Nature cancer | ERK1/2磷酸化預測抗PD-1免疫治療后的生存率

原創(chuàng)?驕陽似我?圖靈基因?2021-12-17 07:03

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撰文：驕陽似我

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ERK1/2磷酸化（p-ERK）是MAPK/ERK通路激活的標志，可預測兩個獨立復發(fā)性膠質母細胞瘤（rGBM）患者隊列中佐劑PD-1阻斷后的總體生存率。單細胞RNA測序和多重免疫熒光分析顯示痕支，p-ERK主要定位于腫瘤細胞，高p-ERK GBM含有腫瘤浸潤性髓樣細胞和小膠質細胞，MHC類表達升高?II和相關基因回季。這些發(fā)現(xiàn)表明rGBM中ERK1/2的激活可預測PD-1阻斷的反應肴颊，并與不同的髓系細胞表型相關。

膠質母細胞瘤（GBM）患者的預后較差彬犯，中位總生存期（OS）約為21個月。盡管放射查吊、化療和腫瘤治療領域在診斷時已確立谐区，但在復發(fā)時卻沒有有效的治療方法。這在一定程度上歸因于GBM臭名昭著的分子和微環(huán)境異質性逻卖，這導致了對治療的不穩(wěn)定和不可預測的反應宋列。因此，GBM患者對治療的可變反應通常表現(xiàn)為陰性臨床試驗评也，其中難以捉摸的一部分患者表現(xiàn)出反應炼杖。免疫檢查點阻斷在癌癥治療中取得了前所未有的進展，甚至在晚期轉移性疾病的情況下盗迟，也導致了長期緩解坤邪。它已被作為晚期黑色素瘤、非小細胞肺癌罚缕、透明細胞腎細胞癌艇纺、DNA錯配修復（MMR）缺陷或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的實體瘤以及越來越多的癌癥的標準治療方法。相比之下怕磨，其成功在GBM中受到限制喂饥，部分原因是內源性和醫(yī)源性免疫抑制的多樣性和迭代機制。除其他因素外肠鲫，這些因素包括免疫抑制細胞的腫瘤浸潤员帮、抗原處理和呈遞機制的缺陷、骨髓中T細胞的隔離以及頻繁使用免疫抑制藥物导饲，如皮質類固醇捞高。陰性試驗表明，免疫檢查點阻斷對GBM患者總體上缺乏療效渣锦，但一些患者出現(xiàn)了持久的臨床反應硝岗。

近期，在Nature cancer雜志上發(fā)表了一篇名為“ERK1/2 phosphorylation predicts survival?following anti-PD-1 immunotherapy in recurrent Glioblastoma”的文章袋毙，報告了一項對使用輔助PD-1阻斷劑治療復發(fā)性GBM（rGBM）患者的分析型檀，發(fā)現(xiàn)了與這種免疫治療反應相關的分子特征。BRAF-和PTPN11激活突變听盖，驅動MAPK/ERK通路信號胀溺，在對PD-1阻斷反應的rGBM中富集裂七。為了確定除攜帶BRAF或PTPN11突變的腫瘤外對PD-1阻斷敏感的腫瘤，本文探討在PD-1阻斷后反應和延長生存期的rGBM中是否存在MAPK通路激活仓坞。在接受PD-1阻斷治療的rGBM患者及未接受免疫治療的rGBM患者標本中分析了ERK1/2磷酸化（p-ERK）背零，即MAPK信號下游效應器的活性形式。此外无埃，通過人類GBMs的多重免疫熒光和單細胞RNA測序（scRNA-seq）評估ERK1/2激活升高患者腫瘤微環(huán)境的表型和細胞差異徙瓶。

