抗原設(shè)計秘籍(轉(zhuǎn)載)
想要以高成功率獲取特異性好、有效性高的抗體，第一步抗原設(shè)計至關(guān)重要蜈敢。
目前，用于免疫生產(chǎn)抗體的抗原一般有多肽抗原和重組抗原汽抚。兩種抗原各有優(yōu)劣抓狭，多肽抗原理論上來說可以產(chǎn)生高特異性、針對特定抗原表位的抗體造烁；缺點是免疫原性較低否过，需要和載體偶聯(lián)以增強(qiáng)免疫原性，這增加了抗原制備成本惭蟋，另外還會產(chǎn)生大量針對載體的非特異性抗體苗桂，增加了后續(xù)純化和篩選成本。重組抗原免疫原性強(qiáng)告组，包含抗原表位多煤伟，用于制備抗體，相對成功率較高木缝；但也有缺點便锨，重組抗原一般采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)折疊方式與真核生物的有所差異我碟，另外有時并不能獲取可溶性的抗原鸿秆，進(jìn)一步導(dǎo)致所獲抗原與目的蛋白抗原的抗原表位并不完全一致，從而產(chǎn)生出一些非特異性的抗體怎囚，而這些非特異抗體在后期的純化過程中是很難被排除掉的。
設(shè)計抗原時，多肽抗原一般選擇12~30個左右的氨基酸恳守，重組抗原一般為長度在100個氨基酸以上的部分或者全長蛋白考婴。無論選擇設(shè)計哪一種抗原，我們都要遵循以下幾個基本原則：
1.確定所需生產(chǎn)抗體的用途
明確所需生產(chǎn)抗體的用途對抗原設(shè)計有很大的影響催烘。例如：如果需要利用得到的抗體來研究目的蛋白的特定區(qū)域沥阱，如C端或N端，那么抗原序列的選擇就應(yīng)集中在這一區(qū)域伊群；如果想要用抗體來研究一種特定狀態(tài)下的蛋白考杉，如磷酸化等，抗原設(shè)計的選擇性更小了舰始，只有選擇該點位附近的合適氨基酸序列來設(shè)計多肽抗原崇棠。
2.抗原序列區(qū)域的選擇原則
一般說來最理想的抗原表位識別區(qū)域應(yīng)具備親水、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點丸卷。因為在大多數(shù)的天然（自然）環(huán)境中枕稀，親水區(qū)域傾向于集中在蛋白表面，而疏水區(qū)域常常被包裹在蛋白內(nèi)部谜嫉。那么萎坷，我們在設(shè)計的抗原的時候，如果選擇這些具備親水沐兰、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點的區(qū)域的話哆档，則有利于抗原產(chǎn)生與目的蛋白相同的抗原表位，從而生產(chǎn)出高親和力住闯，高特異性的抗體瓜浸。
3.連續(xù)的與不連續(xù)的識別區(qū)域
大多數(shù)抗體是針對連續(xù)識別區(qū)域的，抗體能與這類區(qū)域以很高的親和力相結(jié)合表明這段序列不在蛋白內(nèi)部寞秃。不連續(xù)的識別區(qū)域是代表有一定折疊的一段多肽序列斟叼，或是將兩段分離開的多肽連在一起的抗體的識別區(qū)域。在某些情況下春寿，針對這樣不連續(xù)識別區(qū)域的抗體也能產(chǎn)生朗涩，只是用來免疫的抗原多肽必須具備與該不連續(xù)識別區(qū)域相似的二級結(jié)構(gòu)，而序列的長度需要符合相關(guān)的要求绑改。
4.避免識別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部
為了避免識別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部的風(fēng)險谢床，通常選擇蛋白的N，C兩端來產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體厘线。因為在完整的蛋白中识腿，N、C兩端通常是暴露在蛋白表面的造壮。然而渡讼，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太強(qiáng)骂束，不適合作為抗原。
了解以上基本原則后成箫，設(shè)計抗原時展箱，我們則可以通過以下幾個步驟進(jìn)行：
1.資料調(diào)研
1.1 查找蛋白質(zhì)基本信息：包括蛋白名稱、基因名稱蹬昌、分子量混驰、氨基酸數(shù)、表達(dá)部位皂贩、GeneID等栖榨，常用如下兩個數(shù)據(jù)庫：
http://www.uniprot.org/?(Uniprot)
http://www.hprd.org/query?(Human Protein Reference Database)
1.2 查找針對該蛋白質(zhì)的抗體的信息
由于抗原設(shè)計本身具有很多的不確定性，為了降低風(fēng)險明刷，節(jié)省成本婴栽，所以需要參考別人做該抗體的抗原設(shè)計位點，盡可能多的調(diào)研相關(guān)信息遮精，以免做無用功(例如居夹，有些抗原只能用重組蛋白而不能用多肽，調(diào)研出這些信息就能降低很多風(fēng)險)本冲。常用網(wǎng)站如下：
2.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 (以DNAstar為例)
