Zhang, Y., et al. (2019)."Listeria hijacks host mitophagy through a novel mitophagy receptor toevade killing."Nat Immunol.

摘要：細胞通過線粒體自噬來移除受損的線粒體解孙。在這篇文獻中，作者報告了，Lm能夠利用宿主細胞的線粒體自噬來逃避宿主細胞的殺傷艾蓝。Lm通過LLO來誘導宿主細胞的線粒體自噬。NLRX1是NLR家族的成員，含有LC3相互作用區(qū)域（LIR）呻拌，通過LIR直接與LC3結(jié)合。NLRX1與它的LIR模序?qū)τ贚m誘導的線粒體自噬有著重要的作用睦焕。NLRX1缺陷或者是使用一個線粒體自噬抑制劑藐握，由能增加線粒體活性氧的產(chǎn)生，從而抑制Lm的存活垃喊。從機制上講猾普，Lm與LLO能誘導NLRX1的寡聚化，促進LIR模序與LC3的結(jié)合本谜，進而誘導線粒體自噬初家。作者的發(fā)現(xiàn)了NLRX1是一個新的線粒體自噬受體。

背景知識

自噬小體先在線粒體周圍形成，然后與溶酶體溶合溜在，進而誘發(fā)線粒體自噬陌知。線粒體盺 靶點是由線粒體特異性的受體識別的，這種受體含有LIR模體掖肋，它們能招募被LC3修飾的自噬小體仆葡。目前已經(jīng)鑒定出了三個線粒體自噬受體，分號為Nix（BNIP3L）培遵，BNIP3與FUNDC1，它們?nèi)齻€都含有LIR模體登刺，位于線粒體外膜上籽腕。Nix是第1個被報告的參與移除線粒體的受體，它通過誘導羰基氰化物（carbonyl? cyanide）m-chlorophenylhydrazone（CCCP）

或低氧來實現(xiàn)纸俭。BNIP3和FUNDC1對于低氧（hypoxia）誘導的線粒體自噬也有著重要作用皇耗。除了這三個線粒體自噬受體外，PINK1-Parkin也是構(gòu)成線粒體自噬的一個重要機制揍很，而PINK1-Parkin則依賴于線粒體自噬的泛素系統(tǒng)郎楼。PINK1是一個線粒體激酶，當線粒體自噬誘導CCCP時窒悔，PINK1就會參與自噬磷酸化（autophosphorylated）呜袁。活化的PINK1然后就會招募磷酸简珠，泛素阶界，以及E3泛素連接酶Parkin，導致Parkin的活化聋庵，將它從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到受損的線粒體上膘融，促進線粒體自噬。PINK1介導的泛素磷酸化也會招募自噬受體祭玉，例如OPTN與NDP52用于移除受損的線粒體氧映。大多數(shù)的研究已經(jīng)使用CCCP（CCCP，Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone脱货，是一種質(zhì)子載體岛都，強效的線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，促使線粒體內(nèi)膜對H+產(chǎn)生通透性振峻，導致線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的膜電位喪失疗绣，誘導線粒體自噬發(fā)生）或OA（Oligomycin是ATP synthase Fo部分的抑制劑，Antimycin A可以破壞電子傳遞鏈的Q cycle铺韧。兩者都可以破壞氫離子濃度梯度多矮，進而影響線粒體的正常膜電勢。）作為線粒體自噬的觸發(fā)劑。但是塔逃，線粒體自噬觸發(fā)的生理學或病理學機制還不清楚讯壶，哪些分子調(diào)控了線粒體自噬的特異性信號轉(zhuǎn)導也不清楚。Lm是一種胞內(nèi)菌湾盗，還不清楚細菌能否造成宿主的線粒體自噬伏蚊。作者使用了Lm作為模式生物來研究了胞內(nèi)菌誘導宿主的線粒體自噬。結(jié)果確定了Lm能誘導宿主免疫細胞的線粒體自噬格粪，并確定了NLRX1是一種新的躏吊，由Lm誘導的線粒體自噬過程中的線粒體自噬受體。

