Title：The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease 鏈接：sci-hub

P0: Introduction

P1: Cellular functions of DNA methylation

胞嘧啶甲基化在哺乳動物基因組中是普遍存在的砸紊，但可能在不同的基因組區(qū)域執(zhí)行不同的功能步做。此外，即使DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)，其內(nèi)在機制在基因啟動子、基因體或重復(fù)序列上也不一定相同。在本節(jié)中辰如，我們將討論DNA甲基化的基因組效應(yīng)和功能機制的最新證據(jù)。

----p1-1 The writers and erasers of methylation

1）DNA甲基化有三個階段:建立(從頭DNA甲基化)贵试、維持和去甲基化琉兜。
2）在哺乳動物中，有兩種主要的DNA重新甲基化酶DNMT3A和DNMT3B
3）DNA甲基化通常不存在于活躍轉(zhuǎn)錄基因的富CpG啟動子中毙玻。通常富集于三甲基化組蛋白H3Lys4 (H3K4me3)豌蟋。(圖1a)
4）這強烈表明轉(zhuǎn)錄和基因體DNA甲基化之間存在機制聯(lián)系(圖1b)。
5）然而從頭DNA甲基化可以發(fā)生在任何序列環(huán)境中桑滩，只有對稱的CpG甲基化在DNA復(fù)制中保持梧疲。

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----p1-2 DNA methylation represses transcription

1）DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的抑制作用長期以來被認(rèn)為與DNA甲基化和基因沉默有關(guān)，基因沉默隨著啟動子處CpG二核苷酸密度的增加而增加运准。然而幌氮，這如何導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制仍然沒有完全解決，因為甲基標(biāo)記本身似乎并不意味著沉默胁澳。
2）接近染色質(zhì)的區(qū)域通常是低甲基化或未甲基化的该互，這表明轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和DNA甲基化是相互排斥的。某些轉(zhuǎn)錄因子對CpG甲基化敏感:最近對542個人類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)查發(fā)現(xiàn)韭畸，與未甲基化相比宇智，有117個(22%)的轉(zhuǎn)錄因子甲基化后與基序的結(jié)合減少。通過阻止這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合胰丁，DNA甲基化可以因此阻礙包含序列識別基序的CGI啟動子的轉(zhuǎn)錄激活随橘。
3）DNA甲基化也可以通過DNMT蛋白招募染色質(zhì)重構(gòu)因子和修飾因子來促進異染色質(zhì)的形成。
4）哺乳動物有五種MBD蛋白:MBD1-MBD4和甲基-cpg結(jié)合蛋白2 (MeCP2)锦庸。四種MBD蛋白表現(xiàn)出CpG結(jié)合增加和CpG甲基化增加之間的線性關(guān)系机蔗，但MBD3不偏愛甲基化胞嘧啶。所有的MBDs與核小體重構(gòu)和組蛋白去乙跛嵩保化酶復(fù)合物相互作用蜒车，導(dǎo)致基因沉默。

----p1-3 CpG-island promoters

1）哺乳動物的基因組通常CpG較少幔嗦，CpG島(CGIs)是相對較小的基因組區(qū)域酿愧，平均約為1kb。超過三分之二的哺乳動物啟動子是CGI邀泉，幾乎所有的管家基因都有CGI啟動子嬉挡，一些發(fā)育調(diào)節(jié)的基因也有钝鸽。
2）cgi很少被甲基化;它們在分裂的雄性生殖細胞中尤其未被甲基化，這解釋了為什么它們在進化過程中不受脫氨作用的CpG侵蝕庞钢，以及它們顯著高的CpG含量拔恰。
3）存在三大類基因：其中在體細胞組織中穩(wěn)定的、終身DNA甲基化沉默（0不活躍X染色體上的基因基括、印記基因）和種系特異性基因颜懊。在這里，我們討論DNA甲基化可以針對這些特定類別的CGI啟動子风皿。

--------p1-3-1 X-chromosome inactivation（XCI）

每個細胞的X染色體被非編碼RNA（XIST）的順式活性隨機沉默河爹。在XCI的這一過程中，X-連鎖cgi的DNA甲基化出現(xiàn)的時間相對較晚桐款，并在基因已經(jīng)沉默后起到最后鎖定的作用咸这。

--------p1-3-2 Genomic imprinting

在基因組印跡中，DNA甲基化在兩個親本種系中存在差異;這些表觀遺傳印跡模式能夠抵御在早期胚胎發(fā)生期間發(fā)生的DNA甲基化的基因組重編程魔眨。在小鼠和人類中媳维，大約20個被稱為“印跡控制區(qū)”(ICRs)的基因組區(qū)域能夠經(jīng)受這種重編程，并迫使鄰近基因的單等位基因表達95 - 101遏暴。大多數(shù)的icr在卵母細胞中被甲基化侄刽，這些都與極度富含CpG的CGIs101相一致，而三個父系icr定位于CpG差的基因間序列拓挥。在卵母細胞生長過程中唠梨，DNMT3A在DNMT3L的輔助下甲基化了卵母細胞表達的基因體袋励，包括其轉(zhuǎn)錄依賴的基因內(nèi)cgi侥啤，而其余的基因組仍為低甲基化35,102 - 106(圖2b)。哺乳動物卵母細胞的轉(zhuǎn)錄通常來自典型CGI啟動子(受精后使用)上游的替代啟動子茬故，并且經(jīng)常與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的序列相一致106 - 109盖灸。母系(以及父系)icr與配子中其他被甲基化的序列的區(qū)別在于它們在特定遺傳基序(TGCCGC)中的富集，當(dāng)甲基化時磺芭，會被Krüppel- associated box (KRAB)所識別鋅指蛋白57 (ZFP57) 110-112(圖2b)赁炎。ZFP57招募KRAB相關(guān)蛋白1 (KAP1;也被稱為TIF1β)和其他沉默因子，包括dnmts111,1131,114钾腺。ZFP57-KAP1在卵母細胞中的選擇性DNA結(jié)合允許ICRs在受精后胚胎中保持等位基因特異性的甲基化徙垫，這經(jīng)歷了全面的DNA甲基化消除和重建。值得注意的是放棒，Zfp57的突變在小鼠中并不是完全滲透的:最近的一項研究表明姻报，一個類似的蛋白質(zhì)，ZFP445间螟，在幾乎所有的icr中與Zfp57合作吴旋，維持小鼠的甲基化印跡损肛，并且可能比Zfp57在人類中的作用更重要115∪偕總之治拿，母體印跡cgi進行DNA甲基化的能力依賴于卵母細胞不尋常的轉(zhuǎn)錄景觀和特定的遺傳序列的結(jié)合

