2021年12月，來自熊本大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)合作在The Journal of Clinical Investigation?發(fā)表了“HTLV-1?infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma”的研究論文瞳别。該工作利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 TCR 測(cè)序等技術(shù)祟敛，證明了人類I型 T 細(xì)胞白血病病毒（HTLV-1）可激活 naive T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成人 T 細(xì)胞白血补萏（ATL）細(xì)胞，HTLV-1 感染的細(xì)胞上調(diào)了 HLA II 類分子表達(dá)并作為耐受性抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異性 T 細(xì)胞無能现拒，從單細(xì)胞水平揭示了人類I型 T 細(xì)胞白血病病毒（HTLV-1）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和免疫逃逸機(jī)制乍构。

研究背景

人類I型 T 細(xì)胞白血病病毒（HTLV-1）是第一個(gè)被報(bào)道的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒哥遮，感染了全世界至少500萬至1000萬人眠饮。HTLV-1 主要感染 CD4+?T 細(xì)胞仪召，在被感染者中誘導(dǎo)慢性、持續(xù)性感染已旧，最終約有5%-10%的感染者發(fā)展為成人 T 細(xì)胞白血苍送省（ATL）。ATL 患者的臨床表現(xiàn)多樣璃诀，可表現(xiàn)為白血病樣的急性型劣欢、淋巴細(xì)胞增生的淋巴瘤型裁良、預(yù)后較好的慢性型和隱襲型丸相。HTLV-1 會(huì)改變細(xì)胞分化彼棍、激活和存活狀態(tài)座硕，然而目前尚不清楚這些變化是否以及如何促進(jìn)感染細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化华匾。

研究思路

研究結(jié)果

1.HTLV-1 感染個(gè)體 PBMC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

研究選取3例健康個(gè)體（HD）、4例無癥狀攜帶者（AC）和9例 ATL 患者（包括3例隱襲型（SML）旭旭、5例慢性型和1例淋巴瘤型）持寄，取 PBMC稍味，進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 TCR 測(cè)序模庐。共獲得87742個(gè)細(xì)胞屑彻，聚類并鑒定得到25個(gè)群包括 T 細(xì)胞社牲、B 細(xì)胞搏恤、NK 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞湃交、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞等熟空。為了重點(diǎn)研究 T 細(xì)胞分化和 ATL 轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)，研究者進(jìn)一步將得到的46078個(gè) T 細(xì)胞進(jìn)行聚類搞莺，確定了15個(gè)細(xì)胞簇息罗，分為4個(gè)大類：感染 ATL 細(xì)胞、感染非 ATL 細(xì)胞才沧、未感染輔助 T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（圖1）迈喉。

圖1 T 細(xì)胞分群圖

差異基因分析結(jié)果表明，HTLV-1 感染細(xì)胞中高表達(dá)與 TCR 和激活通路相關(guān)的基因温圆，如 TCR 信號(hào)通路、抗原呈遞和免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路（圖2A）。進(jìn)一步評(píng)估了10個(gè)共有通路中基因的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)受感染 /ATL 群中顯著富集 HLA II 型基因（圖2B）。

圖2 ?HTLV-1 感染和ATL 細(xì)胞上調(diào) HLA II 類基因表達(dá)

2. ATL 細(xì)胞高表達(dá) TCR 信號(hào)下游的共刺激受體和基因

對(duì)整個(gè) CD4+?T 細(xì)胞先后進(jìn)行了典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）和擬時(shí)序分析來評(píng)估 T 細(xì)胞的活化評(píng)分和發(fā)育軌跡。CCA 分析結(jié)果顯示，來自 HD 的 T 細(xì)胞顯示出較低的“T 細(xì)胞激活評(píng)分”和“ Treg 評(píng)分”蜗顽，而來自 SML 或 ATL 患者的細(xì)胞具有較高的評(píng)分（圖3A崔挖、B）。擬時(shí)序分析結(jié)果顯示未感染的輔助 T 細(xì)胞聚集在擬時(shí)間軌跡的早期，而感染/ATL 細(xì)胞聚集在擬時(shí)間軸的中間。細(xì)胞的軌跡分叉成兩個(gè)不同的分支栋齿，提示存在兩種表型不同的 ATL 細(xì)胞（圖3C）菇用。頂部分支的細(xì)胞上調(diào)與轉(zhuǎn)錄和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的基因，而底部分支的細(xì)胞上調(diào)了與代謝和 TNF 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因（圖3G）。T 細(xì)胞活化和 Treg 的 CCA 評(píng)分都沿著擬時(shí)序軌跡逐漸增加溅漾，表明健康 T 細(xì)胞向 ATL 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化涉及感染細(xì)胞的活化和 Treg 表型的獲取（圖3E）。