Parkin是一種E3泛素連接酶帐萎，PINK1是一種泛素激酶比伏，Parkin定位在細胞質(zhì)中，在多數(shù)真核生物中非常保守疆导。PINK1定位于線粒體外膜赁项，是種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Parkin是自身抑制的澈段，需要通過PINK1激活悠菜，激活后可以誘導線粒體缺陷自噬的發(fā)生（一種選擇性形式的自噬），清除細胞內(nèi)的“垃圾廢物”败富。

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Fig1a-mtDNA是指的線粒體內(nèi)DNA悔醋，它的降解程度是判斷mitophagy的程度，從圖中可知兽叮，Lm感染3篙顺，6h時，mitophagy程度逐步增強（mtDNA的降解增多）充择。表型類似于CCCP（線粒體自噬的誘導劑）

Fig1b-TIM23德玫，HSP60逐步降低。TIM23線粒體內(nèi)膜上的蛋白椎麦，HSP60是基質(zhì)蛋白宰僧。這兩個指標是判斷mitophagy的指標，ab圖說明了观挎，Lm感染會誘發(fā)線粒體的自噬琴儿。

Fig1cd-Lm感染后，外源的GFP-LC3與線粒體共定位嘁捷。

Fig1ef-Lm感染后造成，內(nèi)源的LC3與線粒體共定位。cdef圖說明了雄嚣，Lm能誘導宿主細胞的線粒體自噬晒屎。

Fig1gh-用LysoTracker來標記溶酶體喘蟆，發(fā)現(xiàn)感染后，lysosome與mitochondria共定位鼓鲁，這說明了Lm能誘導mitochondria的自噬蕴轨，線粒體確實是被溶酶體降解了。

Fig1ij-電鏡數(shù)據(jù)骇吭，Lm感染或CCCP干預后橙弱，線粒體被自噬小體包裹。Lm能誘導線粒體的減少是通過線粒體自噬實現(xiàn)的燥狰，而非細胞死亡棘脐。

Fig1kmn-THP-1細胞中的自噬情況。

Fig1中的數(shù)據(jù)都是表型數(shù)據(jù)龙致，即發(fā)現(xiàn)了Lm能誘導宿主線粒體自噬蛀缝，接著要找參與這個過程中的某個分子。

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CCCP誘導的線粒體自噬是通過PINK1-Parkin通路實現(xiàn)的净当，當PINK1或Parkin敲低后内斯，CCCP就無法誘導線粒體自噬蕴潦，但是Lm還能誘導線粒體自噬像啼，因此可以說，Lm誘導的線粒體自噬并不涉及這個通路潭苞。附件中的數(shù)據(jù)指出忽冻，Lm感染會降低PINK1的mRNA水平。接著此疹，作者研究了當前已知的線粒體自噬受體與Lm感染的關系僧诚，這三個受體分別為Nix，BNIP3與FUNDC1蝗碎。作者在小鼠PM中分別高低了這3個受體湖笨，發(fā)現(xiàn)Lm仍能誘導線粒體自噬，而CCCP誘導的線粒體自噬則受到了抑制蹦骑，這說明可能還存在著某個受體參與到了Lm誘導的線粒體自噬中慈省。作者隨后就假設存在著某個PRR可以識別線粒體的損傷，參與了LM誘導的線粒體自噬眠菇，并且這種受體有兩個特點边败，一是定位在線粒體上，二是存在著一個LIR模序（它與LC3結(jié)合）捎废。作者通過一個數(shù)據(jù)庫iLIR檢測到了一個蛋白笑窜，即NLRX，NLRX1含有一個LIR模序（位于NACHT結(jié)構(gòu)域中）登疗。