--------p1-3-3 Germline- specific genes

胚系特異性基因的CGI啟動子被DNMT3B介導(dǎo)的DNA甲基化沉默，在胚胎植入期間體細胞分化開始27,116笆焰。種系基因?qū)NA甲基化缺失非常敏感劫谅，并在Dnmt三敲除小鼠ESCs117、dnmt1缺失的人類成纖維細胞118嚷掠、Dnmt3B突變的小鼠胚胎27,119和與Dnmt3B突變相關(guān)的人類疾病中被抑制120同波。是什么讓只占CGI總數(shù)5%的種系基因的CGI啟動子依賴于DNA甲基化，而大多數(shù)常染色體富含CpG的啟動子仍未甲基化?其中的關(guān)鍵可能是非典型的Polycomb抑制復(fù)合物1 (PRC1)叠国，即已知的PRC1.6未檩，它是小鼠escs121122中種系基因抑制的調(diào)節(jié)因子。該復(fù)合物包含DNA結(jié)合蛋白123粟焊，提供序列特異性靶向冤狡，如MAX121,124, MGA121,122和E2F6(參考文獻125)。此外项棠，PRC1.6與L3MBTL2 (reFs126,127)相關(guān)悲雳，L3MBTL2與H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9A(也稱為EHMT2)126相互作用。小鼠G9a突變的胚胎不能獲得大量種系特異性基因的特異性DNA甲基化119(圖2c)香追。PRC1.6在抑制種系特異性基因方面的許多作用尚不清楚合瓢，例如DNMT3B是如何靶向種系基因的cgi，而DNMT3A卻不是透典。然而晴楔，與大多數(shù)CGI啟動子在植入時抵抗DNA重新甲基化相反，種系CGI已經(jīng)進化出特定序列的方法來招募DNA甲基化機制峭咒，以確保終身的體細胞沉默税弃。