圖3 CCA 分析顯示 ATL 細(xì)胞獲得 Treg 表型并高度活化

3. 擬時(shí)序分析揭示隨著 ATL 進(jìn)程嗅战，HLA II 和 Treg 相關(guān)基因表達(dá)被上調(diào)

由于 ATL 細(xì)胞之間存在較大的個(gè)體差異东且，可能掩蓋了每個(gè)個(gè)體 ATL 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的獨(dú)特動(dòng)力學(xué)，因此研究人員聯(lián)合了3個(gè)健康個(gè)體和單個(gè) ATL 患者的細(xì)胞共5個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了擬時(shí)序分析（圖4A）序无，確定了 ATL 細(xì)胞的軌跡：來自 HD 的細(xì)胞主要聚集在擬時(shí)間軸的早期，而來自 ATL 患者的細(xì)胞聚集在中間和末端（圖4B）隘竭。T 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示菱皆，沿著擬時(shí)序軌跡篷店，與 naive 狀態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)（CCR7）被下調(diào)携茂，而與 HTLV-1感染（CADM1）医吊、T 細(xì)胞激活和 Treg 表型相關(guān)的基因（IL2RA穗慕、FOXP3和CTLA4）表達(dá)被上調(diào)（圖4C）。表明在正常 CD4+?T 細(xì)胞從初始狀態(tài)過渡到效應(yīng)狀態(tài)時(shí)倔毙，擬時(shí)序的早期軌跡重現(xiàn)了正常 CD4+?T 細(xì)胞的發(fā)育分化途徑廊散。其后的擬時(shí)間軸顯示了 HTLV-1 感染后 T 細(xì)胞的進(jìn)程，在此期間被感染的多克隆細(xì)胞向高度擴(kuò)增的單克隆細(xì)胞過渡（圖4B锦庸、4C）甘萧。

圖4 單個(gè) ATL 樣本擬時(shí)序分析

為了確定導(dǎo)致 ATL 發(fā)展的共同因素钝鸽，研究人員評(píng)估了每個(gè)數(shù)據(jù)集 Top200 基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因富集到了一些共同的途徑河爹，如參與 IFN 和 TCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和 HLA II 類抗原呈遞酿雪。所有 ATL 患者均表達(dá)多個(gè) HLA II 類基因（圖5A磺芭、B）放棒，這些基因的表達(dá)沿?cái)M時(shí)間軸升高，表明隨著 T 細(xì)胞向 ATL 細(xì)胞轉(zhuǎn)化己英，HLA II 類基因的表達(dá)升高（圖5C）间螟。

HLA II 類分子主要存在于單核細(xì)胞或 B 細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞（APC）s 中，但它們?cè)?T 細(xì)胞中的表達(dá)也可在刺激下上調(diào)损肛。為了探討這種上調(diào)的意義厢破，研究人員比較了 APC 和不同 T細(xì)胞群之間 HLA II類基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示少數(shù)未感染的 T 細(xì)胞表達(dá) HLA II 類基因治拿，在 HTLV-1 感染的細(xì)胞中表達(dá) HLA II 的細(xì)胞的百分比增加摩泪，在 ATL 細(xì)胞中達(dá)到最高（圖5D）。

圖5 HLA II 基因的表達(dá)沿?cái)M時(shí)序軌跡上調(diào)

為了確定上述擬時(shí)序分析是否重現(xiàn)了疾病進(jìn)展的實(shí)時(shí)過程劫谅，研究人員使用一對(duì)縱向樣本與健康個(gè)體的樣本進(jìn)行軌跡推斷（圖6A）见坑。擬時(shí)序分析結(jié)果顯示，第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞分布在擬時(shí)間軸的中間捏检，第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞主要聚集在擬時(shí)間軸的末端（圖6B）荞驴，說明第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 ATL 細(xì)胞具有更極端的激活表型。RNA 速率分析也顯示了類似的模式贯城，細(xì)胞從初始狀態(tài)和記憶狀態(tài)過渡到受感染的細(xì)胞戴尸，進(jìn)一步支持了擬時(shí)序分析結(jié)果（圖6C）。HLA II 類及其相關(guān)基因的表達(dá)也顯示出擬時(shí)間軸上的顯著增加（圖6D）冤狡，證實(shí)了 HLA II 類基因表達(dá)上調(diào)是 ATL 進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵特征孙蒙。