為了研究MAPK通路激活是否與抗PD-1治療反應相關，使用免疫組織化學（IHC）在GBM中評估了p-ERK嫉称。首先調查p-ERK染色是否與PD-1阻斷反應相關侦镇，使用Cox比例風險模型進行單變量和多變量分析，以評估p-ERK細胞密度與生存率的相關性澎埠。結果表明虽缕，高p-ERK僅在抗PD-1治療的情況下與生存獲益相關，因此作為生物標志物具有預測性蒲稳，但不能預測預后。接下來通過對結果和治療不知情的神經病理學家的評分伍派，研究了使用p-ERK染色預測PD-1阻斷反應的可行性江耀。分析表明，基于計算機的p-ERK定量可能比病理學家的評分更具可重復性和可靠性诉植。調查了p-ERK細胞密度升高及其與PD-1阻斷后長期生存率的相關性祥国，而與BRAF/PTPN11激活突變無關。有趣的是晾腔，與存活時間<12個月的患者相比舌稀，PD-1阻斷開始后存活時間>12個月的患者p-ERK+細胞密度升高。在存活時間>12個月的患者中灼擂，5例為野生型BRAF和PTPN11壁查，4例為這些基因的激活突變，2例為未知BRAF/PTPN11突變狀態(tài)剔应。這些結果表明睡腿，無論BRAF/PTPN11基因的遺傳狀態(tài)如何，在抗PD-1治療中經歷較長OS的患者始終表現(xiàn)出高水平的p-ERK峻贮∠郑總的來說，這些結果表明p-ERK染色具有特異性纤控，是復發(fā)性GBM PD-1阻斷后的預測性生物標志物挂捻。

圖1|通過半自動IHC定量評估ERK1/2磷酸化，表明它是復發(fā)性GBM PD-1阻斷后的預測性生物標志物船万。

隨著時間的推移刻撒，腫瘤細胞表型和相關微環(huán)境會發(fā)生變化惜辑，尤其是在新診斷的GBM和復發(fā)性疾病之間。為了研究用于p-ERK測定的組織相對于PD-1阻斷劑的起始時間是否影響該生物標記物的預測特性疫赎，使用在臨床試驗開始PD-1阻斷前不同時間點獲得的配對樣本盛撑，其中包括接受輔助PD-1阻斷的一只手臂。結果表明捧搞，在PD-1阻斷開始前不久獲得的腫瘤更可靠地預測rGBM患者對PD-1阻斷的反應抵卫。此外采用Cox比例風險模型，使用研究中的腫瘤樣本胎撇，測試p-ERK細胞密度與生存率的相關性介粘。結果表明從接近PD-1阻斷起始的GBM樣本中獲得的p-ERK的預測能力。此外晚树，這些結果驗證了初步觀察結果姻采，即高p-ERK與輔助PD-1阻斷治療患者的長期生存相關。圖2 |在使用輔助PD-1阻斷劑治療的獨立復發(fā)性GBM隊列中爵憎，預處理p-ERK染色與OS相關的驗證慨亲。

為了研究哪些細胞群有助于GBM中p-ERK的表達，在GBM樣本中進行多重免疫熒光宝鼓，評估p-ERK和腫瘤微環(huán)境中的主要細胞群刑棵，包括SOX2（腫瘤標記）、TMEM119（小膠質細胞標記）愚铡、CD163（巨噬細胞標記）蛉签、DAPI標記細胞核。通過量化這些細胞群沥寥，發(fā)現(xiàn)相對于TMEM119+細胞碍舍，p-ERK主要在SOX2+細胞、CD163+細胞和其他細胞中檢測到邑雅。與低p-ERK膠質瘤相比片橡，高p-ERK膠質瘤中SOX2+p-ERK+細胞的數(shù)量更多。例如一種BRAFV600E突變的GBM和一種野生型BRAF/PTPN11腫瘤蒂阱，這兩種腫瘤都有SOX2+細胞高水平表達的p-ERK锻全。相反，在被IHC分類為ERK1/2激活水平較低的rGBM中录煤，大多數(shù)SOX2+細胞對p-ERK呈陰性鳄厌。這些結果表明，膠質瘤中的大多數(shù)p-ERK+細胞是腫瘤細胞妈踊，免疫細胞和基質細胞的貢獻較小了嚎。考慮到GBM微環(huán)境中髓樣細胞的豐富性及其在GBM中對免疫檢查點抑制劑的反應和耐藥性中的意義，分析了p-ERK細胞密度是否與這些免疫細胞在GBM中的浸潤有關歪泳。發(fā)現(xiàn)與低p-ERK腫瘤相比萝勤，高p-ERK腫瘤的GBM中TMEM119+細胞數(shù)量增加。相反呐伞，在p-ERK水平高與低的膠質瘤中敌卓，浸潤CD163+細胞的膠質瘤數(shù)量沒有差異。用巨噬細胞/小膠質細胞標記物Iba1對膠質瘤樣本進行IHC染色伶氢，并評估其與p-ERK細胞密度的相關性趟径。發(fā)現(xiàn)通過IHC量化得出的p-ERK細胞密度與標本中的Iba1+細胞密度相關。圖3 |復發(fā)性GBM樣本的多重免疫熒光顯示SOX2+細胞中的p-ERK陽性和相關的髓樣細胞浸潤癣防。