----p1-4 Harnessing the repetitive genome

對轉(zhuǎn)座因子的基因組防御被認(rèn)為是DNA甲基化進化的主要驅(qū)動因素。事實上凑队，哺乳動物基因組中DNA甲基化的主要目標(biāo)不是基因则果，而是轉(zhuǎn)座子，特別是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子漩氨。在小鼠和人類基因組中有數(shù)百萬個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝西壮，它們大約占據(jù)了基因組空間的一半130。最活躍的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達是由富含CpG的啟動子控制的叫惊，而DNA甲基化對它們的表達至關(guān)重要轉(zhuǎn)錄沉默款青。這在小鼠Dnmt1敲除胚胎中得到了例證，其中腦內(nèi)A粒子(IAP)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(構(gòu)成了一類進化上仍能在嚙齒動物基因組中積極調(diào)動的年輕逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)被大量解除抑制131(圖3a)赋访。兩個獨立的小鼠遺傳篩選最近發(fā)現(xiàn)了DNMT3C可都，這是一個先前未知的denovo DNMT缓待，在控制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子129,132中具有特定的作用(表1)。DNMT3C最初被注釋為假基因渠牲，起源于muro總科譜系中Dnmt3B基因的串聯(lián)重復(fù)鼠科嚙齒動物的超科旋炒，包括小鼠和大鼠在進化過程中，DNMT3C失去了PWWP結(jié)構(gòu)域签杈，但保持了其ADD和從頭甲基化活性瘫镇。DNMT3A和DNMT3B在兩性的不同發(fā)育環(huán)境中廣泛表達，而DNMT3C的表達僅限于男性胎兒生殖細胞答姥。盡管純合子Dnmt3C-突變小鼠是可以存活的铣除，但雄性的睪丸較小且不能生育(圖3a)。全基因組甲基化分析顯示鹦付，DNMT3C選擇性地甲基化并抑制了進化年輕轉(zhuǎn)座因子的啟動子尚粘，這只占小鼠基因組的1% 129。Dnmt3C突變體的分子表型與種系甲基化輔助因子DNMT3L35突變體和piwi相互作用RNA通路突變體的分子表型相同;匹威- rna相互作用基因組缺乏DNMT3C基因敲长。也許人類PWWP- less DNMT3B亞型與嚙齒動物DNMT3C具有相似的功能;另外郎嫁，小rna導(dǎo)向的DNA甲基化可能在人類中并不以同樣的方式存在，相反祈噪，我們進化出了一種不同的機制來控制轉(zhuǎn)座因子泽铛。除了抑制轉(zhuǎn)座因子的短期效應(yīng)，DNA甲基化也通過誘變脫氨促進其不可逆的基因失活辑鲤。最后盔腔，DNA甲基化可能通過限制具有高度序列相似性的轉(zhuǎn)座子的非等位拷貝之間的重組來支持基因組的穩(wěn)定性。在各種人類癌癥中月褥，染色體重排水平升高和全基因組DNA低甲基化(主要涉及轉(zhuǎn)座因子)之間的正相關(guān)支持了這種可能性140弛随。此外，在減數(shù)分裂期間吓坚，DNA甲基化可能限制轉(zhuǎn)座因子參與同源依賴的搜索和重組141撵幽。需要指出的是，DNA甲基化不僅可以通過靶向分散的轉(zhuǎn)座子重復(fù)礁击，還可以通過靶向端粒、著絲粒和著絲粒間的串聯(lián)衛(wèi)星重復(fù)來發(fā)揮基因組穩(wěn)定性保護功能(見別處綜述142)逗载。與體內(nèi)情況形成鮮明對比的是哆窿，除IAPs外，轉(zhuǎn)座因子在構(gòu)成性DNA甲基化缺陷的小鼠ESC模型中沒有重新激活厉斟，它們的上調(diào)僅在Dnmt1敲除或Dnmt三敲除細胞中溫和挚躯。然而，通過有條件地觸發(fā)DNA甲基化的消融擦秽，最近的獨立研究表明码荔，包括IAPs在內(nèi)的幾類轉(zhuǎn)座因子確實在DNA甲基化停止后被重新激活145 - 147漩勤。在這一初始反應(yīng)之后，組蛋白甲基化恢復(fù)了低甲基化基因組的長期轉(zhuǎn)錄沉默缩搅。根據(jù)轉(zhuǎn)座因子的種類越败，沉默涉及H3K9me3、H3K27me3或兩者的結(jié)合(圖3c)硼瓣。矛盾的是究飞，當(dāng)Dnmt1的DNA靶向輔助因子UHRF1被移除時，Dnmt1有條件刪除后的IAP重新激活的初始爆發(fā)并沒有被觀察到(參考146)堂鲤。這種差異的基礎(chǔ)已經(jīng)從遺傳學(xué)上剖析過:在Dnmt1突變體中亿傅，抑制復(fù)制后DNA甲基化的維持最初會產(chǎn)生過量的半甲基化DNA，短暫地延長UHRF1在DNA上的駐留時間瘟栖，從而抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1)的募集葵擎。H3K9三甲基化和IAPs沉默的催化作用(圖3d)。經(jīng)過較長時間的培養(yǎng)和半甲基化DNA的逐漸稀釋半哟，基于uhrf1的組蛋白甲基化抑制被緩解坪蚁，setdb1介導(dǎo)的沉默被激活。有趣的是镜沽，半甲基化DNA的積累在體內(nèi)特定的發(fā)育環(huán)境中自然發(fā)生146敏晤。這是否導(dǎo)致IAP重新激活取決于UHRF1的核可用性，例如在小鼠胎盤中缅茉。這種情況不會發(fā)生在早期胚胎或遷移的原始生殖細胞(PGCs)中嘴脾，在這些細胞中，UHRF1隔離在細胞質(zhì)中蔬墩，不能通過H3K9甲基化來抵消setdb1介導(dǎo)的抑制146

----p1-5 The puzzling case of gene bodies

基因體中DNA甲基化的富集提出了一個悖論:一方面译打，基因體甲基化在真核生物中高度保守，比轉(zhuǎn)座因子保守的多拇颅，這表明它具有重要的功能1,2奏司。另一方面，DNA甲基化具有誘變作用樟插，那么為什么它在編碼序列中如此突出呢?重要的是韵洋，基因體DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄正相關(guān)29,148,149，因此黄锤，其作用與基因沉默無關(guān)搪缨。對于基因體中DNA甲基化的功能，人們提出了兩種假說:一是它有助于轉(zhuǎn)錄延伸和/或共轉(zhuǎn)錄剪接鸵熟，二是它抑制基因內(nèi)隱啟動子副编。相對于內(nèi)含子(29,150)，DNA甲基化在外顯子上富集流强，并可能影響Pol II的加工能力痹届，并通過此影響剪接呻待。核小體在外顯子上也富集，而從頭DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性需要組蛋白結(jié)合队腐，這可以解釋在外顯子上DNA甲基化富集蚕捉。一些研究表明，DNA甲基化影響剪接和基因表達香到，而不是反之鱼冀。在人類CD45基因上，CCCTC結(jié)合因子(CTCF)減緩了第5外顯子的Pol II延伸率悠就，從而促進了其包含;DNA甲基化阻止CTCF結(jié)合千绪，從而導(dǎo)致外顯子排除154。相比之下梗脾，在其他位點荸型，DNA甲基化可以通過招募MeCP2促進外顯子包含(reF.155)，這與觀察結(jié)果一致炸茧，替代外顯子的平均DNA甲基化水平低于組成外顯子151瑞妇。此外，異染色質(zhì)蛋白1可以通過將剪接因子招募到甲基化DNA156包裹的H3K9me3修飾的核小體上來調(diào)節(jié)外顯子包涵體梭冠。然而辕狰，這些機制只能解釋一部分可選剪接事件。第二個假設(shè)——DNA甲基化會抑制基因內(nèi)啟動子——有很多吸引人的原因控漠。首先蔓倍，這與DNA甲基化作為轉(zhuǎn)錄抑制因子是一致的。此外盐捷，如上所述(圖1b)偶翅， DNA從頭甲基化機制通過與H3K36me3結(jié)合而被招募到DNA上，這可以防止在面包師酵母中使用隱蔽的啟動子157碉渡。的確聚谁，基因內(nèi)cgi的甲基化抑制了啟動子的活性，在哺乳動物中滞诺，差異甲基化可以以組織特異性和細胞類型特異性的方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始158形导。然而，從小鼠到人類铭段，基因內(nèi)cgi通常是保守的骤宣，而且更可能是替代啟動子而不是非法的、隱秘的啟動子序愚。最近一項對小鼠ESCs的研究表明，DNMT3B介導(dǎo)的基因體甲基化限制了H3K36me3下游隱啟動子的活性(reF.159)等限。雖然這一發(fā)現(xiàn)很吸引人爸吮，但觀察到的效果芬膝，雖然在統(tǒng)計上很顯著，只發(fā)生在細胞群中很小比例的細胞形娇。此外锰霜，Dnmt三重敲除的ESCs并不像Dnmt3B單突變細胞那樣抑制基因內(nèi)隱啟動子。需要更多的功能分析來確認(rèn)DNA甲基化在其中的作用抑制隱藏的啟動子桐早，特別是在小鼠ESCs以外的細胞類型中癣缅，其中DNA甲基化不需要細胞活力和其他安全措施可能在基因體中。綜上所述哄酝，上述兩種假設(shè)都是合乎邏輯和合理的友存，并不必然相互排斥。在這兩種情況下陶衅，DNA甲基化似乎至多是一個微調(diào)器屡立，因為基因體甲基化的丟失不會導(dǎo)致劇烈的分子表型。未來的工作可能會揭示隱藏的機制和/或功能搀军，這將有助于解釋基因體中高度保守的DNA甲基化流行膨俐。

