CRISPR-Cas9是繼ZFN郁季、TALENs等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)碍遍，短短幾年內(nèi),CRISPR-Cas9技術(shù)風(fēng)靡全球, 成為現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里面效率最高场晶、最簡便伪冰、成本最低、最容易上手的技術(shù)之一哄芜，成為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)貌亭。
一、什么是CRISPR-Cas系統(tǒng)
CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)认臊。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后圃庭，能夠把病毒基因的一小段存儲(chǔ)到自身的 DNA 里一個(gè)稱為 CRISPR 的存儲(chǔ)空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時(shí)失晴，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識(shí)別病毒剧腻，將病毒的DNA切斷而使之失效。
CRISPR-Cas系統(tǒng)包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR關(guān)聯(lián)基因）兩部分涂屁。
1书在、CRISPR（/'kr?sp?r/）是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列）拆又。分布在40%的已測(cè)序細(xì)菌和90%的已測(cè)序古細(xì)菌當(dāng)中儒旬。 （注：生活在深海的火山口、陸地的熱泉以及鹽堿湖等極端環(huán)境中遏乔，有一些獨(dú)特結(jié)構(gòu)的細(xì)菌义矛，稱為古細(xì)菌）
CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成盟萨。
①前導(dǎo)序列：富含AT堿基凉翻，位于CRISPR基因上游，被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子捻激。
②重復(fù)序列：長度約20–50 bp堿基且包含5–7 bp回文序列制轰，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定RNA的整體二級(jí)結(jié)構(gòu)胞谭。
③間隔序列：是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列垃杖。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”，當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí)丈屹，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會(huì)予以精確打擊调俘。
2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因組其他地方旺垒，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用彩库。因此，該基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated先蒋，Cas）骇钦。
Cas基因編碼的Cas蛋白在防御過程中至關(guān)重要，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因竞漾。
依據(jù)Cas蛋白在細(xì)菌免疫防御過程中參與的角色眯搭，目前將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類窥翩。
第一大類：它們切割外源核酸的效應(yīng)因子為多個(gè)Cas蛋白形成的復(fù)合物，包括Ⅰ型鳞仙、Ⅲ型和Ⅳ型寇蚊。
第二大類：它們的作用因子是比較單一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白繁扎。
目前幔荒，被最為廣泛應(yīng)用的CRISPR系統(tǒng)是II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，也就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)梳玫。
二爹梁、CRISPR-Cas9的作用原理
對(duì)于CRISPR-Cas9的作用機(jī)理可以分為三個(gè)階段來理解。
1提澎、第一階段：CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得（俘獲外源DNA姚垃，登記“黑名單”）
CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)獲得，其實(shí)就是指外來入侵的噬菌體或是質(zhì)粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因組盼忌，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的兩個(gè)重復(fù)序列之間积糯。因此，CRISPR 基因座中的間隔序列從5' 到3' 的排列也記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序谦纱。
新間隔序列的獲得可能分為三步：
第1步：Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描入侵的DNA看成，并識(shí)別出PAM區(qū)域，然后將臨近PAM的DNA序列作為候選的原型間隔序列跨嘉。
第2步：Cas1/2蛋白復(fù)合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來川慌，并在其他酶的協(xié)助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游。
第3步：DNA會(huì)進(jìn)行修復(fù)祠乃，將打開的雙鏈缺口閉合梦重。這樣一來，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中亮瓷。
2琴拧、第二階段：CRIPSR 基因座的表達(dá)（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工）
CRISPR序列在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pre-crRNA（crRNA的前體），同時(shí)與pre-crRNA序列互補(bǔ)的tracrRNA（反式激活crRNA）也被轉(zhuǎn)錄出來嘱支。pre-crRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與tracrRNA形成雙鏈RNA并與Cas9編碼的蛋白組裝成一個(gè)復(fù)合體蚓胸。它將根據(jù)入侵者的類型，選取對(duì)應(yīng)的“身份證號(hào)碼”（間隔序列RNA）除师，并在核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）的協(xié)助下對(duì)這段“身份證”進(jìn)行剪切赢织，最終形成一段短小的crRNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復(fù)序列區(qū)）。
crRNA馍盟，Cas9以及tracrRNA組成最終的復(fù)合物，為下一步剪切做好準(zhǔn)備茧吊。
3贞岭、第三階段：CRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮（靶向干擾）
crRNA八毯，Cas9以及tracrRNA組成最終的復(fù)合物就像是一枚制導(dǎo)導(dǎo)彈，可以對(duì)入侵者的DNA進(jìn)行精確的打擊瞄桨。這個(gè)復(fù)合物將掃描整個(gè)外源DNA序列话速，并識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列。這時(shí)芯侥，復(fù)合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域泊交，DNA雙鏈將被解開，形成R-Loop柱查。crRNA將與互補(bǔ)鏈雜交廓俭，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。