Fig2a-不同物種的NLRX1的保守結(jié)構(gòu)域排截；

Fig2bc-在NOD樣受體（NLRs，NOD-like receptors）中，LRR（C端富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域）通常是彎曲的匾寝，與NLR的其它結(jié)構(gòu)域結(jié)合搬葬，處于一種非活化狀態(tài)。作者使用了野生型的NLRX1（NLRX1-WT）與一個敲除了LRR結(jié)構(gòu)域的突變體（NLRX1-dLRR）來研究NLRX1與LC3的相互作用艳悔。結(jié)果顯示急凰，GST-LC3B都能把這兩個NLRX1拉下來，并且NLRX1-dLRR比NLRX1-WT的結(jié)合能力更強猜年，這說明抡锈，LRR結(jié)構(gòu)域參與了NLRX1的自身抑制。C的數(shù)據(jù)表明乔外，NLRX1能直接與LC3相互作用床三。

Fig3d-說明了LIR對于NLRX1-WT和NLRX1-dLRR和LC3B的結(jié)合有著重要意義。

Fig2ef-NLRX1-dLRR能持續(xù)并強烈地與GFP-LC3共定位杨幼∑膊荆可以發(fā)現(xiàn)，NLRX1-dLRR與LC3結(jié)合的更多差购。

Fig2g-感染了LM后四瘫，LC3與NLRX1的結(jié)合更多。SE-short

exposure欲逃，

Fig2hi-LM感染后找蜜，NLRX1-WT與LC3的結(jié)合更多，這說明NLRX1與LC3的結(jié)合是能過LIR實現(xiàn)的稳析。

FIg2的數(shù)據(jù)說明了洗做，NLRX1有可能是CCCP誘導的線粒體自噬和LM誘導的線粒體自噬的一個受體。接著作者研究了NLRX1在LM感染過程中作用彰居。

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Fig3a-NLRX1敲除小鼠的PM在LM感染后诚纸，mtDNA的變化不大，說明了NLRX1參與LM誘導的線粒體自噬陈惰。

Fig3b-通過ITM23畦徘，HSP60來說明，NLRX1敲除后奴潘，線粒體自噬得到了抑制旧烧，因為那幾個蛋白都沒什么變化。

Fig3c-使用TMRM（判斷線粒體膜電位的指標）來說明了画髓，NLRx1敲除后掘剪，線粒體膜電位下降得很厲害。

Fig3de-電鏡數(shù)據(jù)奈虾，說明了NLRX1敲除后夺谁，被溶酶體吞噬的線粒體數(shù)量下降廉赔，這說明NLRX1參與了線粒體自噬的過程。

Fig3fg-恢復實現(xiàn)匾鸥。向NLRX1敲除的PM中轉(zhuǎn)入NLRX1-dLIR和NLRX1-WT后蜡塌，WT可以恢復LM誘導的自噬。作者提到了附圖中的數(shù)據(jù)勿负，即NLRX1缺陷的PM會部分阻斷CCCP誘導的線粒體自噬馏艾，這可能是因為CCCP是一種廣譜線粒體自噬誘導劑（它還誘導PINK1-Parkin通路），而LM并不會激活PINK1-Parkin通路奴愉。

前人研究指出琅摩，NLRX1在VSV感染過程中參與常規(guī)自噬。NLRX1的缺陷會阻斷VSV誘導IC3I向LC3II轉(zhuǎn)化锭硼，但是在NLRX1敲除的PM中房资，LM卻能誘導LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化，并且有所升高檀头，這可能是因為線粒體自噬缺陷導致的轰异，因為CQ（氯喹，溶酶體抑制劑）處理后的PM也未觀察到這種缺陷導致的LC3II升高暑始〈疃溃基礎水平以及饑餓處理的NLRX1缺陷的PM也不會出現(xiàn)自噬以及LC3II的改變，這說明NLRX1并不參與基礎水平或饑餓誘導的自噬蒋荚。fig3的數(shù)據(jù)說明戳稽，NLRX1是一個新的LC3受體馆蠕，它參與LM和CCCP誘導的線粒體自噬期升。

