本文來源于哈佛大學(xué)的單細(xì)胞課程系列锦募，在此做一些學(xué)習(xí)邦邦，不當(dāng)之處請(qǐng)指正掀泳。

scRNA-seq/02_SC_generation_of_count_matrix.md at master · hbctraining/scRNA-seq · GitHub

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單細(xì)胞RNA序列數(shù)據(jù)-計(jì)數(shù)矩陣的原始數(shù)據(jù)

根據(jù)所用文庫制備方法的不同履因，RNA序列（也稱為讀段或標(biāo)簽）將從（10X基因組學(xué)丐谋，CEL-seq2，Drop-seq）的3'端（或5'端）獲得轉(zhuǎn)錄本片段或全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（Smart-seq）饲握。

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圖片來源：**** Papalexi E和Satija R.單細(xì)胞RNA測(cè)序探索免疫細(xì)胞異質(zhì)性私杜，《自然評(píng)論免疫學(xué)》（Nature Reviews Immunology）2018（https://doi.org/10.1038/nri.2017.76）

方法的選擇涉及感興趣的生物學(xué)問題蚕键。下面列出了這些方法的優(yōu)點(diǎn)：

• 3'（或5'）端測(cè)序：

• 通過使用獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量，從而將生物學(xué)復(fù)制品與擴(kuò)增復(fù)制品（PCR）復(fù)制品區(qū)分開

• 測(cè)序的細(xì)胞數(shù)量更多衰粹，可以更好地鑒定細(xì)胞類型群體

• 單位成本便宜

• 10,000個(gè)以上的細(xì)胞可獲得最佳結(jié)果

• 全長(zhǎng)測(cè)序：

• 檢測(cè)表達(dá)的同工型水平差異

• 鑒定表達(dá)中的等位基因特異性差異

• 更深層次的測(cè)序锣光，數(shù)量更少的細(xì)胞

• 最適合細(xì)胞數(shù)少的樣品

3'末端測(cè)序需要進(jìn)行與全長(zhǎng)相同的許多分析步驟，但是3'方案越來越流行铝耻，并且在分析中還包含一些其他步驟誊爹。因此，我們的材料將詳細(xì)介紹這3'方案的數(shù)據(jù)分析瓢捉，重點(diǎn)是基于液滴的方法（inDrops频丘，Drop-seq，10X Genomics）泡态。

個(gè)人備注：5'末端測(cè)序可以同時(shí)檢測(cè)VDJ, 分析BCR/TCR的變化搂漠，對(duì)于免疫細(xì)胞分化具有重要幫助。

3'末端讀饶诚摇（包括所有基于液滴的方法）

對(duì)于scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析桐汤，有助于了解每個(gè)讀數(shù)中都包含哪些信息，以及我們?nèi)绾卧谡麄€(gè)分析過程中使用它靶壮。

對(duì)于3'端測(cè)序方法怔毛，源自同一轉(zhuǎn)錄本的不同分子的讀段僅會(huì)源自轉(zhuǎn)錄本的3'端，因此具有相同序列的可能性很高腾降。但是拣度，文庫制備過程中的PCR步驟也可能會(huì)產(chǎn)生重復(fù)讀物。為了確定讀數(shù)是生物學(xué)的還是技術(shù)的重復(fù)螃壤，這些方法使用唯一的分子標(biāo)識(shí)符或UMI蜡娶。

• 具有映射到相同轉(zhuǎn)錄本的不同UMI的讀段來自不同的分子，并且是生物學(xué)上的重復(fù)-每個(gè)讀段均應(yīng)計(jì)數(shù)映穗。

• 具有相同UMI的讀數(shù)來自同一分子窖张，并且是技術(shù)重復(fù)品-UMI應(yīng)該合并起來才能計(jì)為一次讀數(shù)。

• 在下圖中蚁滋，應(yīng)合并ACTB的讀取并將其計(jì)為單個(gè)讀取宿接，而應(yīng)將ARL1的讀取各計(jì)數(shù)。

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圖片來源：****由Macosko EZ等人修改辕录。使用納升微滴對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高度并行的全基因組表達(dá)譜分析睦霎，Cell 2015（https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002）

因此，我們知道我們需要跟蹤UMI走诞，但是還需要什么其他信息來正確量化樣本中每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)基因的表達(dá)副女？無論采用液滴法，在細(xì)胞水平進(jìn)行正確定量都需要以下條件：

