單細(xì)胞 RNA-seq 數(shù)據(jù) - 計(jì)數(shù)矩陣的原始數(shù)據(jù)

根據(jù)所使用的文庫(kù)制備方法特铝，RNA序列(也稱(chēng)為讀序列或標(biāo)簽)將從轉(zhuǎn)錄本的3端(或5端)(10X Genomics, cell -seq2, Drop-seq, inDrops)或全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本(Smart-seq)中獲得移层。

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圖片來(lái)源： Papalexi E 和 Satija R. 探索免疫細(xì)胞異質(zhì)性的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序，Nature Reviews Immunology 2018 (https://doi.org/10.1038/nri.2017.76)

針對(duì)感興趣的生物學(xué)問(wèn)題選擇不同的方法卓囚。下面列出了這些方法的優(yōu)點(diǎn)：

• 3'（或 5'）端測(cè)序：
  • 通過(guò)使用特異性的分子標(biāo)識(shí)符將生物學(xué)重復(fù)與擴(kuò)增 (PCR) 重復(fù)區(qū)分開(kāi)來(lái)進(jìn)行更準(zhǔn)確的量化
  • 測(cè)序能夠獲得更多細(xì)胞數(shù)亿卤，可以更好地識(shí)別細(xì)胞亞群類(lèi)型
  • 每個(gè)細(xì)胞的測(cè)序成本低
  • 最佳的測(cè)序結(jié)果大于10000 個(gè)細(xì)胞
• 全長(zhǎng)測(cè)序：
  • 檢測(cè)異構(gòu)體水平中的表達(dá)差異
  • 鑒定等位基因特異性表達(dá)差異
  • 對(duì)較少數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行更深入的測(cè)序
  • 非常適合細(xì)胞數(shù)量少的樣品

3 '端測(cè)序與全長(zhǎng)測(cè)序需要進(jìn)行許多相同的分析步驟生百，但 3' 端測(cè)序來(lái)越受歡迎肋坚，在分析中包含更多步驟。因此几苍，我們將詳細(xì)分析來(lái)自這些 3' 端測(cè)序的數(shù)據(jù)翻屈，主要是基于液滴的方法（inDrops、Drop-seq妻坝、10X Genomics）伸眶。

3' 端reads（所有基于液滴的方法）

對(duì)于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的分析，了解每個(gè)reads中存在哪些信息以及我們?nèi)绾卧诜治鲋惺褂盟呛苡袔椭摹?/p>

對(duì)于3 '端測(cè)序方法來(lái)說(shuō)刽宪，從同一轉(zhuǎn)錄本的不同分子中讀取的信息厘贼，只會(huì)從轉(zhuǎn)錄本的3 '端讀取，因此序列相同的可能性很大纠屋。然而涂臣，在文庫(kù)制備過(guò)程中的PCR步驟也可以產(chǎn)生read 復(fù)制盾计。為了確定一個(gè)reads是生物的還是技術(shù)上的重復(fù)售担，這些方法使用獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符(UMIs)。

• 與讀出不同的UMI映射到相同的轉(zhuǎn)錄從推導(dǎo)不同的分子和生物是重復(fù)-每次讀取應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)署辉。
• 具有相同 UMI 的讀取源自相同的分子并且是技術(shù)重復(fù) - UMI 應(yīng)折疊以計(jì)為單個(gè)讀取族铆。
• 在下圖中，ACTB 的讀數(shù)應(yīng)折疊并計(jì)為單個(gè)讀數(shù)哭尝，而 ARL1 的讀數(shù)應(yīng)計(jì)算每個(gè)讀數(shù)哥攘。
• 映射到相同轉(zhuǎn)錄本的不同UMIs的Reads來(lái)自不同的分子，是生物重復(fù)——每個(gè)Reads都應(yīng)該被計(jì)數(shù)。
• 具有相同UMI的讀取來(lái)自于相同的分子逝淹，并且在技術(shù)上是重復(fù)的——這些UMI應(yīng)該被折疊以算作一個(gè)單獨(dú)的reads耕姊。

• 在下圖中，ACTB的reads應(yīng)該被折疊并作為單個(gè)reads計(jì)算栅葡，而ARL1的reads應(yīng)該分別計(jì)算茉兰。

  
  
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圖片來(lái)源：從 Macosko EZ 等人修改。使用納升液滴對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高度平行的全基因組表達(dá)分析欣簇，cell 2015 (https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002)*

所以我們需要跟蹤 UMI规脸，但是我們還需要什么信息來(lái)正確量化我們樣本中每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)基因的表達(dá)呢? 無(wú)論液滴方法是什么，在細(xì)胞水平上進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩慷夹枰韵聴l件：