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Fig4a-NLRX1敲除后，pM中LM含量下降互躬，這說明LM可能會脅持宿主細胞的線粒體自噬來促進自身的生存播赁。

Fig4bc-使用Mdivi-1(一種線粒體融合抑制劑)后，細胞中Lm含量下降吼渡，因此抑制了線粒體融合容为，也就是相當于抑制了線粒體的自噬。而使用了CCCP（這是促進線粒體自噬的誘發(fā)劑）后寺酪，細胞中LM升高坎背。Bc的數(shù)據(jù)說明了，線粒體自噬增強寄雀，LM減少得滤，反之，LM減少盒犹。

Mdivi-1是一個具有選擇性和細胞穿膜性的線粒體分裂抑制劑懂更，抑制了DRP1（發(fā)動蛋白相關GTP酶）和Dynamin 眨业，這是一個可以穿越細胞膜的喹唑酮類化合物，抑制了酵母的Dnm1和人源的Drp1分裂DRPs(發(fā)動蛋白相關GTP酶)沮协，并且高效可逆的誘導線粒體融合進一個巢樣的結(jié)構(gòu)龄捡。細胞外的研究表明mdivi-1通過變構(gòu)調(diào)節(jié)阻斷了Dnm1的ATP酶活性(IC50<10μM)和自組裝。在HeLa細胞和細胞外鼠源肝細胞線粒體配置液中慷暂，Mdivi-1有效地分別抑制了STS和C8-Bid誘導的MOMP（線粒體外膜通透性增加）聘殖。在細胞中，mdivi-1通過抑制線粒體外膜通透性進一步的抑制了細胞凋亡行瑞。大體上就斤，mivi-1代表了一類治療中風，心肌梗死和神經(jīng)退行性疾病的療法

Fig4d-在體實驗蘑辑。

Fig4e-死亡曲線

Fig4f-使用了Mdivi-1抑制劑后的在體數(shù)據(jù)

Fig4f-使用了CCCP（促進線粒體自噬）后的在體數(shù)據(jù)

Fig4hi-使NLRX1小鼠與WT小鼠使用了Mdivi-1后的數(shù)據(jù)洋机，無差異。

Fig4j-使用大腸桿菌（胞外菌）感染NLRX1敲除小鼠洋魂，無差異绷旗，說明，NRLX1只是參與了胞內(nèi)菌誘導的線粒體自噬副砍。

Fig4k-骨髓移植實驗衔肢。WT與NLRX1敲除鼠的骨髓』眙幔可以發(fā)現(xiàn)角骤，表型一致。

Fig4lm-巨噬細胞條件性敲除鼠心剥。表型與全敲鼠一致邦尊。

Fig4的數(shù)據(jù)表明了，LM通過NLRX1誘導線粒體自噬优烧，在巨噬細胞感染LM的過程中參與了重要作用蝉揍。接著，作者研究了線粒體自噬是如何影響LM存活的畦娄。

Fig5a-線粒體的活性氧基基團（mtROS）在控制胞內(nèi)菌又沾，例如沙門氏菌方面有著重要的作用，線粒體損傷的積累伴隨著更高水平的mtROS的產(chǎn)生熙卡。作者先檢測了在Nlrx1-/-敲除的巨噬細胞殺菌能力的增強是否與異常的mtROS產(chǎn)生有關杖刷。MitoSOX是一個縱橫特異性ROS指示劑，作者發(fā)現(xiàn)在Nlrx1-/-敲除的巨噬細胞中驳癌，經(jīng)Lm感染后滑燃，mtROS的水平膽顯升高。

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Fig5b-使用Mdivi-1喂柒，同時使用CCCP不瓶，能夠抑制由LM誘導的ROS產(chǎn)生（這是為了說明禾嫉，抑制自噬能夠抑制Lm誘導的ROS）。