• 樣本索引：確定讀取來自哪個(gè)樣本

• 庫準(zhǔn)備過程中添加-需要記錄

• 細(xì)胞條形碼：確定讀取來自哪個(gè)細(xì)胞

• 每種文庫制備方法都有在文庫制備過程中使用的細(xì)胞條形碼庫存

• 唯一分子識(shí)別符（UMI）：確定讀取的是哪個(gè)轉(zhuǎn)錄物分子

• UMI將用于合并PCR重復(fù)項(xiàng)

• 讀取1序列：讀取1序列

• 讀取2序列：讀取2序列

例如蚣旱，當(dāng)使用inDrops v3庫準(zhǔn)備方法時(shí)碑幅，以下內(nèi)容表示如何通過四次讀取來獲取所有信息：

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圖片來源：**** HMS單細(xì)胞測(cè)序核心主管Sarah Boswell

R1（61 bp讀1）：引物序列（紅色頂部箭頭）

• R2（8 bp索引讀取1（i7））：細(xì)胞條形碼-讀取細(xì)胞的來源（紫色頂部箭頭）

• R3（8 bp索引讀取2（i5））：樣本/庫索引-所讀取的樣本源自（紅色底部箭頭）

• R4（14 bp讀取2）：讀取2和剩余的細(xì)胞條形碼和UMI-讀取的轉(zhuǎn)錄本源自（紫色底部箭頭）

對(duì)于不同的基于液滴的scRNA-seq方法戴陡，scRNA-seq的分析工作流程相似，但是UMI沟涨，細(xì)胞ID和樣品索引的解析在它們之間將有所不同恤批。例如，以下是10X序列讀取的示意圖裹赴，其中索引喜庞，UMI和條形碼的放置位置不同：

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圖片來源：**** HMS單細(xì)胞測(cè)序核心主管Sarah Boswell

單細(xì)胞RNA-seq工作流程

scRNA-seq方法將確定如何從測(cè)序讀數(shù)中解析條形碼和UMI。因此棋返，盡管一些特定步驟會(huì)稍有不同延都，但無論采用哪種方法，總體工作流程通常都將遵循相同的步驟睛竣。常規(guī)工作流程如下所示：

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圖片來源：****醫(yī)學(xué)博士Luecken和FJ Theis晰房。單細(xì)胞RNA序列分析中的當(dāng)前最佳實(shí)踐：教程，Mol Syst Biol 2019（doi：https* : //doi.org/10.15252/msb.20188746）*

工作流程的步驟是：

• 計(jì)數(shù)矩陣的生成（特定于方法的步驟）：格式化讀取酵颁，對(duì)樣本進(jìn)行校正，映射和量化

• 原始計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制：劣質(zhì)細(xì)胞的過濾

• 篩選細(xì)胞聚類：基于轉(zhuǎn)錄活性的相似性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類（細(xì)胞類型=不同聚類）

• 標(biāo)記鑒定：鑒定每個(gè)簇的基因標(biāo)記

• 可選的下游步驟

無論進(jìn)行何種分析月帝，基于每種條件的單個(gè)樣本得出的種群結(jié)論都是不可信的躏惋。仍然需要生物替代品！也就是說嚷辅，如果您要得出與總體相對(duì)應(yīng)的結(jié)論簿姨，而不僅僅是單個(gè)樣本。

計(jì)數(shù)矩陣的生成

我們將從討論此工作流程的第一部分開始簸搞，該部分將根據(jù)原始測(cè)序數(shù)據(jù)生成計(jì)數(shù)矩陣扁位。我們將重點(diǎn)介紹基于液滴的方法（如inDrops，10X Genomics和Drop-seq）使用的3'末端測(cè)序趁俊。

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測(cè)序后域仇，測(cè)序設(shè)備將以BCL或FASTQ格式輸出原始測(cè)序數(shù)據(jù)，或生成計(jì)數(shù)矩陣寺擂。如果讀取的是BCL格式暇务，則我們將需要轉(zhuǎn)換為FASTQ格式。有一個(gè)有用的命令行工具bcl2fastq怔软，可以輕松地執(zhí)行此轉(zhuǎn)換垦细。

注意：在工作流程的此步驟中，我們不進(jìn)行多路分解挡逼。您可能已對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行了測(cè)序括改，但所有樣本的讀數(shù)可能全部存在于同一BCL或FASTQ文件中。

