2020年10月7日北滥，瑞典皇家科學(xué)院已決定將2020年諾貝爾化學(xué)獎授予德國馬克斯·普朗克病原學(xué)研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美國加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士，以表彰她們在基因組編輯領(lǐng)域的貢獻闸翅。

兩位科學(xué)家于2012年在《科學(xué)》雜志發(fā)表論文并首次指出再芋，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體外實驗中能“定點”對DNA進行切割，顯著提升了基因編輯的效率坚冀。那么济赎，除了CRISPR-Cas9，還有哪些CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)的基因編輯工具记某？

2020年6月來自哈佛大學(xué)與麻省理工學(xué)院Broad研究所的研究團隊在《Nature Biotechnology》發(fā)表CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)及其衍生工具的詳盡綜述司训。該綜述將重點放在CRISPR技術(shù)上，旨在向讀者概述當(dāng)前CRISPR技術(shù)的能力和局限性液南，以便于工具選擇壳猜，并突出未來改進的機會。

CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)及其衍生工具

新的CRISPR-Cas基因組編輯工具的開發(fā)繼續(xù)推動生命科學(xué)的重大進展贺拣，除最基本的Cas核酸酶外蓖谢，單堿基編輯系統(tǒng)?（base editors）、Cas轉(zhuǎn)座及重組酶系統(tǒng)和先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)（prime editors）的出現(xiàn)讓基因編輯有了更多選擇譬涡。

CRISPR–Cas系統(tǒng)

在自然界中闪幽，CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌和古生菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分。由于CRISPR–Cas系統(tǒng)的可編程性涡匀，以及某些Cas效應(yīng)器在各種細胞類型和生物體中的魯棒性盯腌，使其在生命科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。

天然存在的CRISPR–Cas系統(tǒng)分為兩大類：第1類陨瘩，使用多蛋白復(fù)合物用于核酸切割腕够；第2類级乍，使用單蛋白效應(yīng)域進行切割。由于單蛋白效應(yīng)域提供的優(yōu)勢帚湘，第2類系統(tǒng)是用于生物學(xué)研究和翻譯應(yīng)用的最廣泛的CRISPR工具玫荣。第2類進一步細分為II，V和VI三種類型大诸，每種類型都使用不同類型的Cas蛋白捅厂。在來自第2類系統(tǒng)的Cas蛋白中，大多數(shù)II型Cas9突變體和V型Cas12突變體具有RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶活性资柔，而VI型Cas13突變體似乎顯示出優(yōu)先的RNA靶向和切割活性焙贷。研究團隊主要討論了Cas9和Cas12核酸酶。

Cas9：來自第2類CRISPR系統(tǒng)的Cas9效應(yīng)子是RNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶贿堰，可在目標(biāo)DNA序列中產(chǎn)生DSB辙芍。自從化膿性鏈球菌（SpCas9）在體外和在哺乳動物細胞中通過Cas9核酸酶對DNA進行程序化切割的首次報道以來，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多的Cas9突變體羹与，并對其進行了基因組編輯測試故硅，包括來自金黃色葡萄球菌、嗜熱鏈球菌注簿、腦膜炎奈瑟菌的同源序列契吉，空腸彎曲菌和許多其他生物。

Cas12：Cas12核酸酶包含V型CRISPR系統(tǒng)的幾種突變體诡渴。這些蛋白質(zhì)僅具有單個RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域捐晶，可介導(dǎo)兩條鏈的目標(biāo)DNA切割。Cas12a（早期被命名為Cpf1）是最早被發(fā)現(xiàn)并廣泛用于基因組編輯的Cas12核酸酶妄辩。

修復(fù)通路：細胞內(nèi)存在多種DSB修復(fù)機制惑灵，DSB修復(fù)機制可分為兩大類：對斷裂的DNA末端進行重新連接（末端連接），通常在DSB位點附加核苷酸缺失或插入眼耀；以及使用DNA模板進行同源性定向修復(fù)（HDR）楚昭。CRISPR–Cas核酸酶最常用于有效和選擇性地破壞靶基因序列屏积。在大多數(shù)哺乳動物細胞中，核酸酶誘導(dǎo)的DSB最常通過易出錯的末端連接過程進行修復(fù)。

Cas突變體的開發(fā)：

擴大基因組編輯劑的靶向范圍一直是CRISPR–Cas技術(shù)開發(fā)的主要重點匾乓。目前大量的工作集中在擴大Cas9突變體的靶向范圍妆毕，特別是SpCas9涝影，但是識別富T-PAM序列的Cas12突變體的發(fā)現(xiàn)和工程化將可能繼續(xù)擴大Cas效應(yīng)器的靶向性句旱。此外，研究團隊注意到工程化Cas蛋白突變體的活性不如野生型蛋白鬼廓，當(dāng)Cas蛋白用于更高要求的應(yīng)用肿仑，如編輯人類遺傳疾病的動物模型或靶向被內(nèi)源性蛋白質(zhì)占據(jù)的DNA位點時，這種缺陷最為明顯。因此尤慰，構(gòu)建能夠在訪問某些具有挑戰(zhàn)性的PAM序列時保持高活性的穩(wěn)定Cas突變體仍然是未來發(fā)展的一個重要方向馏锡。

