細(xì)胞轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

如為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日灯蝴，必須應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液恢口，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%（貼壁細(xì)胞）或 2×106-4×106細(xì)胞/ml（懸浮細(xì)胞）為宜穷躁，最好在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液耕肩。

用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染问潭，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上猿诸。

培養(yǎng)基中的血清

在開始準(zhǔn)備DNA和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時(shí)要使用無(wú)血清的培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成狡忙。其實(shí)梳虽，只要在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的灾茁。

培養(yǎng)基中的抗生素

抗生素是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物窜觉。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性北专，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞竖螃。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低逗余。這時(shí)候可以選擇英格恩生物的Entranster轉(zhuǎn)染試劑，非脂質(zhì)體試劑季惩，培養(yǎng)基可加抗生素录粱，避免了細(xì)胞染菌。

設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照画拾。

一般在轉(zhuǎn)染24-48h啥繁，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)青抛。

如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系旗闽，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等适室。

質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

啟動(dòng)子的選擇

啟動(dòng)子的選擇對(duì)于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的嫡意。對(duì)于轉(zhuǎn)染過(guò)程本身雖然無(wú)甚影響，但是對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響捣辆。

質(zhì)粒的大小和質(zhì)量

線性化還是超螺旋會(huì)影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多蔬螟，特別是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高汽畴。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會(huì)困難一些旧巾。畢竟，相對(duì)致密忍些、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些鲁猩。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)罢坝，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會(huì)高一些廓握。有的轉(zhuǎn)染試劑還會(huì)提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)更致密一些炸客，更容易轉(zhuǎn)染一些疾棵。純化質(zhì)粒的質(zhì)量也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，一定要選擇高質(zhì)量的質(zhì)粒痹仙。

質(zhì)粒DNA的濃度和量

既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問(wèn)題是尔，初學(xué)者通常都不會(huì)在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA，但是要注意的是开仰，DNA量過(guò)少固然轉(zhuǎn)染效率不高拟枚，DNA量過(guò)多同樣會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。所以預(yù)實(shí)驗(yàn)需要按照說(shuō)明書的要求众弓，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑恩溅。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA谓娃。

轉(zhuǎn)染試劑的選擇

在確定了質(zhì)粒的質(zhì)量之后脚乡，就要考慮轉(zhuǎn)染試劑的選擇了。目前大多數(shù)用的是脂質(zhì)體類的轉(zhuǎn)染試劑滨达，但這類試劑的毒性較大奶稠，轉(zhuǎn)染效率低，最好選擇非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑捡遍，如Entranster試劑锌订。

細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

優(yōu)化條件：質(zhì)粒不同，所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同及定量的準(zhǔn)確性等因素會(huì)導(dǎo)致在一些情況下所做的轉(zhuǎn)染不在該優(yōu)化條件內(nèi)画株。這種情況下需要對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配比進(jìn)行優(yōu)化辆飘。另外啦辐，可選用更合適的轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑蜈项。

抑制劑：不要在用于制備DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素芹关，EDTA，檸檬酸鹽战得，磷酸鹽充边，RPMI，硫酸軟骨素常侦，透明質(zhì)酸浇冰，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

細(xì)胞狀態(tài)及融合度：長(zhǎng)勢(shì)旺盛的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果更佳聋亡，細(xì)胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度至少70%以上肘习。

DNA純度及數(shù)量：確保質(zhì)粒OD值A(chǔ)260/A280在1.8~2.0之間。DNA量不能太高坡倔，單獨(dú)DNA也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響漂佩。