對(duì)于許多scRNA-seq方法家坎，從原始測(cè)序數(shù)據(jù)中生成計(jì)數(shù)矩陣都將經(jīng)歷相似的步驟嘱能。

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umis和zUMIs是命令行工具吝梅，用于估計(jì)已對(duì)轉(zhuǎn)錄本的3'端進(jìn)行了測(cè)序scRNA-seq數(shù)據(jù)的表達(dá)。兩種工具都合并了UMI的合并焰檩，以校正放大偏差憔涉。此過程中的步驟包括：

1. 格式化讀取并過濾的細(xì)胞條形碼

2. 校正樣本

3. 映射/偽映射到轉(zhuǎn)錄組

4. UMI和讀數(shù)量化

如果使用10X Genomics庫制備方法，則Cell Ranger流程將用于上述所有步驟析苫。

1.格式化讀取并過濾嘈雜的細(xì)胞條形碼

然后兜叨，F(xiàn)ASTQ文件可用于解析細(xì)胞格條形碼，UMI和樣本條形碼衩侥。對(duì)于基于液滴的方法国旷，由于以下原因，許多細(xì)胞條形碼將匹配少量讀让Ｋ馈（<1000個(gè)讀裙虻）：

• 垂死細(xì)胞中游離浮動(dòng)RNA的包封

• 表達(dá)少量基因的簡(jiǎn)單細(xì)胞（RBC等）

• 由于某種原因而失敗的細(xì)胞格

在讀取比對(duì)之前，需要從序列數(shù)據(jù)中過濾掉這些多余的條形碼峦萎。為了進(jìn)行這種過濾屡久，提取并保存每個(gè)細(xì)胞的“細(xì)胞條形碼”和“分子條形碼”。例如爱榔，如果使用“ umis”工具被环，則信息將以以下格式添加到每次讀取的標(biāo)題行中：

<pre style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; overflow-wrap: break-word !important; box-sizing: border-box !important; background: none 0% 0% / auto repeat scroll padding-box border-box rgba(0, 0, 0, 0);">@HWI-ST808:130:H0B8YADXX:1:1101:2088:2222:CELL_GGTCCA:UMI_CCCT AGGAAGATGGAGGAGAGAAGGCGGTGAAAGAGACCTGTAAAAAGCCACCGN + @@@DDBD>=AFCF+<CAFHDECII:DGGGHGIGGIIIEHGIIIGIIDHII#</pre>

文庫制備方法中使用的已知細(xì)胞條形碼應(yīng)該是已知的，未知的條形碼將被丟棄详幽，同時(shí)允許與已知細(xì)胞條形碼的可接受的不匹配數(shù)筛欢。

2.校正樣本讀取

如果測(cè)序多于一個(gè)樣品，則該過程的下一步是對(duì)樣品進(jìn)行多路分解唇聘。這是該過程的第一步版姑，不是由“ umis”工具處理，而是由“ zUMIs”完成迟郎。我們將需要解析讀取以確定與每個(gè)細(xì)胞相關(guān)的樣本條形碼剥险。

3.映射/偽映射到cDNA

為了確定讀段源自哪個(gè)基因，使用傳統(tǒng)的（STAR）或輕量級(jí)方法（Kallisto / RapMap）對(duì)讀段進(jìn)行比對(duì)宪肖。

4.合并的UMI和讀數(shù)的量化

重復(fù)的UMI被合并炒嘲，并且使用Kallisto或featureCounts之類的工具僅量化唯一的UMI。產(chǎn)生的輸出是按基因矩陣計(jì)數(shù)的細(xì)胞：

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圖片來源：****摘自Lafzi等匈庭。教程：《單細(xì)胞RNA測(cè)序研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南》夫凸，《自然協(xié)議》 2018（https://doi.org/10.1038/s41596-018-0073-y）

矩陣中的每個(gè)值代表源自相應(yīng)基因的細(xì)胞中的讀取次數(shù)。使用計(jì)數(shù)矩陣阱持，我們可以探索和過濾數(shù)據(jù)夭拌，僅保留更高質(zhì)量的細(xì)胞。

本課程由哈佛大學(xué)生物信息學(xué)核心（HBC）的教學(xué)團(tuán)隊(duì)成員開發(fā)。這些是根據(jù)知識(shí)共享署名許可（CC BY 4.0）的條款分發(fā)的開放獲取材料鸽扁，只要注明原始作者和出處蒜绽，就可以在任何介質(zhì)中進(jìn)行不受限制的使用，分發(fā)和復(fù)制桶现。