01 一般拿到細(xì)胞后擦秽，應(yīng)該注意什么?

收到細(xì)胞先不開蓋,用酒精將整個細(xì)胞瓶外壁進(jìn)行消毒，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時后(看細(xì)胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況坛梁，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時的培養(yǎng)基拍一張照片壶硅，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況葬荷，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各兩張)岖寞，排除細(xì)胞本身污染的情況抡四。

02 何時須更換培養(yǎng)基?

視細(xì)胞生長密度而定，常規(guī)細(xì)胞2-3天更換培養(yǎng)基仗谆。

03 細(xì)胞何時進(jìn)行傳代較好?

一般情況下細(xì)胞生長至完全匯合后就應(yīng)該傳代指巡，所有細(xì)胞生長都有一個要求不宜生長過密(也就是常說的長老了)，但有接觸抑制的細(xì)胞胸私，在匯合前就必須進(jìn)行傳代厌处，這類細(xì)胞一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，否則會引起細(xì)胞分化岁疼。

04 貼壁細(xì)胞如何進(jìn)行傳代?

去掉原T25培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基阔涉，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細(xì)胞捷绒，顯微鏡下觀察瑰排，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯暖侨，部分細(xì)胞剛開始脫離瓶壁椭住，加4 ml左右完全培養(yǎng)液混勻終止消化，將細(xì)胞小心吹打下來字逗，1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清京郑，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:2-1:3葫掉，1:3-1:6些举，1:6-1:8)，每T25瓶補(bǔ)足培養(yǎng)基至5-6 ml俭厚，37℃户魏、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

05 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何傳代處理?

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可叼丑，若培養(yǎng)液太多時关翎，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000 rpm/min 室溫離心5 min鸠信。棄上清纵寝，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:4-1:8)症副，每T25瓶加完全培養(yǎng)液至4-5 ml店雅，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)贞铣。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長闹啦，此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好，當(dāng)補(bǔ)液時辕坝，需避免反復(fù)吹打窍奋。

06 貼壁細(xì)胞傳代如何使用胰酶?

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時酱畅，易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多琳袄，黑渣子增多，常規(guī)細(xì)胞傳代時建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化纺酸，對于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化窖逗，細(xì)胞密度過高超過80%時，采用分步消化法餐蔬。胰酶儲存在–20°C碎紊，解凍在4°C進(jìn)行，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中樊诺，保存于–20°C仗考，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會词爬。

07 如何控制胰酶消化時間?

胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵步驟：消化過度細(xì)胞碎片增多秃嗜，黑渣子增多，細(xì)胞會成片脫落顿膨，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性锅锨，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下恋沃，反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性必搞。

不同細(xì)胞對消化液的敏感性不同，胰酶消化的時間也會有差異芽唇。胰酶消化時間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲存時間匆笤，胰酶的儲存溫度研侣，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積炮捧，消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)庶诡。消化對于新購買的細(xì)胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時間咆课，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓末誓，記錄最佳消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可书蚪。

08 細(xì)胞離心下來的離心速率應(yīng)為多少?

細(xì)胞傳代或凍存時欲回收細(xì)胞喇澡，其離心速度一般為800-1000 rpm/min，室溫離心5-8分鐘殊校，轉(zhuǎn)速過高晴玖，將造成細(xì)胞破裂死亡。

09 如何區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞?

顯微鏡下觀察：活細(xì)胞中間透亮为流，飽滿呕屎，有光澤，死細(xì)胞較暗敬察。也可以通過臺盼藍(lán)染色來計算細(xì)胞活力秀睛。

10 如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞?

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000 個/毫升，在0.1 毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺盼蘭溶液莲祸。輕輕混勻蹂安，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞〕娓活細(xì)胞排斥臺盼蘭藤抡，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞，注意計數(shù)需在加入臺盼藍(lán)10min內(nèi)完成抹估。有細(xì)胞計數(shù)儀的缠黍，可直接用計數(shù)儀進(jìn)行。

11 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性药蜻。

12 使用胰蛋白酶加入EDTA是為什么?

EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子瓷式，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前语泽，用EDTA清洗細(xì)胞贸典，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

13 可否使用與原先不同的培養(yǎng)基?

不能踱卵。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基廊驼，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基据过，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，易造成細(xì)胞狀態(tài)不好妒挎，最終造成細(xì)胞無法存活绳锅。

[圖片上傳失敗...(image-efba9e-1634632859867)]

14 可否使用與原先不同的血清種類?

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源酝掩，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響鳞芙。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同期虾，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活原朝。

15 細(xì)胞為何生長不均勻?