P2: Methylation patterning in development

哺乳動物發(fā)育過程中DNA甲基化重編程的發(fā)現(xiàn)是在30多年前。然而,直到全-亞硫酸氫基因組測序的出現(xiàn),DNA甲基化模式可以評估與單核苷酸決議,,最近,使用少量的細胞(補充箱2)罩句。隨后,技術(shù)已經(jīng)開發(fā)評估5 mc的氧化形式相同的精度焚刺。在本節(jié)中，我們將描述這些技術(shù)在DNA甲基化發(fā)展過程中所提供的最新微妙發(fā)現(xiàn)和修正的見解门烂。

----p2-1 Early embryos and the germlines

哺乳動物表觀遺傳重編程的傳統(tǒng)觀點認(rèn)為乳愉，在早期胚胎和種系發(fā)育期間，DNA甲基化的廣泛消失诅福。這可能是在重要的發(fā)育階段獲得表觀遺傳可塑性所必需的匾委，但也限制了獲得性外突變的遺傳。然而氓润，在早期胚胎發(fā)生和種系發(fā)育中赂乐，DNA甲基化重編程的機制有關(guān)鍵的區(qū)別，盡管在這兩種情況下咖气，目前已經(jīng)清楚挨措，該過程既不是完全的，也不是完全線性的:有限數(shù)量的序列可以抵抗DNA甲基化損失崩溪，并且在這個過程中可能發(fā)生重新的DNA甲基化浅役。

--------p2-1-1 Global passive and active demethylation and local de novo methylation

全基因組DNA去甲基化一直是一個有爭議的研究領(lǐng)域。在生殖系重編程中伶唯，PGCs161,162中生殖細胞身份的獲得伴隨著兩步去甲基化觉既。第一階段包括作為默認(rèn)路徑的大部分基因組被動去甲基化163 - 165。接下來是tet1依賴和tet2依賴的去甲基化，主要影響印跡位點和種系特異性基因(圖4a)瞪讼，與小鼠PGC核中5hmC的出現(xiàn)相一致164 - 166钧椰。在受精后的重編程過程中，胚胎在向多能性發(fā)展的過程中符欠，失去了從卵母細胞和精子遺傳的配子特異性DNA甲基化模式;這也發(fā)生在兩個階段嫡霞。在小鼠單細胞階段的胚胎(受精卵)中，TET3介導(dǎo)的5hmC和5mC缺失的共同出現(xiàn)表明希柿，父基因組最初被TET3主動去甲基化(reFs167-169);隨后诊沪，由于卵母細胞提供的維持酶DNMT1在隨后的細胞分裂中被排除在細胞核之外，兩個親代基因組將經(jīng)歷一輪被動的曾撤、依賴于DNA復(fù)制的DNA甲基化稀釋過程端姚。該模型受到最近三次全基因組亞硫酸氫鹽測序分析的挑戰(zhàn)，這三次全基因組測序分析是對兩個小鼠品系雜交胚胎進行的(以推斷可用的單核苷酸多態(tài)性的親本特異性)盾戴，并結(jié)合全基因組5hmC定位寄锐，這表明母體甲基組在受精卵171 - 173中也經(jīng)歷了有限的tet3依賴性氧化。其他研究也表明尖啡，大多數(shù)合子DNA甲基化丟失獨立于復(fù)制174橄仆，在父基因組，這可能通過一種不清楚的機制以tet3獨立的方式發(fā)生m174,175衅斩。盡管人類的數(shù)據(jù)比較有限盆顾，但它們表明，通常情況下發(fā)生了類似的動態(tài)變化畏梆，只是有一些物種特有的差異您宪。最初的快速去甲基化也主要影響人類胚胎的父親基因組，但它發(fā)生在受精到雙細胞階段奠涌，而它在小鼠的單細胞階段完成176 - 178宪巨。然后，整個基因組的DNA甲基化逐漸消失溜畅，直到囊胚期捏卓，盡管與小鼠相比，人類母體基因組的DNA甲基化水平較高179慈格。單細胞全基因組亞硫酸氫鹽測序發(fā)現(xiàn)怠晴，人類胚胎基因組在進行全基因組去甲基化的同時，DNA從頭甲基化普遍存在:首先是單細胞階段的父系基因組浴捆，然后是八細胞階段的全基因組蒜田，與胚胎基因組激活相一致179，主要針對轉(zhuǎn)座因子选泻。在小鼠發(fā)育過程中冲粤，一些從頭DNA甲基化也可能與胚胎或種系基因組的整體去甲基化同時發(fā)生美莫。事實上，在父合子基因組中獲得5hmC之前5mC就已經(jīng)丟失174;因此色解，必須在這個時間窗內(nèi)發(fā)生DNA重新甲基化茂嗓，為TET酶氧化提供5mC餐茵。類似地科阎，在活躍的種系去甲基化過程中，TET1可能有助于維持低甲基化狀態(tài)忿族，以應(yīng)對虛假的DNA重新甲基化事件180锣笨。總之道批，在胚胎和種系的DNA甲基化清除過程中错英，TET的主要作用可能是防止異位DNA甲基化，而不是驅(qū)動主動去甲基化隆豹。