接下來進行空間分析以進一步研究SOX2+p-ERK+細胞和膠質瘤浸潤髓樣細胞之間的相互作用蜗巧。計算了TMEM119+和CD163+細胞與SOX2+p-ERK+細胞之間的距離。發(fā)現(xiàn)與低p-ERK腫瘤相比蕾盯，高p-ERK腫瘤中TMEM119+細胞更接近SOX2+p-ERK+細胞幕屹。相反沒有發(fā)現(xiàn)TMEM119+細胞和SOX2+p-ERK細胞之間的距離差異。同樣级遭，高p-ERK腫瘤中CD163+細胞與SOX2+p-ERK+之間的距離比低p-ERK腫瘤短望拖，但CD163+細胞與SOX2+p-ERK之間的距離沒有差異。同樣装畅，當使用GFAP+標記腫瘤/星形膠質細胞來測量腫瘤細胞與髓系細胞之間的距離時靠娱，發(fā)現(xiàn)高p-ERK的腫瘤從CD163+細胞到GFAP+p-ERK+的距離比低p-ERK的腫瘤短，而GFAP+p-ERK在這些距離上沒有差異掠兄。這些結果表明，p-ERK+細胞數(shù)量增加的膠質瘤與髓樣/小膠質細胞的高浸潤有關锌雀。與免疫細胞和腫瘤區(qū)域分離的其他實體瘤相比蚂夕，浸潤髓樣細胞的膠質瘤附近的p-ERK+腫瘤細胞數(shù)量增加表明這些細胞群之間存在高度混合。圖4|表達p-ERK的腫瘤細胞及其相關髓系細胞的空間分析腋逆。

鑒于在腫瘤細胞中觀察到的髓樣細胞浸潤與ERK1/2激活的相關性婿牍，使用scRNA-seq研究了這些免疫細胞的表型。分析了10個GBM標本中的28194個細胞惩歉，這些細胞與p-ERK IHC染色配對等脂。采用與發(fā)現(xiàn)和驗證GBM隊列相同的方法對p-ERK細胞密度進行量化，使用相同的切點值將腫瘤指定為高p-ERK與低p-ERK撑蚌，從而導致五個p-ERK高腫瘤和五個p-ERK低腫瘤上遥。隨后根據(jù)用于腫瘤細胞（SOX2）、髓樣細胞（CD14）争涌、內皮細胞（VWF）和周細胞（PDGFRB）的單細胞轉錄組學的經驗證的細胞標記物的表達對簇進行注釋粉楚。腫瘤細胞聚集成幾個樣本依賴組，而來自所有GBM樣本的髓樣細胞室、周細胞和內皮細胞則均勻聚集模软。鑒于骨髓細胞在p-ERK升高的腫瘤中的浸潤增加伟骨，以及它們在GBM免疫檢查點阻斷中的免疫調節(jié)作用，將分析重點放在骨髓細胞上燃异。為了研究高p-ERK和低p-ERK腫瘤之間骨髓細胞群中的轉錄差異携狭，進行了基因集富集分析（GSEA）和基因本體論（GO）集合。高p-ERK腫瘤的髓樣細胞中有27條GO通路顯著富集回俐。有趣的是逛腿，在與淋巴細胞趨化性、趨化因子和抗原呈遞相關的幾個其他GO主題中鲫剿，在浸潤高p-ERK腫瘤的髓樣細胞中富集的頂級基因集是GO術語“MHC classII蛋白復合物結合”鳄逾。相比之下，沒有發(fā)現(xiàn)低p-ERK腫瘤髓樣細胞中有顯著的基因集富集灵莲。鑒于高p-ERK GBMs髓樣細胞中MHC classII蛋白復合物結合GO項富集雕凹，研究了這些髓樣細胞是否也表達MHC classII（MHCII）分子。采用多重免疫熒光染色來評估SOX2（腫瘤細胞標記物）政冻、CD163（髓細胞標記物）枚抵、TMEM119（小膠質細胞標記物）、MHCII和DAPI明场。該分析顯示汽摹，與低p-ERK腫瘤相比，高p-ERK腫瘤的TMEM119+細胞的MHCII蛋白表達升高苦锨。還觀察到高P-ERK腫瘤的CD163+細胞相對于低P-ERK腫瘤的MHCII表達逼泣。總的來說舟舒，這些結果表明拉庶，ERK1/2激活增強的腫瘤具有特定的微環(huán)境特征，其中髓樣細胞（主要是小膠質細胞）表達MHCII和與該抗原呈遞分子相關的基因特征秃励。圖5 |高p-ERK組和低p-ERK組GBM患者的scRNA序列氏仗。