Fig5c,d,e,f-經(jīng)MitoTEMPO處理后（MitoTEMPO是一種靶向線粒體的抗氧化劑蚊丐，它可以抑制活性氧對線粒體的損傷熙参。），NLRX1缺陷麦备，或者是Mdivi-1處理的體內(nèi)實驗與體外實驗說明孽椰，LM的增殖會降低。

Fig5,h-經(jīng)Lm感染后凛篙，Nlrx1-/-PMs的線粒體電位降低黍匾，mtROS的產(chǎn)生增強。

Fig5ij-Mdivi-1也能增強Lm誘導的THP-1巨噬細胞的mtROS的增強呛梆。

這些數(shù)據(jù)都表明锐涯，Lm能通過NLRX1誘導巨噬細胞中線粒體自噬，移除受損的線粒體填物，因此降低mtROS的產(chǎn)生纹腌，有利于Lm的存活。

雖然NLRX1有報道過參與病理性感染滞磺，但是它的功能機制還不清楚升薯。一些研究指出，NLRX1能負向調(diào)節(jié)TLR與病毒介導的NF-kappaB活性击困，以及IFN-I的產(chǎn)生涎劈，但是其抑制效應還未見報道。作者發(fā)現(xiàn)在NLRX1缺陷的巨噬細胞中阅茶，Lm誘導的NFkappaB活化以及下游的基因表達蛛枚，以及分泌的炎癥因子不受影響。在Nlrx1缺陷的巨噬細胞和野生型巨噬細胞中目派，Ifnb基因的表達也有所不同坤候。雖然mtROS有報道說是能激活NLRP3胁赢，用于IL-1beta的分泌企蹭，作者發(fā)現(xiàn)，NRLX1缺陷不影響Lm誘導的IL-1beta的分泌智末，這與報道稱AIM2炎性小體參與LM誘導的IL-1beta的分泌是一致的谅摄。因此，作者的數(shù)據(jù)指出系馆，mtROS在抑制Nlrx1缺陷的巨噬細胞中的LM的增殖有著重要作用送漠。經(jīng)典的自噬對于自噬小體的形成有著重要意義，它能降解包裹的東西由蘑，例如線粒體闽寡。作者接著研究了經(jīng)典自噬通路相關的蛋白是否參與了Lm誘導的線粒體自噬代兵。

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經(jīng)典的自噬（Canonical

autophagy）對于自噬小體的形成有著重要意義，它能降解包裹的東西爷狈，例如線粒體植影。作者接著研究了經(jīng)典自噬通路相關的蛋白是否參與了Lm誘導的線粒體自噬。

Fig6ab-在Atg7缺陷的巨噬細胞中涎永，Lm與CCCP能誘導mtDNA水平的下降會被阻斷思币，以及線粒體蛋白的下降也會被阻斷（也就是說，Lm與CCCP原來能誘導mtDNA水平的下降羡微，這表明出現(xiàn)了線粒體自噬谷饿，而在Atg7缺陷的巨噬緩解中，這種下降被抑制了妈倔，說明了自噬出現(xiàn)了障礙）博投。

Fig6cd-在敲低了Atg5的小鼠PM中，也能出現(xiàn)上述的現(xiàn)象盯蝴。

Fig6ef-在敲低了其它的自噬相關蛋白贬堵，例如Becn1，Rb1cc1與Atg15的巨噬細胞中结洼，這種現(xiàn)象也有黎做。

Fig6gh-在THP1這種人源細胞中，敲低了ATG7后松忍，這種現(xiàn)象也有蒸殿。

Fig6ij-所有的這些數(shù)據(jù)都表明，經(jīng)典自噬對于Lm誘導的線粒體自噬來說有著重要的作用鸣峭。與野生型細胞相比宏所，在敲除了Atg7的細胞中，與在Nlrx1缺陷的巨噬細胞中類似摊溶，Lm誘導的線粒體損傷與mtROS的產(chǎn)生會升高爬骤。

