早的病斑長度殉摔。(B)P. oryziphila1257和Xoc RS105接種元豐早在溫室1、3记焊、5和7天的病斑長度逸月。(C)接種后1、3遍膜、5和7天彻采，通過GUS定量檢測和組織化學染色監(jiān)測Xoc RS105-Gus在水稻葉片中的動態(tài)種群數(shù)量腐缤。
研究結論
1、鑒定了一種新的假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株肛响，它具有抑制Xoo和Xoc的能力，特別是抑制Xoc在水稻組織中的生長和遷移惜索，從而預防BLS蔡厮瘛；
2巾兆、基因組信息顯示猎物，該菌可能具有殺死昆蟲、溶解磷酸鹽角塑、依賴T4P系統(tǒng)移動蔫磨、降解IAA和PAA等功能基因，是一種萬能菌圃伶；
3.在假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株中發(fā)現(xiàn)一種非核糖體肽堤如，該非核糖體肽可能是參與BLS生物防治的主要活性化合物；
綜上所述窒朋，假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株的發(fā)現(xiàn)為水稻細菌性病害的生物防治提供了新的微生物資源搀罢。