• 樣本索引：確定reads來(lái)自于哪個(gè)樣本
  • 在文庫(kù)準(zhǔn)備期間添加 - 需要記錄
• 細(xì)胞barcode：確定reads源自哪個(gè)細(xì)胞
  • 每種文庫(kù)制備方法都有一個(gè)在文庫(kù)制備過(guò)程中使用的細(xì)胞條形碼庫(kù)
• 唯一分子標(biāo)識(shí)符 (UMI)：確定reads來(lái)自于哪個(gè)轉(zhuǎn)錄本分子
  • UMI 將用于折疊 PCR 重復(fù)序列
• 測(cè)序 read1： Read1 序列
• 測(cè)序 read2： Read2 序列

例如熊咽，當(dāng)使用 inDrops v3 文庫(kù)制備方法時(shí)莫鸭，以下表示如何在四次reads中獲取所有信息：

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圖片來(lái)源： Sarah Boswell(https://scholar.harvard.edu/saboswell)，HMS 單細(xì)胞測(cè)序核心主管

• R1（61 bp read 1）：read序列（紅色頂部箭頭）
• R2（8 bp read索引 1 (i7)）：細(xì)胞條形碼 - 細(xì)胞read源自（紫色頂部箭頭）
• R3（8 bp read索引 2 (i5)）：樣本/文庫(kù)索引 - 樣本read源自（紅色底部箭頭）
• R4（14 bp read 2）：read 2 和剩余的細(xì)胞條形碼和 UMI - 轉(zhuǎn)錄read源自（紫色底部箭頭）

對(duì)于不同的基于液滴的 scRNA-seq 方法横殴，scRNA-seq 的分析工作流程是相似的被因，但它們之間的 UMI、細(xì)胞 ID 和樣本索引會(huì)有所不同衫仑。例如氏身，下面是 10X 序列讀取的示意圖，其中索引惑畴、UMI 和條形碼的放置方式不同：

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圖片來(lái)源： Sarah Boswell(https://scholar.harvard.edu/saboswell)蛋欣，HMS 單細(xì)胞測(cè)序核心主管*

單細(xì)胞 RNA-seq 工作流程

scRNA-seq 方法將確定如何從測(cè)序讀數(shù)中解析條形碼和 UMI。因此如贷，盡管一些特定步驟會(huì)略有不同陷虎，但無(wú)論使用何種方法，整個(gè)工作流程通常都會(huì)遵循相同的步驟杠袱。一般工作流程如下圖所示：

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圖片來(lái)源：醫(yī)學(xué)博士 Luecken 和 FJ 的 Theis尚猿。當(dāng)前單細(xì)胞 RNA-seq 分析的最佳實(shí)踐：教程，Mol Syst Biol 2019（doi：https://doi.org/10.15252/msb.20188746）*

工作流程的步驟是：

• 計(jì)數(shù)矩陣的生成（特定于方法的步驟）：格式化reads楣富、樣本demultiplexing凿掂、映射和定量
• 原始計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制：過(guò)濾劣質(zhì)細(xì)胞
• 過(guò)濾計(jì)數(shù)聚類(lèi)：基于轉(zhuǎn)錄活性的相似性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)（細(xì)胞類(lèi)型 = 不同的聚類(lèi)）
• 標(biāo)記識(shí)別和簇注釋?zhuān)?/strong>識(shí)別每個(gè)簇的基因標(biāo)記并注釋已知的細(xì)胞類(lèi)型簇
• 下游步驟可選

無(wú)論進(jìn)行何種分析，基于每個(gè)條件的單個(gè)樣本得出的關(guān)于總體的結(jié)論都是不可信的纹蝴。仍然需要生物學(xué)重復(fù)庄萎！也就是說(shuō)，如果您想得出與總體相對(duì)應(yīng)的結(jié)論塘安，而不單是做單個(gè)樣本糠涛。

計(jì)數(shù)矩陣的生成

我們首先討論工作流程的第一部分，即從原始測(cè)序數(shù)據(jù)生成計(jì)數(shù)矩陣兼犯。我們將重點(diǎn)介紹基于液滴的方法使用的 3' 端測(cè)序忍捡，例如 inDrops集漾、10X Genomics 和 Drop-seq。

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測(cè)序后砸脊，測(cè)序設(shè)備將以BCL 或 FASTQ 格式輸出原始測(cè)序數(shù)據(jù)或生成計(jì)數(shù)矩陣具篇。如果reads是 BCL 格式，那么我們需要轉(zhuǎn)換為 FASTQ 格式凌埂。有一個(gè)有用的命令行工具bcl2fastq可以輕松執(zhí)行此轉(zhuǎn)換栽连。