Fig6kl-同樣的，在Atg7缺陷的PM莫换，Mdivi-1霞玄，CCCP對Lm增殖的影響會受到抑制。

這些數(shù)據(jù)都說明了拉岁，Lm會脅持宿主細胞的自噬機體坷剧，誘導宿主細胞的線粒體自噬，促進其自身存活喊暖。

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為了研究Lm的哪個成分參與了線粒體自噬惫企，作者首先研究了Lm來源的DNA和RNA，發(fā)現(xiàn)它們都無法誘導巨噬細胞的線粒體自噬陵叽。但是狞尔，殺死（用熱源殺死）的LM也無法誘導巨噬細胞的線粒體自噬丛版。這說明LM中有一些成分是是熱敏感的，這一成分與誘導線粒體自噬有關偏序。LLO是LM的一個毒力因子硼婿，它在LM感染的不同階段發(fā)揮作用。

Fig7abc-體外實驗發(fā)現(xiàn)禽车，LLO能誘導巨噬細胞的線粒體自噬與線粒體損傷寇漫。

Fig7def-使用了LLO缺陷的LM（Δhly）與野生型LM來誘導巨噬細胞，Δhly無法誘導巨噬的線粒體自噬與線粒體損傷殉摔。

Fig7gh-為了進一步確定LLO是誘導巨噬細胞線粒體自噬的主要因子州胳，作者還使用了另外一種缺陷株，即ΔprfA（DP-L4317）逸月，這種缺陷型LM沒有PrfA基因栓撞，它是Lm編碼LLO與ActA的轉(zhuǎn)錄激活因子，還使用了另外一種Lm缺陷株碗硬，即DP-L6173瓤湘，這種缺陷株缺陷PrfA，但是能產(chǎn)生LLO恩尾。DP-L4317無法誘導線粒體自噬弛说，而DP-L6173能誘導與野生型Lm類似的線粒體自噬。因此翰意，作者認為木人，LLO是LM誘導線粒體自噬的主要因子。

Fig7ij-接著冀偶，作者研究了NLRX1是否參與了LLO誘導的線粒體自噬醒第。LLO誘導的mtDNA的下降在Nlrx1缺陷的PM中能被阻斷，而線誘導的線粒體損傷則有所增加进鸠。

Fig7k-此外稠曼，LLO缺陷型Lm無法誘導線粒體自噬，而補充了LLO的缺陷Lm則能誘導NRX1依賴的線粒體自噬客年。

Fig7l-經(jīng)LLO刺激后霞幅，Nlrx1缺陷的PM線粒體電位降低，mtROS升高搀罢。以前有文獻報道過蝗岖，Δhly缺陷的巨噬細胞能在小鼠巨噬細胞系J774中稍微增殖。

Fig7m-作者在附件中也提到了Δhly缺陷型菌株在小鼠的PM中有所增殖榔至。但是，Δhly菌株的在感染了6小時后欺劳，細菌含量升高了5倍唧取。因為有報道指出铅鲤，在人上皮細胞中，Δhly缺陷的Lm會表達phospholipase C與metalloprotease枫弟，用于補償LLO邢享，使Lm在細胞中增殖。因此淡诗，Δhly缺陷型Lm也有可能使用類似的機制在小鼠的PM中增殖骇塘。為了研究細胞外LLO能否影響入侵后Lm的增殖，作者增加了Δhly的MOI（使之與野生型Lm進入細胞中的數(shù)量類似）韩容。作者發(fā)現(xiàn)款违，LLO缺陷的Lm能抑制Lm的存活，而加入LLO與Δhly則能增加Lm的含量群凶。這說明插爹，Lm分泌的LLO誘導了宿主細胞的線粒體自噬，增強了Lm在細胞中的存活请梢。