--------p1-3-1 Methylation reprogramming and the biological implications of resisting it

雖然胚胎和種系去甲基化是全局的椭岩，但在這兩個過程的末尾仍存在大量的DNA甲基化。這一觀察結(jié)果提出了存在代際表觀遺傳甚至跨代際表觀遺傳的有趣可能性璃赡。在植入前胚胎的內(nèi)細胞群中判哥，小鼠171和人類179中大約20%的cpg保留配子遺傳的甲基化(圖4a)。這些明顯地映射到ICRs碉考，正如預(yù)期的塌计，從基因組印記的代際性質(zhì)，這與序列特異性的DNA去甲基化抗性通過krabzfp招募KAP1 (refs111,1131,114)相連侯谁。然而锌仅，總的來說，icr只占基因組的很小一部分墙贱。除了這些經(jīng)典的icr热芹，有數(shù)百種“瞬時”甲基化印跡:這些主要遺傳自卵母細胞，維持母體特異性DNA甲基化直到囊胚期惨撇，可能通過krabzfp依賴的保護伊脓，類似于經(jīng)典的ICRs101,115，并在植入后通過DNA去甲基化或再甲基化失去它101,176,179串纺。這一現(xiàn)象可能在人類中尤其普遍丽旅，在植入前，母親基因組的DNA甲基化保存明顯高于父親基因組纺棺，植入后也是如此榄笙，只存在于胎盤組織130179。Zdbf2基因位點的瞬時印記在小鼠和人類中都是保守的祷蝌，研究表明茅撞，父系等位基因的瞬時低甲基化可以通過一系列下游表觀遺傳變化導(dǎo)致長期的印記，影響出生后的大小182,183(圖4b)。未來的工作將需要評估其他短暫印記是否有發(fā)展作用米丘。囊胚中剩余配子甲基化的大部分與單拷貝序列無關(guān)剑令，而是與轉(zhuǎn)座因子有關(guān)。在小鼠中拄查，IAP類的Y young逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對植入前去甲基化尤其耐藥吁津。在人類囊胚中，在進化初期和潛在活躍的轉(zhuǎn)座因子上也觀察到最高的DNA甲基化保留堕扶，特別是人類特有的SINE- VNRT-Alu因子178碍脏。有跡象表明，DNA甲基化通過krabzfp介導(dǎo)的序列特異性招募KAP1 (reF.186)以類似于icr中KAP1的選擇性DNA結(jié)合的方式被保留稍算。krabzfps需要時間來匹配最近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座因子187典尾，因此最近的IAP因子通常在小鼠品系之間具有多態(tài)性，在植入前發(fā)育期間對DNA甲基化重編程不具有抗性188糊探。與植入前發(fā)育相比钾埂，種系去甲基化波更為廣泛。在小鼠胚胎發(fā)生的第13.5天科平，PGCs僅表現(xiàn)出6-8%的甲基化CpGs171(圖4a)褥紫。在懷孕9周后，類似的基礎(chǔ)水平仍保留在人類胎兒生殖細胞中189,190匠抗。與胚胎發(fā)育相反故源，icr在發(fā)育PGCs時發(fā)生去甲基化，這是在雄性和雌性生殖系分化過程中獲得性別特異性DNA甲基化模式的先決條件汞贸。與植入前發(fā)育中的甲基化重編程類似绳军，種系DNA甲基化的保留主要見于年輕的和潛在有害的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。在小鼠中矢腻，這包括內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒1類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(ERV1)的IAPs和長末端重復(fù)元件161,191门驾。在人類中，sin - VNRT-Alu (SV A)元素和長散布核元素(LINE)家族的人類特定元素與基因組的其他部分相比多柑，以及與靈長類譜系中分布更廣泛奶是、因此更早的較老的LINE類型相比，仍存在部分甲基化竣灌。由于難以定位基因組中的重復(fù)元件聂沙，尚不清楚相同的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝是否同時抵抗胚胎和種系去甲基化，或者它們是否代表不同的元件集初嘹。因此及汉，是否年輕的轉(zhuǎn)座因子有助于表觀遺傳尚不清楚。然而屯烦，盡管非常罕見坷随，一些單拷貝序列也逃脫了胚系DNA甲基化重編程小鼠和人類;有趣的是房铭，這些序列在兩個物種之間顯示出非常低的序列水平和同位保守。更有趣的是温眉，在胚胎甲基化重編程過程中缸匪，人類生殖系逃逸基因序列的DNA甲基化通常也不會被清除。這些稀疏序列是否可以作為表觀遺傳的載體是一個誘人的可能性类溢。