在http://www.uniprot.org/?(Uniprot)中將蛋白的氨基酸序列復(fù)制到DNAstar中准脂，再利用Protean得出該蛋白的抗原性(Antigenic Index)、親水性(Hydrophilicity Plot)檬洞、柔韌性(Flexible Regions)狸膏、表面可及性(Surface probability)、轉(zhuǎn)角(Turn, Coil)添怔、α螺旋(Alpha-helix)湾戳、β折疊(Beta-sheet)等分析圖。我們從中選擇抗原性強(qiáng)广料、親水性好砾脑、柔韌性好、表面可及性高艾杏、有轉(zhuǎn)角的區(qū)域韧衣，同時避免有α螺旋、β折疊的區(qū)域购桑。
3.在線預(yù)測
設(shè)計多肽抗原時可以在http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html提交蛋白的氨基酸序列畅铭，一般以20 aa為標(biāo)準(zhǔn)，得到不同肽段勃蜘，其順序按預(yù)測推薦優(yōu)劣排列硕噩。在http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/?再次提交蛋白氨基酸序列，得到整個序列中每一個氨基酸的抗原性缭贡，得分高的抗原性好炉擅。
4.同源性比較(Blast)
對于多肽抗原辉懒，一般還需要比較同源性】幼剩可以將選擇的序列在http://www.uniprot.org/上Blast耗帕，看其同源性，同一物種中的同源性高的序列則不能選擇袱贮，不同物種之間的同源性高的則可以作為抗原。
經(jīng)過以上步驟后体啰，我們就可以綜合選定序列所需的抗原種類及序列了攒巍。
附錄. 一些常用的數(shù)據(jù)庫和預(yù)測工具
分析氨基酸序列中是否存在信號肽：
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
分析氨基酸序列中的跨膜結(jié)構(gòu)：
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
基于序列的線性表位預(yù)測工具：
http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred
基于結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和非連續(xù)性表位預(yù)測工具：
http://bioinfo.ernet.in/cep.htm
基于序列/結(jié)構(gòu)的非連續(xù)性表位預(yù)測工具：
http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope
抗原-抗體相互作用殘基數(shù)據(jù)庫：
http://www.rostlab.org/services/ep
免疫細(xì)胞通常難以識別整個抗原分子，而僅識別抗原大分子上的一個特定的部分荒勇，稱為表位(epitope)或抗原決定簇(antigenicdeterminant)柒莉。因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與免疫細(xì)胞表面的抗原受體或游離的抗體分子相結(jié)合沽翔。嚴(yán)格說來兢孝，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子。
那么仅偎，如何進(jìn)行正確進(jìn)行抗原表位預(yù)測及抗原多肽設(shè)計呢跨蟹？
利用在線軟件BepiPred 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）從蛋白序列直接預(yù)測抗原表位
還有其他在線預(yù)測網(wǎng)站
http://www.epitope-informatics.com/Links.htm
http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/index.html?進(jìn)Antigenic Peptide Prediction 用tools
http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl?把氨基酸序列粘貼進(jìn)去，就可以直接得出預(yù)測結(jié)果
抗原多肽選擇的基本原則
1橘沥、盡可能是在蛋白表面
2窗轩、保證該段序列不形成α-helix
3、N,C端的肽段比中間的肽段更好
4座咆、避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列
5痢艺、避免同源性太強(qiáng)的肽段
6、交聯(lián)可以交聯(lián)在N介陶，C兩端堤舒，選擇依據(jù)就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的一端
7、序列中不能有太多的Pro,但有一兩個Pro有好處哺呜，可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定一些舌缤，對產(chǎn)生特異性抗體有益。
抗原多肽設(shè)計的基本原則
為了使生產(chǎn)抗體獲得最佳效果弦牡，仔細(xì)地設(shè)計抗原多肽是很有必要的友驮，設(shè)計應(yīng)滿足一個基本條件：在免疫過程中，該抗原既不會產(chǎn)生過強(qiáng)的免疫反應(yīng)驾锰，同時又能產(chǎn)生出對感興趣的蛋白有結(jié)合能力的抗體卸留。盡管抗原設(shè)計是一個很復(fù)雜的課題，有諸多需要注意的細(xì)節(jié)椭豫，已超過了我們所能提供的范圍耻瑟，根據(jù)我們所積累的經(jīng)驗旨指，有幾點關(guān)鍵的基本設(shè)計原則可以提供給大家參考：