Fig7no-在NLRX1缺陷的巨噬細胞中赠尾，Δhly菌株的滴度并不受影響。

Supplementary6n-由于無法移除由線粒體自噬導致的受損的線粒體毅弧，因此Δhly突變株在野生型PM中會產(chǎn)生更多的mtROS气嫁，但在NLRX1缺陷的PM中，野生型LM與Δhly缺陷的LM則無此現(xiàn)象够坐。

附件Fig7abc-作者接下來研究了LLO誘導線粒體自噬的機制杉编。LLO會在細胞膜上形成孔洞，誘導離子流咆霜，這些離子就包括鈣離子邓馒，鉀離子。作者假設蛾坯，異常的離子流會誘導線粒體的損傷光酣。途徑發(fā)現(xiàn)，BAPTA-AM（一種鈣離子螯合劑脉课，它進入細胞后救军，會水解成為BAPTA，從而與Ca2+發(fā)生復雜反應倘零，可以有效地減少胞內(nèi)游離鈣離子的濃度. 線粒體是平衡細胞內(nèi)鈣離子平衡穩(wěn)態(tài)的重要細胞器,另外,胞內(nèi)鈣離子累積可造成線粒體功能障礙或紊亂引起線粒體凋亡通路的激活）能顯著阻斷由LLO誘導的線粒體損傷與線粒體自噬唱遭，而通過使用一個含有高濃度氯化鉀的培養(yǎng)基（90mM）則能阻斷氯化鉀，就無此效應的出現(xiàn)呈驶。

我們接著來研究了LLO誘導的鈣離子流是如何導致線粒體損傷的拷泽。當細胞內(nèi)鈣離子水平太高時，線粒體就會攝取并儲存鈣離子，這一過程主要是通過線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體(mitochondrial calcium uniporter司致，MCU)拆吆。由于鈣離子在線粒體中的積累會導致線粒體膜被陽離子誘導的損耗，作者假設脂矫，觀察到的線粒體損傷有可能是由于線粒體通過MCU攝取了鈣離子導致的枣耀。在附件中，作者提到了使用siRNA干擾了MUC后庭再，LLO誘導的線粒體損傷與線粒體自噬就會受到抑制捞奕。這些結(jié)果都說明了，LLLO通過MCU誘發(fā)鈣離子內(nèi)流拄轻，并導致了線粒體的損傷颅围。由于LLO能夠誘導巨噬細胞中的線粒體自噬，但無法誘導上皮細胞的線粒體自噬哺眯，因此作者懷疑LLO的不同效應是否是由于NLRX1在這些細胞中的表達差異造成的谷浅。作者發(fā)現(xiàn)，NLRX1在上皮細胞中表達量很低奶卓，在巨噬細胞中表達量比較高一疯。然后作者在Hela中高表達了全長了NLRX1，使之表達量與巨噬細胞中的類似夺姑，此時墩邀，過表達了NLRX1的Hela能夠被LLO誘導線粒體自噬。但是盏浙，作者還注意到眉睹，在這種Hela細胞被LLO誘導的線粒體自噬應答仍然比巨噬細胞低。這說明在上皮細胞中废膘，除了NLRX1過表達導致的線粒體自噬外竹海，還有其他的機制參與了其中。

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Fig8a-NLRC4和NLRP3是研究得最多的NLR家族成員丐黄，它們含有一個LRR結(jié)構(gòu)域斋配，參與自身抑制，當刺激后灌闺，它們會出現(xiàn)寡聚化艰争。使用Lm以及LLO刺激時，氷會誘導NLRX1的寡聚化桂对。CL：glutaraldehyde甩卓，戊二醛在研究某個蛋白寡聚化的時候，通常使用戊二醛進行交聯(lián)蕉斜。