隨后唉工，Cas9蛋白精確的平端切割位點(diǎn)位于PAM上游3個(gè)核苷酸位置研乒，形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的那一條DNA鏈淋硝，而RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另外一條非互補(bǔ)DNA鏈雹熬。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA的表達(dá)被沉默谣膳，入侵者被一舉殲滅竿报。
三、CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)及應(yīng)用…
tracrRNA-crRNA在被融合為單鏈向?qū)NA（sgRNA）時(shí)也可以發(fā)揮指導(dǎo)Cas9的作用继谚。
CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)就是通過人工設(shè)計(jì)的 sgRNA（guide RNA）來識(shí)別目的基因組序列烈菌，并引導(dǎo) Cas9 蛋白酶進(jìn)行有效切割 DNA 雙鏈，形成雙鏈斷裂犬庇，損傷后修復(fù)會(huì)造成基因敲除或敲入等僧界，最終達(dá)到對(duì)基因組DNA 進(jìn)行修飾的目的。
CRISPR-Cas9的廣泛應(yīng)用
1臭挽、基因敲除（Knock-out）
Cas9可以對(duì)靶基因組進(jìn)行剪切捂襟，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下欢峰，細(xì)胞會(huì)采用高效的非同源末端連接方式（NHEJ）對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)葬荷。但是，在修復(fù)過程中通常會(huì)發(fā)生堿基插入或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象纽帖，造成移碼突變宠漩，（移碼突變：是指DNA分子由于某位點(diǎn)堿基的缺失或插入，引起閱讀框架變化懊直，造成下游的一系列密碼改變扒吁，使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。）使靶標(biāo)基因失去功能室囊，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除雕崩。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性魁索，可將Cas9的一個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，形成只能對(duì)DNA單鏈進(jìn)行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶盼铁。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計(jì)兩條sgRNA序列粗蔚，分別靶向DNA互補(bǔ)的兩條鏈，這樣兩條sgRNA特異性的結(jié)合靶標(biāo)序列饶火，即可形成DNA斷裂鹏控，并在修復(fù)過程中通過移碼突變實(shí)現(xiàn)基因敲除
2、基因敲入（Knock-in）
當(dāng)DNA雙鏈斷裂后肤寝，如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)入到細(xì)胞中当辐，基因組斷裂部分會(huì)依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因敲入醒陆。修復(fù)模板由需要導(dǎo)入的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成瀑构，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈刨摩，也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒寺晌。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低，通常小于10%澡刹。為了增加基因敲入的成功率呻征，目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率，將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時(shí)期罢浇，促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行陆赋；或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ，提高HDR的效率
3嚷闭、基因抑制攒岛、基因激活（Repression or Activation）
Cas9的特點(diǎn)是能夠自主結(jié)合和切割目的基因，通過點(diǎn)突變的方式使Cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性胞锰，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因灾锯，而不具備剪切DNA的功能。因此嗅榕，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)顺饮，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開始，從而抑制基因表達(dá)凌那；將dCas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物兼雄，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9帽蝶、Cas9 nickase的不同之處在于赦肋，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會(huì)對(duì)基因組DNA造成永久性的改變。
4金砍、多重編輯（Multiplex Editing）
將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中局蚀，可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯，具有基因組功能篩選作用恕稠。多重編輯的應(yīng)用包括：使用雙Cas9nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率雳刺、大范圍的基因組缺失及同時(shí)編輯不同的基因吧史。通常情況下，一個(gè)質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個(gè)不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯词爬。
5料祠、功能基因組篩選
利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞骆捧，因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的∷枵溃基因組篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù)敛苇，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應(yīng)以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果。CRISRP-Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢(shì)顺呕，在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用枫攀。目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對(duì)表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對(duì)化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因株茶、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對(duì)潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等来涨。