注意：我們不會(huì)在工作流程的這一步進(jìn)行多樣本拆分。您可能對(duì) 6 個(gè)樣本進(jìn)行了測(cè)序侨舆，但所有樣本的讀數(shù)可能都存在于同一個(gè) BCL 或 FASTQ 文件中秒紧。

對(duì)于許多 scRNA-seq 方法，從原始測(cè)序數(shù)據(jù)生成計(jì)數(shù)矩陣將經(jīng)歷類(lèi)似的步驟挨下。

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alevin是一種命令行工具熔恢，用于估計(jì)對(duì)轉(zhuǎn)錄本 3' 端進(jìn)行測(cè)序的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的表達(dá)。umi-tools和zUMI是可以執(zhí)行這些過(guò)程的附加工具臭笆。這些工具結(jié)合了 UMI 的折疊以校正放大偏差叙淌。此過(guò)程中的步驟包括：

1. 格式化reads和過(guò)濾嘈雜的蜂窩barcode
2. 多樣本拆分
3. 映射/偽映射到轉(zhuǎn)錄組
4. 折疊 UMI 和reads的量化

如果使用 10X Genomics 文庫(kù)制備方法，上述所有步驟將通過(guò)Cell Ranger 管道完成愁铺。

1. 格式化reads和過(guò)濾嘈雜的蜂窩barcode

可以使用 FASTQ 文件來(lái)解析細(xì)胞barcode鹰霍、UMI 和樣本barcode。對(duì)于基于液滴的方法茵乱，由于以下原因茂洒，許多細(xì)胞barcode將匹配少量reads（< 1000 次read）：

• 從瀕死細(xì)胞中封裝自由漂浮的 RNA
• 表達(dá)很少基因的簡(jiǎn)單細(xì)胞（紅細(xì)胞等）
• 由于某種原因失敗的細(xì)胞

這些多余的條形碼需要在reads比對(duì)之前從序列數(shù)據(jù)中過(guò)濾掉。為了進(jìn)行這種過(guò)濾瓶竭，為每個(gè)細(xì)胞提取并保存“細(xì)胞條形碼”和“分子條形碼”督勺。例如，如果使用“umis”工具斤贰，信息將添加到每次read的標(biāo)題行智哀，格式如下：

@HWI-ST808:130:H0B8YADXX:1:1101:2088:2222:CELL_GGTCCA:UMI_CCCT
AGGAAGATGGAGGAGAGAAGGCGGTGAAAGAGACCTGTAAAAAGCCACCGN
+
@@@DDBD>=AFCF+<CAFHDECII:DGGGHGIGGIIIEHGIIIGIIDHII#

文庫(kù)制備方法中使用的已知細(xì)胞條形碼應(yīng)該是已知的，未知條形碼將被丟棄荧恍，同時(shí)允許與已知細(xì)胞條形碼的不匹配數(shù)量可接受瓷叫。

2. 多樣本拆分

如果是對(duì)多個(gè)樣本測(cè)序，則該過(guò)程的下一步是對(duì)對(duì)樣本進(jìn)行拆分送巡。這是此過(guò)程的一個(gè)步驟摹菠，不是由“umis”工具處理的，而是由“zUMI”完成的授艰。我們需要解析reads以確定與每個(gè)細(xì)胞相關(guān)的樣本barcode辨嗽。

3. 映射/偽映射到 cDNAs

為了確定read源自哪個(gè)基因世落，reads使用傳統(tǒng) (STAR) 或輕量級(jí)方法 (Kallisto/RapMap) 進(jìn)行比對(duì)淮腾。

4. 折疊 UMI 和 read量化

重復(fù)的 UMI 被折疊糟需，并且只有唯一的 UMI 使用 Kallisto 或 featureCounts 等工具進(jìn)行量化。結(jié)果輸出是一個(gè)按基因計(jì)數(shù)矩陣的單元格：

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圖片來(lái)源：摘自 Lafzi 等人谷朝。教程：?jiǎn)渭?xì)胞 RNA 測(cè)序研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南洲押，Nature Protocols 2018 (https://doi.org/10.1038/s41596-018-0073-y)

矩陣中的每個(gè)值代表源自相應(yīng)基因的細(xì)胞中的read數(shù)。使用計(jì)數(shù)矩陣圆凰，我們可以探索和過(guò)濾數(shù)據(jù)杈帐，只保留更高質(zhì)量的細(xì)胞。