1、確定抗體的用途（應(yīng)用）新開展一個研究項目喳整，弄清楚所感興趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的谆构，特別是如果知道蛋白的結(jié)構(gòu)會對選擇抗體易于接觸和識別的識別區(qū)域有很大的幫助。然而框都，在沒有這樣精確的結(jié)構(gòu)信息（多數(shù)是這種情況）的情況下搬素，了解研究的用途（應(yīng)用）會影響多肽設(shè)計的策略。例如：如果研究重點是集中在蛋白的不同區(qū)域魏保，如C端或N端熬尺，或在一種特定狀態(tài)下的蛋白，如磷酸化等谓罗，那么按照所需序列設(shè)計的多肽和產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體在應(yīng)用上應(yīng)該沒有太大的困難粱哼，然而，蛋白的構(gòu)象將影響抗體與其識別區(qū)域之間的相互作用檩咱。這種情況下可能存在的問題是如果在折疊的蛋白中揭措，該識別區(qū)域被藏在蛋白的內(nèi)部，抗體將無法接觸到該區(qū)域刻蚯。（無法產(chǎn)生相互作用）绊含。
2、識別區(qū)域的選擇原則一般說來最理想的抗原性識別區(qū)域應(yīng)具備親水芦倒、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點艺挪。因為在大多數(shù)的天然（自然）環(huán)境中，親水區(qū)域傾向于集中在蛋白表面兵扬，而疏水區(qū)域常常被包裹在蛋白內(nèi)部麻裳，同樣道理，抗體只能與在蛋白表面發(fā)現(xiàn)的識別區(qū)域相互作用器钟，而當(dāng)這些識別區(qū)域有足夠的結(jié)構(gòu)易變形性而轉(zhuǎn)移到抗體可接觸的位置時津坑，將會與抗體間有很高的親和性。
3傲霸、連續(xù)的與不連續(xù)的識別區(qū)域連續(xù)的區(qū)域是指由連續(xù)的氨基酸序列（殘基）構(gòu)成的識別區(qū)域疆瑰。大多數(shù)抗體是針對連續(xù)識別區(qū)域的，抗體能與這類區(qū)域以很高的親和力相結(jié)合表明這段序列不在蛋白內(nèi)部昙啄。不連續(xù)的識別區(qū)域是代表有一定折疊的一段多肽序列穆役，或是將兩段分離開的多肽連在一起的抗體的識別區(qū)域。在某些情況下梳凛，針對這樣不連續(xù)識別區(qū)域的抗體也能產(chǎn)生耿币，只是用來免疫的抗原多肽必須具備與該不連續(xù)識別區(qū)域相似的二級結(jié)構(gòu)，而序列的長度需要符合相關(guān)的要求韧拒。
4淹接、基本建議為了避免識別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部的風(fēng)險十性，我們通常建議選擇蛋白的N，C兩端來產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體塑悼。因為在完整的蛋白中劲适，N，C兩端通常是暴露在蛋白表面的厢蒜。然而霞势，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太強(qiáng)，不適合作為抗原斑鸦。
5支示、序列的長度通常我們建議抗原多肽的序列長度在8-20個氨基酸殘基之間，如果太短鄙才，就有多肽太特殊、所產(chǎn)生的抗體與天然蛋白之間的親和力（結(jié)合能力）不夠強(qiáng)的風(fēng)險促绵，同樣攒庵，如果序列長度超過20，將有可能引入二級結(jié)構(gòu)败晴，所產(chǎn)生的抗體失去特異性的可能浓冒，而且肽鏈越長，通常合成難度增大尖坤，不易獲得高純度的產(chǎn)品稳懒。
6、載體蛋白交聯(lián)的選擇
基本原則：將載體蛋白加在遠(yuǎn)離抗體識別區(qū)域的一端慢味，在序列中沒有Cys的情況下在N或C端加上Cys為交聯(lián)的首選方法场梆。
7、常用分析軟件 MacVecfor TM ;DNA star TM;PC-Gene TM
一天之計在于晨纯路，一年之計在于春或油。那么制備一個抗體，抗原的設(shè)計和表達(dá)系統(tǒng)的選擇則至關(guān)重要驰唬，可以毫不夸張的說顶岸，設(shè)計出一個好的抗原對于制備一個高質(zhì)量抗體來說就是成功了一大半。
設(shè)計抗原時叫编，對抗原的結(jié)構(gòu)分析辖佣、B細(xì)胞表位預(yù)測尤其重要。
Uniprot數(shù)據(jù)庫和CBS服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/)預(yù)測信號肽搓逾、跨膜卷谈、表位等結(jié)構(gòu)；EX-PASY服務(wù)器(http://www.expasy.org/tools)上的GOR4恃逻、HNN雏搂、SOPMA藕施、nnPredict等方法。親水性凸郑、柔韌性裳食、表面可能性、抗原表位預(yù)測芙沥、α螺旋和β折疊可以應(yīng)用DNAstar軟件預(yù)測诲祸，同時可以結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)中的蛋白結(jié)構(gòu)分析蚁廓。MOE軟件也可以預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)拐叉，同時MOE軟件可以從多個角度分析蛋白的結(jié)構(gòu)特性。