----p2-2 The de novo DNA methylation programme

在PGCs中進行重編程后凌蔬，性別特異性的DNA甲基化模式在男性和女性種系中建立。配子體發(fā)育結(jié)束時豌骏，精子基因組CpG甲基化率約為80%龟梦，基因組分布與體細胞相似，但DNA甲基化率略高窃躲。相比之下，卵母細胞基因組的甲基化僅為~50%钦睡，而且?guī)缀踔话l(fā)生在基因體105,171,192(圖4a)蒂窒。卵母細胞的相對低甲基化與DNMT1的細胞質(zhì)保留有關(guān)，DNMT1本身次于由STELLA193蛋白將UHRF1隔離到細胞質(zhì)荞怒。在Stella-突變的卵母細胞中洒琢，DNMT1進入細胞核，導(dǎo)致異位DNA甲基化沉積褐桌，DNA甲基化增加兩倍衰抑，導(dǎo)致女性不育。令人困惑的是荧嵌，這表明DNMT1能夠在卵母細胞中重新發(fā)生DNA甲基化呛踊，但在胚胎細胞中卻不是這樣33。在小鼠和人類中啦撮，卵母細胞DNA甲基化的基因體特異性與從頭DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄的緊密耦合有關(guān)106,177谭网。然而，這兩個物種之間存在著顯著的差異赃春。首先愉择，基因體甲基化嚴(yán)格要求DNMT3L介導(dǎo)小鼠卵母細胞中DNMT3A的刺激192，而DNMT3L在人類卵母細胞中不表達177织中。第二锥涕，在小鼠和人類卵母細胞中，成千上萬的突觸區(qū)顯示出不同的DNA甲基化模式狭吼。這些差異最近被發(fā)現(xiàn)與長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的物種特異性插入有關(guān)层坠，該轉(zhuǎn)座子在卵子發(fā)生期間的轉(zhuǎn)錄水平特別高109。通過定義卵母細胞成熟過程中的新的轉(zhuǎn)錄單位搏嗡，這些元素似乎是發(fā)育和哺乳動物進化過程中卵母細胞甲基化的重要貢獻窿春，也是新的母系印跡位點出現(xiàn)的潛在驅(qū)動因素(圖2b)拉一。年底胚胎重組-在老鼠胚胎4.5天囊胚的內(nèi)細胞團,會形成外胚層然后胚胎組織,和trophoectoderm和原始內(nèi)胚層,造成額外的形成,胚胎組織:胚胎外內(nèi)胚層(ExE)和內(nèi)臟內(nèi)胚層。最近的兩項全基因組分析研究證實旧乞，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層相對于外胚194,195都是低甲基化的(圖4a)蔚润。DNA低甲基化持續(xù)存在于分化的胎盤中，主要來源于ExE細胞196,197尺栖。低甲基化與DNMT3酶與外胚層相比表達降低嫡纠，甚至逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相對低甲基化194。相比之下延赌，ExE和內(nèi)臟內(nèi)胚層中有一類特定的CGI啟動子被甲基化除盏，但外胚層中沒有。與這組啟動子相關(guān)的基因在發(fā)育過程中非常重要:它們的甲基化增加要么反映了在胚胎外組織中抑制它們的需要挫以，要么表明胚胎組織有更嚴(yán)格的機制來防止異常的DNA甲基化和長期沉默者蠕。植入后外胚層基因組的再甲基化非常迅速:體細胞組織水平的DNA甲基化已經(jīng)在小鼠胚胎第6.5天達到(reFs171,198)(圖4a)。這是值得注意的掐松，因為外胚層干細胞仍然是多能性的踱侣，所以在外胚層干細胞中建立的DNA甲基化模式有可能在所有組織中傳播，并維持早期胚胎發(fā)生的表觀遺傳記憶大磺。然而抡句，對小鼠101,197和人類149,199,200的全基因組調(diào)查顯示，不同成人組織之間的DNA甲基化模式存在廣泛而局部的差異杠愧，這表明在組織分化過程中發(fā)生了DNA重新甲基化和去甲基化的微波處理待榔。在小鼠中，大多數(shù)(75%)的組織特異性差異DNA甲基化區(qū)域位于增強子或其他調(diào)控元件上流济，這與研究顯示增強子進行活躍的DNA甲基化轉(zhuǎn)換有關(guān)锐锣，這可能是TET2和組織特異性轉(zhuǎn)錄因子201,202共同作用的結(jié)果(圖4c)。在人類中袭灯，少數(shù)DNA甲基化區(qū)域(<50%)與調(diào)控元件相連;一個大的子集發(fā)現(xiàn)在不明確的區(qū)域刺下，那里的功能相關(guān)性差異的DNA甲基化是不清楚的。小鼠和人類數(shù)據(jù)集之間的一些差異可能是由于人類研究的更大的測序深度199稽荧，這可能允許從數(shù)據(jù)中進行更細致入微的推斷橘茉。大腦在體細胞組織中表現(xiàn)出一種特殊的甲基組。在小鼠和人類中姨丈，DNMT3A203-205產(chǎn)生的CpA甲基化在出生后出現(xiàn)峰值畅卓。事實上，神經(jīng)組織中總CpA的甲基化水平與CpG的甲基化水平大致相當(dāng)蟋恬，但由于CpA是一種更為普遍的二核苷酸翁潘，mCpA的甲基化頻率比mCpG低。最近的研究表明歼争，在年輕小鼠神經(jīng)元的基因體中拜马，MBD蛋白MeCP2與mcc序列結(jié)合渗勘，并且MeCP2結(jié)合在生命后期維持了這些基因的沉默(206,207)(圖4d)。這一機制可以幫助我們理解DNA甲基化俩莽，特別是非CpG甲基化在調(diào)節(jié)神經(jīng)和行為特征中的作用旺坠。未來的研究有望進一步闡明生命早期缺陷DNA甲基化是如何導(dǎo)致神經(jīng)元異常的。表觀基因組編輯可能被證明是探索這些問題的有效途徑208(框2)扮超。