Fig8b-NLRC4的C末端LRR結(jié)構(gòu)域會與中心的naCHT結(jié)構(gòu)域結(jié)合逾柿，維持一種單分子形式的自我抑制狀態(tài)缀棍，有文獻報告過一種NLRC4的突變體，此突變體缺乏LRR結(jié)構(gòu)域鹿寻，它們會導致NLRC4持續(xù)的寡聚化睦柴，誘導下游信息轉(zhuǎn)導诽凌。類似的毡熏，我們觀察到，NLRX1-dLRR能持續(xù)地形成寡聚體侣诵。

Fig8cd-當用LLO或LM刺激時痢法，它們并不會進一步地強化。這說明杜顺，LLO與LM這兩種處理并不誘導由LRR結(jié)構(gòu)域介導的抑制狀態(tài)财搁。與寡聚化誘導的活化類似，作者發(fā)現(xiàn)躬络，NLRX1-dLRR能持續(xù)地誘導線粒體自噬（需要LIR模序）尖奔。

這些結(jié)果暗示，釋放由LRR結(jié)構(gòu)域介導的NLRX1抑制是誘導線粒體自噬產(chǎn)生的必要條件穷当。接下來提茁，作者研究了靶向作用于另外一種細胞器（由靶向NLRX1轉(zhuǎn)到ER）是否能夠誘導另外一種選擇自噬方灾。FAM134B是ER吞噬受體鸭蛙，它含有一個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域參與ER的定位涉馁。作者使用了一個嵌合蛋白汪疮，即將FAM134B的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)域與NLRX1融合起來峭火，研究作者的這種假設。

作者首先構(gòu)建了一個NLRX1線粒體定位的突變體（dmt-NLRX1）智嚷，然后將網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)域與dmt-NLRX1進行融合（ret-dmt-NLRX1),dmt-NLRX1-dLRR(ret-dmt-NLRX1-dLRR)和dmt-NLRX1-dLRR-dLIR(ret-dmt-NLRX1-dLRR-dLIR)卖丸，作者發(fā)現(xiàn)這三個嵌合蛋白能與ER標記特CLIMP-63共定位。ret-dmt-NLRX1-dLRR則能出現(xiàn)更強的寡聚化盏道，與LC3共定位稍浆，誘導CLIMP-63的降解，此過程可以被CQ阻斷摇天，這說明粹湃，dmt-NLRX1-dLRR定位到ER上，能誘導ER的自噬泉坐∥總之，這些附件中的數(shù)據(jù)說明腕让，NLRX1如果沒有LRR結(jié)構(gòu)域孤钦，則能充分促進自噬歧斟。

fig8ef-作者隨后研究了LRR結(jié)構(gòu)域彎曲后與NACHT結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能夠維持NLRX1的一種自我抑制狀態(tài)。作者實際上觀察到了LRR結(jié)構(gòu)域與NACHT結(jié)構(gòu)域結(jié)合偏形，并維持了NLRX1-dLRR的寡聚化静袖。

Fig8g-NLRX1的LRR結(jié)構(gòu)域能抑制由Lm或LLO誘導的NLRX1的寡聚化。

Fig8hij-NLRX1的寡聚化能誘導下游信號轉(zhuǎn)導俊扭，LRR結(jié)構(gòu)域能抑制NLRX1-dLRR與LC3的結(jié)合队橙，以及線粒體自噬。

Fig8k-作者又進一步發(fā)現(xiàn)萨惑，由LM或LLO觸發(fā)的捐康，由內(nèi)源的NLRX1介導的自噬能被LRR結(jié)構(gòu)域抑制。

上述的這些發(fā)現(xiàn)共同說明庸蔼，NLRX1的LRR結(jié)構(gòu)域與NACHT結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能維持一種自我抑制狀態(tài)解总，LM與LLO能誘導LRR結(jié)構(gòu)域介導的抑制，因此誘導NLRX1寡聚化姐仅，使它的LIR模序與LC結(jié)合花枫，誘導線粒體自噬。