具有更高DNA特異性的工程化Cas突變體。Cas核酸酶的精確靶向取決于其將靶向序列與整個基因組中存在的類似脫靶序列區(qū)分開的能力伟端。盡管在識別和工程設(shè)計更高保真度的Cas突變體方面已經(jīng)取得了實質(zhì)性進展杯道，這些突變體可以在很大程度上減少脫靶編輯，但是對這些突變體的高通量評估表明荔泳，這類突變體的靶位點活性較低蕉饼。此外，大多數(shù)高保真度的Cas9突變體都不能容忍標(biāo)準(zhǔn)化向?qū)NA的變化玛歌，包括5'G的添加或錯配。這些因素限制了它們在實踐中的實用性擎椰。因此支子，在降低脫靶活性的同時保持其有效的靶位點編輯活性，并保障系統(tǒng)與各類向?qū)NA突變體的兼容性达舒，是未來優(yōu)化的重要方向值朋。

單堿基編輯系統(tǒng)

單堿基編輯系統(tǒng)可以在不需要誘導(dǎo)DSD或補充供體DNA模板的條件下精確地完成定點突變，并且該過程也不依賴HDR巩搏。目前已開發(fā)了兩種主要的堿基編輯器：胞嘧啶堿基編輯器（CBE）昨登，催化C-G堿基對轉(zhuǎn)化為T-A堿基對；腺嘌呤堿基編輯器（ABE）贯底，可催化A-T到G-C的轉(zhuǎn)化丰辣。CBE和ABE可有效介導(dǎo)四種堿基轉(zhuǎn)換突變（C→T，A→G禽捆，T→C笙什，G→A），這類突變約占當(dāng)前已注釋的人類病原體變異的30%胚想。目前單堿基編輯器被廣泛用于多種細胞系和模式生物中琐凭，包括人類遺傳疾病的動物模型。

單堿基編輯系統(tǒng)使用的注意事項：目前單堿基編輯器的多樣性增加了其成功應(yīng)用的可能性浊服，這也讓合理選擇適合的單堿基編輯器更具有挑戰(zhàn)性统屈。選擇單堿基編輯器時需要考慮，PAM的可用性牙躺，核苷酸序列信息愁憔，編輯窗口，產(chǎn)物純度和DNA特異性等述呐。

當(dāng)前的CBE和ABE能夠在各種序列背景下以及在包括哺乳動物在內(nèi)的各種細胞類型和生物體中惩淳，在整個基因組的目標(biāo)基因座上進行精準(zhǔn)的定點突變，特定條件下還可以進行靶位點的隨機突變。目前思犁，單細胞編輯器還需要在編輯效率代虾、特異性和體內(nèi)遞送能力上做進一步優(yōu)化，并且開發(fā)活性可控的單堿基編輯器或使用外源性小分子可進一步提升其作為研究工具和潛在療法的實用性激蹲。

轉(zhuǎn)座酶和重組酶系統(tǒng)

在活細胞中靶向整合的通用方法一直是基因組編輯領(lǐng)域的長期挑戰(zhàn)棉磨。盡管核酸酶和切口酶介導(dǎo)的HDR可實現(xiàn)定向整合，但這些方法僅限于主動分裂細胞学辱。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)天然CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶和工程化Cas結(jié)構(gòu)域融合轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)可以在體外將基因組整合到細菌基因組中乘瓤。

先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)

先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)是一種最新的基因組編輯技術(shù)，可以精確策泣、有針對性地引入所有12種可能類型的點突變（即所有6種可能的堿基對轉(zhuǎn)換）衙傀，小插入和小缺失。主要的編輯器是Cas9切口酶域（滅活的HNH核酸酶）和工程逆轉(zhuǎn)錄酶域之間的融合蛋白萨咕。雖然先導(dǎo)編輯器的效果令人驚喜统抬，但仍有許多待解決的問題，例如細胞狀態(tài)/類型對編輯效率的影響危队，先導(dǎo)編輯過程中涉及的DNA修復(fù)機制等聪建。同時探尋適用于先導(dǎo)編輯的小型逆轉(zhuǎn)錄酶對于其未來應(yīng)用相當(dāng)關(guān)鍵。

From 研究團隊

基因組編輯技術(shù)的迅速發(fā)展將我們帶入了一個新的時代茫陆，在這個時代我們可以編輯我們自己的基因組金麸，以及影響許多其他有機體的基因組。我們正處在這個新時代的開端簿盅。繼續(xù)努力提高編輯能力挥下，了解編輯我們基因組的所有后果，創(chuàng)新將編輯劑注入細胞的新方法挪鹏，并充分吸收科學(xué)家见秽、醫(yī)生、倫理學(xué)家讨盒，政府和其他利益相關(guān)者的意見將是指導(dǎo)我們下一步行動的關(guān)鍵和確保這些科學(xué)進步能夠充分發(fā)揮其造福社會的潛力解取。

首發(fā)公號：國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺

參考文獻

Anzalone, A.V., Koblan, L.W. & Liu, D.R. Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.?Nat Biotechnol?38,?824–844 (2020).?

部分信息來源于“生物谷”和“環(huán)球科學(xué)”公眾號，圖片來源于Nature官網(wǎng)和參考文獻返顺，如有侵權(quán)請聯(lián)系刪除禀苦。