p3 Genetic diseases, epigenetic outcomes

在DNMT和TET基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了疾病相關(guān)的突變取刃。它們對DNA甲基化模式的影響是非常不同的，正如它們的組織和病理表現(xiàn)出刷，從先天性的血液系統(tǒng)癌癥的免疫缺陷綜合征帆焕、生長表型或神經(jīng)變性告私。其他表型重疊的綜合征與已知的基因有關(guān)究恤，但也與那些在DNA甲基化和去甲基化方面具有未知功能的基因有關(guān)傀缩。DNA甲基化途徑中基因突變的特性極大地豐富了我們對基于DNA甲基化的基因調(diào)控的復(fù)雜性和特異性的理解。

----p3-1 DNMT1 and neurological disorders

DNMT1的雜合突變已在一系列常染色體顯性形式的進行性認(rèn)知和行為惡化中被確認(rèn)屁柏，包括遺傳性感覺自主神經(jīng)病變1E伴癡呆和聽力損失(HSNA1E;OMIM 614116)209和常染色體顯性小腦共濟失調(diào)啦膜、耳聾和嗜睡(ADAC- DN;OMIM 604121)210(表1)。HSNA1E的平均發(fā)病年齡在37歲左右淌喻，以聽力和感覺喪失為最初癥狀，隨后是認(rèn)知功能下降雀摘、共濟失調(diào)和腦萎縮211裸删。平均預(yù)期壽命為50歲，癡呆癥是發(fā)病率的主要驅(qū)動因素阵赠。值得注意的是涯塔，所有DNMT1突變都發(fā)生在RFTS區(qū)域，HSNA1E突變聚集在該區(qū)域的氨基端和中間部分清蚀，ADAC- DN突變明顯分離到羧基端匕荸。如上所述，RFTS的正確折疊對DNMT1的功能至關(guān)重要52,53枷邪。HSNA1E或ADAC- DN患者的外周血全基因組分析表明榛搔，與未受影響的同胞相比，DNA甲基化的紊亂程度非常溫和东揣，存在基因間區(qū)域的低甲基化和部分CGIs212,213的高甲基化践惑。這些DNA甲基化特征可能被用作可獲得的細胞類型的病理生物標(biāo)記，但它們可能不一定與疾病的腦特異性表現(xiàn)有關(guān)嘶卧。有趣的是尔觉，在基于細胞的過表達分析中，DNMT1蛋白突變的RFTS結(jié)構(gòu)域形成細胞質(zhì)聚集物芥吟，而野生型DNMT1通常是有核的211侦铜。蛋白質(zhì)聚集誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激可導(dǎo)致中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的毒性和年齡依賴性的變性专甩。

----p3-2 DNMT3B and immunodeficiency

免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常(ICF)綜合征(OMIM 602900)是第一個與先天性DNA甲基化缺陷相關(guān)的遺傳疾病214(表1)钉稍。ICF患者患有非典型免疫球蛋白缺乏癥涤躲，會導(dǎo)致復(fù)發(fā)性和經(jīng)常危及生命的感染。典型的ICF診斷包括多輻射染色體1嫁盲、9和16的核型篓叶，與粒間粒衛(wèi)星重復(fù)序列II和III的特異性低甲基化相關(guān)。ICF1是DNMT3B基因的隱性突變羞秤，占ICF病例的絕大多數(shù)缸托。正如預(yù)期的那樣，考慮到Dnmt3B功能缺失突變小鼠模型的致死率33瘾蛋，大多數(shù)ICF1突變導(dǎo)致單個氨基酸替換或缺失俐镐，并被認(rèn)為導(dǎo)致Dnmt3B活性的降低而不是消除。盡管ICF缺乏(僅報道了70例)哺哼，但它與其他三個基因的種系突變有關(guān)佩抹，其產(chǎn)物被認(rèn)為有助于DNA甲基化:鋅指和含有BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)24 (ZBTB24;定義ICF2)，細胞分裂周期相關(guān)蛋白7 (CDCA7;ICF3)和HELLS(編碼LSH;ICF4) 216217取董。有趣的是棍苹，雖然近端粒衛(wèi)星重復(fù)低甲基化是ICF的一個標(biāo)志，但也有ICF類型特異性缺陷茵汰，指向DNMT3B與ZBTB14枢里、CDCA7和LSH218之間差異基因組背景依賴的相互作用。值得注意的是蹂午，具有ICF1的個體表現(xiàn)出生殖系基因和X連鎖基因CGI啟動子的低甲基化栏豺，這與DNMT3B在小鼠發(fā)育過程中靶向這些序列的結(jié)果一致91,116，這表明該靶向可能獨立于ZBTB14豆胸、CDCA7和LSH發(fā)生奥洼。ICF2、ICF3和ICF4與ICF1的區(qū)別在于晚胡，中心點α-衛(wèi)星重復(fù)序列和神經(jīng)基因群的低甲基化灵奖。這可能意味著ZBTB14、CDCA7和LSH在DNMT3B之外的DNMT中募集搬泥。最后桑寨，圍繞著絲粒重復(fù)的全身低甲基化是如何導(dǎo)致免疫系統(tǒng)缺陷的仍不清楚。由于胚胎死亡率和/或缺乏免疫球蛋白缺陷忿檩，小鼠ICF綜合征的模型信息不充分219,220尉尾。然而，最近一項對zbtb24突變斑馬魚的研究表明燥透，胚胎發(fā)育期間的中絲粒低甲基化主要通過抑制中絲粒轉(zhuǎn)錄激活先天免疫系統(tǒng)221沙咏。這樣的動物模型可能有助于完善我們對人類ICF病理的機制理解辨图。