當前研究的一個局限性是它沒有建立因果關系。因此夺鲜，p-ERK作為PD-1阻斷的預測性生物標志物的潛在機制仍有待確定皆尔。盡管在發(fā)現(xiàn)和驗證隊列中發(fā)現(xiàn)高p-ERK和低p-ERK GBM患者的OS存在差異，但承認進一步的研究局限性在于分析的患者數(shù)量和研究的回顧性設計币励。因此慷蠕，評估抗PD-1治療的這種生物標記物的前瞻性驗證很重要。此外榄审，考慮到新輔助PD-1阻斷對GBM的潛在治療益處砌们，另一個未解決的問題是p-ERK1/2是否仍能預測暴露于這種免疫療法的標本的反應。總之浪感，這些結果表明昔头，p-ERK1/2表明rGBM患者對佐劑PD-1阻斷的反應，rGBM患者具有獨特的腫瘤免疫微環(huán)境影兽，該微環(huán)境由表達MHC II的髓樣/小膠質細胞組成揭斧。這為GBM的個體化免疫治療提供了機會，為在避免對其他患者進行無效治療的同時峻堰，對患者進行分組讹开。

教授介紹：

AdamM Sonabend

Sonabend博士是墨西哥人。他在墨西哥國立自治大學（UNAM）醫(yī)學院獲得醫(yī)學學位捐名，并以全班第一名的成績畢業(yè)旦万，為此他被墨西哥國立自治大學授予GabinoBarreda獎章。畢業(yè)后镶蹋，Sonabend博士在芝加哥大學從事轉化腦腫瘤研究成艘。隨后，他在紐約長老會醫(yī)院哥倫比亞大學醫(yī)學中心完成了神經外科培訓贺归。除了接受一般神經外科培訓外淆两，他還接受了神經外科腫瘤學的廣泛培訓。Sonabend博士于2015年在哥倫比亞大學開始了他的職業(yè)生涯拂酣，當時他在完成住院醫(yī)師培訓后首次加入該部門秋冰。他發(fā)表了50多篇同行評審的文章，書籍章節(jié)以及國家和國際演講婶熬。他是神經外科醫(yī)生協(xié)會研究獎（2009年）剑勾，神經外科研究和教育獎學金獎（2012年）以及哥倫比亞大學高級教務長辦公室的多樣性招聘獎（2015年）的獲得者。2015年赵颅，他是16位科學家之一甥材，也是美國唯一一位獲得著名的5年NIH主任早期獨立獎（DP5）的神經外科醫(yī)生，價值超過200萬美元性含。

參考文獻：

Arrieta, V.A., et al., ERK1/2 phosphorylation predicts survival followinganti-PD-1 immunotherapy in recurrent glioblastoma. Nature Cancer, 2021.