細(xì)胞傳代后放入培養(yǎng)箱沒有搖勻，或者放入時搖勻镶苞，但在細(xì)胞貼壁前喳坠，又移動了培養(yǎng)瓶，頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱引起的振動或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液過少宾尚，培養(yǎng)箱擱板表面不平整丙笋，這些因素會導(dǎo)致細(xì)胞生長不均勻。

16 購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳煌贴，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳御板。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。運(yùn)輸過程對細(xì)胞有嚴(yán)重影響牛郑。解凍過程錯誤怠肋。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心淹朋。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞笙各。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80°C太久础芍。

17 細(xì)胞抱團(tuán)怎么處理?

一些懸浮細(xì)胞抱團(tuán)生長是正宠厩溃現(xiàn)象，大部分懸浮細(xì)胞在細(xì)胞密度很高的情況下仑性，很可能會出現(xiàn)部分細(xì)胞抱團(tuán)生長的現(xiàn)象惶楼，聚團(tuán)細(xì)胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細(xì)胞诊杆，因此在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時需控制好細(xì)胞密度歼捐。如果出現(xiàn)了細(xì)胞團(tuán)，可以通過細(xì)胞篩去掉部分較大的細(xì)胞團(tuán)晨汹，也可以嘗試一下方法：將細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中豹储，靜置20 min左右，小心取上層細(xì)胞上清培養(yǎng)(該方法只能去除部分較大的細(xì)胞團(tuán))淘这。

18 細(xì)胞內(nèi)有空泡剥扣，是否是正彻剩現(xiàn)象?

部分細(xì)胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)钠怯，這個是正城蚣埃現(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡呻疹，則很可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳，可以通過調(diào)整血清濃度筹陵，控制消化刽锤，控制傳代比例及時間等方法來調(diào)整細(xì)胞狀態(tài);如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，且單個細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多朦佩，則可能細(xì)胞代次較高并思，細(xì)胞老化所致，需更換代次較早的細(xì)胞语稠。

19 細(xì)胞傳兩代后開始逐漸死亡的原因

很可能是培養(yǎng)體系不適合細(xì)胞(未使用推薦的培養(yǎng)體系);或者消化過度宋彼，對細(xì)胞有嚴(yán)重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細(xì)胞，傳代太稀;或者生長較快的細(xì)胞仙畦，傳代較密输涕，細(xì)胞嚴(yán)重堆疊生長)。

[圖片上傳失敗...(image-bcf360-1634632859867)]

20 細(xì)胞生長逐漸變慢是什么原因?

細(xì)胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細(xì)胞營養(yǎng)不良 4.細(xì)胞頻繁傳代 5.細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化 6.細(xì)胞存在污染慨畸。

21 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5%或10%CO2?

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)莱坎，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時寸士，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時檐什，則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

22 CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(每周一次)更換水盤里面的水弱卡，水盤的水必須使用無菌蒸餾水或無菌去離子乃正，水盤中可添加1%硫酸銅以預(yù)防霉菌污染。

23 細(xì)胞接種密度多少合適?

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可婶博。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的一個重要原因瓮具。按照我們的經(jīng)驗：一般倍增時間24 h內(nèi)的細(xì)胞，傳代比率1:6-1:12為宜凡蜻，倍增時間24-48 h的細(xì)胞搭综，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時間超過48h的細(xì)胞, 傳代比率1:2-1:4為宜划栓。

24 培養(yǎng)中常出現(xiàn)一些黑點兑巾，是污染嗎?

首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，如果變渾濁忠荞，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點大小和形狀是否規(guī)則蒋歌，是否運(yùn)動帅掘，是做布朗運(yùn)動還是呈直線型快速移動。如果黑點大小不規(guī)則堂油，做布朗運(yùn)動修档，黑點可能是細(xì)胞碎片(可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的)，也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的府框，也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物吱窝。如果黑點大小一致，快速移動迫靖，很可能是細(xì)菌污染院峡。

25 如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中黑點的產(chǎn)生?

掌握細(xì)胞傳代的最佳時機(jī)，不要細(xì)胞長老了再傳代;掌握好消化時間系宜，防止消化過度產(chǎn)生細(xì)胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數(shù);將培養(yǎng)液的PH調(diào)到最佳;嚴(yán)格控制水質(zhì)和器皿的清潔照激。

26 黑點已經(jīng)產(chǎn)生了，如何進(jìn)行處理?

如果判定黑點是污染盹牧，請及時將細(xì)胞處理后丟棄俩垃。其他情況，可參照以下進(jìn)行：

如果是懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞上清慢速離心(500-600 rpm/min汰寓，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶;如果是貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞用PBS洗2-3遍口柳，洗的時候，輕輕拍打培養(yǎng)瓶有滑，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落啄清，再棄去PBS，消化時先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右俺孙，讓細(xì)胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來辣卒，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細(xì)胞睛榄，將收集的細(xì)胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min荣茫，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶，并可以嘗試適當(dāng)增加血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)场靴。

27 培養(yǎng)用dish,flask是否相同啡莉？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同旨剥，制造程序亦不同咧欣，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異轨帜。

來源：CellMax俱樂部公眾號