----p3-3 DNMT3A, cell growth and malignancies

DNMT3A的雜合子種系突變與早期產(chǎn)前發(fā)病的生長障礙有關(guān)，生長表型取決于突變的性質(zhì)(表1)肢藐。錯義故河，PWWP結(jié)構(gòu)域的功能增益突變在患有小頭畸形侏儒癥m222 -的個體中發(fā)現(xiàn)一組表現(xiàn)為身體和頭部嚴(yán)重而成比例的縮小的病理。這些是功能增益突變吆豹，它會破壞DNMT3A與H3K36me3的相互作用鱼的，并改變其染色質(zhì)結(jié)合的特異性:在攜帶突變個體的成纖維細胞和血細胞中，DNA甲基化的異位獲得在被稱為DNA甲基化谷或谷223,224的大區(qū)域中觀察到痘煤，代價是二價的H3K27me3和H3K4me3修飾凑阶，這些修飾通常是這些區(qū)域的特征，并調(diào)節(jié)重要的發(fā)育基因衷快，例如Hox轉(zhuǎn)錄因子和形態(tài)形成基因宙橱。在小鼠中引入PWWP功能增加突變顯著重現(xiàn)了小頭畸形侏儒癥患者的體型和腦重量的減少以及異位甲基化表型222,225。相比之下蘸拔，雜合子DNMT3A單倍性突變是Tatton-Brown - Rahman綜合征(TBRS;也被稱為DNMT3Aovergrowth綜合征;OMIM 602729)DNMT3A基因發(fā)生TBRS突變师郑，包括PWWP結(jié)構(gòu)域(功能獲得突變的上游)、ADD結(jié)構(gòu)域和MTase結(jié)構(gòu)域调窍。這些突變對DNA甲基化模式的影響尚未確定宝冕，盡管DNMT3A功能增益突變體中高甲基化的大基因組結(jié)構(gòu)域在TBRS222個體中似乎沒有受到影響〉巳考慮到DNMT3A功能缺失導(dǎo)致小鼠各種組織中的干細胞增殖227,228,DNMT3A單倍性不足可能通過增加組織中的細胞數(shù)量猬仁，進而增加機體大小，促進TBRS的過度生長先誉。相反，DNMT3A功能的獲得可能有利于干細胞的分化而不是增殖的烁，進而減少器官和身體的大小褐耳。在全基因組關(guān)聯(lián)研究中，DNMT3A位點與自然高度變異密切相關(guān)229渴庆，指出了DNMT3A在人類體型生理學(xué)中的重要作用铃芦。最后，體細胞DNMT3A突變與未成熟骨髓細胞的增殖增強和成人血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展有關(guān)襟雷。在15-35%的急性髓系白血病(AML;OMIM 601626)刃滓，絕大多數(shù)是MTase域的精氨酸882 (R882)的錯義突變。R882突變對野生型DNMT3A四聚體的形成有顯性的負面影響耸弄，從而在體外降低了80%的酶的甲基化活性230咧虎。因此，在AML231發(fā)病之前计呈，CpG密集區(qū)域的特定位點觀察到非常集中但全基因組范圍內(nèi)的低甲基化砰诵。二價CGI啟動子的高甲基化也有報道征唬，但這是AML進展的結(jié)果，而不是原因茁彭，繼發(fā)于惡性髓系細胞的快速細胞增殖总寒。有趣的是，種系R882突變也存在理肺，并導(dǎo)致TBRS232患者的早發(fā)性AML摄闸。

----p3-4 Hydroxymethylation by TET2 and cancer

1）雖然DNMT3A活性的體細胞喪失在AML中相當(dāng)常見，但TET2突變更常見的原因是血液系統(tǒng)惡性腫瘤
2）TET2功能的恢復(fù)可以逆轉(zhuǎn)白血病妹萨，進一步支持該酶在疾病病因?qū)W中的致病作用年枕。
3）5hmC修飾可能是惡性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)住?br> 4）與DNA甲基化和去甲基化因子突變相關(guān)的疾病提供了對這些蛋白質(zhì)功能的微妙理解，超出了功能喪失研究所能實現(xiàn)的眠副。對這些領(lǐng)域的持續(xù)研究有望帶來癌癥和遺傳疾病的治療突破画切。

Conclusions and future perspective

自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)DNMT1以來，盡管在理解DNA甲基化機制和模式方面取得了重大進展囱怕，但仍有許多未知霍弹。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展和從不同系統(tǒng)的研究中獲得的知識，哺乳動物DNA甲基化研究的未來有望有令人興奮和影響深遠的發(fā)現(xiàn)娃弓。