根據(jù)同源性及催化機(jī)制的不同，可以將位點(diǎn)特異整合酶分為２類:
酪氨酸類整合酶：Cre/Loxp搬泥、FLP桑寨、P1噬菌體等；
絲氨酸類整合酶：PhiC31忿檩、R4尉尾、Tn4等；
有研究表明燥透，酪氨酸類整合酶的整合效率低于絲氨酸類整合酶代赁。

鏈霉菌噬菌體PhiC31整合酶是一種位點(diǎn)特異整合酶（Site-specific recombinase, SSR），其能夠精確并單向的促進(jìn)attP位點(diǎn)與attB位點(diǎn)的重組兽掰，是繼Cre/Loxp、FLP之后又一個(gè)倍受關(guān)注的位點(diǎn)特異整合酶徒役，該整合酶已經(jīng)成為基因治療孽尽、轉(zhuǎn)基因研究等領(lǐng)域的常用技術(shù)手段。
技術(shù)特點(diǎn)：φC31 整合酶系統(tǒng)在促進(jìn)DNA鏈之間位點(diǎn)的特異重組時(shí)忧勿，不需要借助外援能量或輔助因子杉女，不僅能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)的特異整合瞻讽，而且具有很高的整合效率。具有介導(dǎo)外源基因整合效率高熏挎、勝任大片段基因整合速勇、整合的外源基因可長(zhǎng)期高效表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。

一坎拐、序列特征

研究表明烦磁，attB 和attP 最小活性序列長(zhǎng)度分別為34bp 和39 bp

attB：5'- GTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCG -3'
attP：5'- CCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGG -3'

• image.png

二、工作機(jī)制

整合酶phiC31識(shí)別到attP和attB后會(huì)分別從兩序列的中心位置TTG后的堿基開始切割雙鏈DNA并旋轉(zhuǎn)180°哼勇，之后再連接起來(lái)后形成36bp的attL和37bp的attR都伪。由于phiC31整合酶具有attP和attB最小活性序列短， DNA裝載能力強(qiáng)积担，以及異形序列attP和attB交換整合后形成attL和attR不會(huì)被phiC31識(shí)別催化發(fā)生再次整合等突出優(yōu)勢(shì)陨晶，該系統(tǒng)已經(jīng)在包括植物、哺乳動(dòng)物帝璧、昆蟲等多個(gè)物種的位點(diǎn)特異整合研究中得到廣泛的應(yīng)用先誉，并在基因操作和遺傳工程研究中發(fā)揮了重要的作用，成為開展基因操作的強(qiáng)有力工具的烁。

PhiC31 integrase

三褐耳、 整合結(jié)果

• 當(dāng)att位點(diǎn)位于不同的DNA序列中時(shí)，PhiC31 位點(diǎn)特異整合酶會(huì)促進(jìn)att位點(diǎn)間的整合撮躁；
• 當(dāng)att位點(diǎn)位于同一個(gè)DNA序列中時(shí)漱病，在PhiC31 位點(diǎn)特異整合酶的作用下，att位點(diǎn)間會(huì)發(fā)生整合把曼，進(jìn)而發(fā)生基因刪除或者倒置杨帽。

究竟是刪除還是倒置，跟attB與attP序列的方向有關(guān)｀途Ｗ⒂！

位點(diǎn)特異重組酶phiC31能催化其特異識(shí)別序列attB與attP之間發(fā)生不可逆的重組交換叙赚，當(dāng) attB與attP同向排列時(shí)老客，會(huì)在phiC31的催化下發(fā)生重組交換并刪除兩者之間的DNA序列，而當(dāng)attB與attP反向排列時(shí)震叮，會(huì)在phiC31的催化下發(fā)生重組交換并翻轉(zhuǎn)兩者之間的DNA序列胧砰。

（1）如果attB和attP序列反向排列（頭對(duì)頭的形式），則發(fā)生倒置苇瓣。

相向排列的attB和attP

（2）如果attB和attP序列同向排列尉间，則發(fā)生剪切（刪除）。
看步驟2

同向排列的attB和attP

四、改造變異

傳統(tǒng)的phiC31/att system哲嘲，attP存在于宿主贪薪，attB存在于donor。如果宿主和donor都含有兩個(gè)attB/attP眠副，會(huì)怎樣画切？
見上圖
①：插入了3xP3-EGFP-SV40-attB2；
②：由于attB2和attP2同向囱怕，會(huì)刪除掉兩者之間的序列霍弹。
最后會(huì)插入目的元件，而不會(huì)殘留質(zhì)粒骨架sequence在基因組上面光涂。

Frequently Asked Questions

1. 為什么昆蟲用Cre/loxP系統(tǒng)的案例偏少庞萍？
   The Escherichia coli phage P1 Cre/loxP site-specific recombination system is currently the most widely applied tool for genome manipulation in the mouse, but the optimum temperature of 37 ℃ for Cre recombinase (Buchholz et al., 1996) is higher than the optimum temperatures for most insect species (approximately 25-32 ℃), and the Cre/loxP system is thus rarely used in insects compared with other organisms such as mammals.

2. phiC31/att system可以插入多大片段？
   Venken et al. (2006) successfully inserted a transgenic bacterial artificial chromosome
   (BAC) of 133 kb into the intended recipient site and rescued the associated phenotype in D. melanogaster using the phiC31/att system

3. 多數(shù)文獻(xiàn)載體含有單一的attB/attP忘闻，也有含有兩個(gè)attB/attP钝计？有何異同？
   單一PhiC31介導(dǎo)的RMCE存在缺點(diǎn)齐佳，如非預(yù)期的載體骨架整合私恬、donor基因盒被切割以及反向
   置入等問(wèn)題。雙整合酶介導(dǎo)的基因盒交換(dualintegrasecassetteexchange,DICE)可使目的基因精確插入預(yù)定位點(diǎn),而且保持方向不變,規(guī)避了單一PhiC31介導(dǎo)的RMCE缺點(diǎn)炼吴。

參考文獻(xiàn)：

1. 位點(diǎn)特異整合酶φC31的作用機(jī)制及應(yīng)用
2. φC31整合酶系統(tǒng)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性整合研究進(jìn)展
   3.適用于家蠶表達(dá)的特異性整合酶phiC31及其表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)和應(yīng)用的制作方法
3. PhiC31整合酶電穿孔雞成纖維細(xì)胞誘發(fā)位點(diǎn)特異性基因盒交換
   5.Improvement of a phiC31 integrase-based gene delivery system that confers high and continuous transgene expression
4. In vivo site-specific integration of transgene in silkworm via PhiC31 integrase-mediated cassette exchange