B細(xì)胞表位預(yù)測的方法及應(yīng)用線性表位的預(yù)測方法:?B細(xì)胞表位的預(yù)測方法主要集中于線性表位不恭，大量的預(yù)測B細(xì)胞表位的算法都是基于蛋白質(zhì)序列歌憨。這些算法包括：蛋白質(zhì)的親水性算法着憨、可及性算法、蛋白質(zhì)可塑性算法务嫡、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測算法甲抖、蛋白質(zhì)抗原性算法。這些方法的代表軟件有PEOPLE心铃、PREDITOP准谚、BEPITOPE、Bcepred去扣、ABCpred柱衔、BepiPred、APP等愉棱。
構(gòu)象表位的預(yù)測方法：絕大多數(shù)B細(xì)胞表位預(yù)測方法都是基于蛋白質(zhì)的一級或二級結(jié)構(gòu)的唆铐，但這些方法只能用來預(yù)測由連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位，而基于蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)來預(yù)測構(gòu)象表位的方法比較少羽氮，這是因為各種抗原的構(gòu)象表位可獲得的數(shù)據(jù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于線性表位或链。
基于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)來預(yù)測構(gòu)象表位的方法CEP：這是第一個以抗原蛋白的三級結(jié)構(gòu)PDB文件作為輸入條件，以構(gòu)象性表位預(yù)測為主要目的的網(wǎng)上免費服務(wù)軟件档押。由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中的一種澳盐，因此，可以參這些方法來預(yù)測B細(xì)胞表位令宿。
分子對接：主要用來研究分子間的相互作用與識別叼耙，進(jìn)而預(yù)測復(fù)合物結(jié)構(gòu)。常用的分子對接軟件有ZDOCK粒没、DOT筛婉、DOCK、ClusPro等。
抗原的表達(dá)系統(tǒng)的選擇
通過對抗原的結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位分析預(yù)測后爽撒，然后再結(jié)合抗體的使用要求入蛆，進(jìn)行選擇適當(dāng)?shù)膮^(qū)間以及表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行抗原表達(dá)純化。
針對于簡單的應(yīng)用WB\IHC\IF\IP這類的檢測應(yīng)用型的抗體硕勿，我們推薦的是蛋白的成熟的非跨膜區(qū)間哨毁，表達(dá)系統(tǒng)可以選擇大腸、酵母這種成功率高源武、經(jīng)濟(jì)成本相對于較低的蛋白表達(dá)系統(tǒng)扼褪，抗體的類型可以選擇多抗和單抗。同時粱栖，這類型的抗體還可以選擇直接合成多肽偶聯(lián)載體后作為抗原话浇，進(jìn)行免疫動物。
如果是正對與IF闹究、FC幔崖、細(xì)胞、抗體結(jié)合等實驗的話渣淤，我們推薦的蛋白是全長的或者成熟的跨膜和非跨膜區(qū)間岖瑰，表達(dá)系統(tǒng)主要選擇無細(xì)胞、哺乳砂代、酵母這類具有蛋白活性或者能表達(dá)出全長的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)蛋白，對應(yīng)的抗體類型主要選擇單抗和基因工程抗體率挣。
~各種分析網(wǎng)站~
https://psort.hgc.jp/form2.html?亞細(xì)胞定位分析
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/?信號肽分析
http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html?跨膜分析
https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html?線粒體轉(zhuǎn)運肽分析
http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi?核定位分析
http://www.proteinatlas.org/?表達(dá)預(yù)測（人種屬）
https://bgee.org/?page=gene?表達(dá)豐度預(yù)測
http://old.protein.bio.unipd.it/espritz/?結(jié)構(gòu)無序性分析
https://swissmodel.expasy.org/?三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/?糖基化修飾預(yù)測分析
https://www.ebi.ac.uk/interpro/?功能預(yù)測分析