圖6 成對(duì) ATL 樣本的擬時(shí)序分析

有趣的是，在擬時(shí)間軸的末端細(xì)胞軌跡出現(xiàn)了兩個(gè)不同的分支悲雳，表明患者這兩個(gè)分支中的 ATL 細(xì)胞有很大的差異（圖6B）挎峦。頂部分支的 T 細(xì)胞主要表達(dá)與 TNF 介導(dǎo)的信號(hào)通路和細(xì)胞粘附相關(guān)基因，而底部分支的 T 細(xì)胞主要表達(dá)與 T 細(xì)胞活化和免疫信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因（圖6E合瓢、F）坦胶。

隨后，研究者對(duì)2個(gè)分支進(jìn)行了 TCR 分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)分支中的 ATL 細(xì)胞起源于同一個(gè) TCR 克露傥（圖6B）峭咒。對(duì) HTLV-1 感染細(xì)胞（CADM1+CD7–/+）分選并進(jìn)行了基因組分析發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，只有1個(gè)顯著擴(kuò)展的克隆纪岁，表明 ATL 細(xì)胞起源于同一個(gè)克麓斩印（圖6G，餅圖）幔翰。對(duì)分選的細(xì)胞進(jìn)行了外顯子測(cè)序漩氨，鑒定了 ATL 細(xì)胞中存在的體細(xì)胞突變并描繪了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間不同的體細(xì)胞突變（圖6G）。進(jìn)一步分析了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中這些變異等位基因的頻率遗增，發(fā)現(xiàn)在2個(gè)分支之間沒有發(fā)生突變（圖6H）叫惊，表明2個(gè)分支中的細(xì)胞之間的差異是由于表觀遺傳修飾、代謝狀態(tài)和/或其對(duì)環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)性引起的做修。

4 HLA II 類基因表達(dá)與 HTLV-1 感染和病毒蛋白 Tax 相關(guān)

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) HLA II 類基因表達(dá)水平在 HTLV-1 感染/ATL 細(xì)胞中顯著上調(diào)霍狰，但在 APC（CD14+?單核細(xì)胞）中表達(dá)最高（圖7A-C）。已知 HTLV-1 病毒基因?Tax?和?Hbz?具有致癌功能, 為了確定誘導(dǎo) HLA II 類基因表達(dá)上調(diào)的基因饰及，研究人員分別用含有 HTLV-1?Tax蔗坯、HTLV-1Hbz?或 HTLV-1Nef（對(duì)照）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Kit225 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有?Tax?轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 HLA II 分子表達(dá)顯著上調(diào)（圖7D）旋炒，表明病毒蛋白?Tax?可促進(jìn) HTLV-1 感染期間 HLA II 類基因的表達(dá)上調(diào)步悠。

圖7 HLA II 類分子表達(dá)與 HTLV-1感染及病毒蛋白?Tax?相關(guān)

5. HTLV-1?感染細(xì)胞可將抗原呈遞給應(yīng)答 CD4+?T 細(xì)胞，并誘導(dǎo)無能相關(guān)基因瘫镇。

為了研究表達(dá) HLA II 類基因的 HTLV-1 感染細(xì)胞能否向 T 細(xì)胞呈遞抗原鼎兽，研究人員建立 HLA II 人類白細(xì)胞抗原 TCR 刺激體外模型，使用對(duì)癌睪丸抗原 Wilms 腫瘤蛋白1（WT1）具有特異性的 HLA-DP4 限制性 TCR（克隆9）來評(píng)估 HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞的抗原呈遞能力铣除。結(jié)果表明 HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞能夠向 CD4+?T 細(xì)胞呈遞抗原谚咬，但它們是低效的 APC，不能完全激活 CD4+?T 細(xì)胞（圖8 A-C）尚粘。研究人員進(jìn)一步評(píng)估抗原特異性刺激對(duì)無能關(guān)鍵基因表達(dá)的影響择卦，發(fā)現(xiàn)與含有 B 細(xì)胞和單核細(xì)胞的非 T 細(xì)胞相比，HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞的 TCR 刺激引起無能相關(guān)分子表達(dá)的增加（圖8B郎嫁、D）秉继。提示 HTLV-1 感染的細(xì)胞能夠上調(diào) HLA II 類分子表達(dá)來呈遞抗原，使 T 細(xì)胞無能逃避體內(nèi)免疫監(jiān)視泽铛。

圖8 HTLV-1 感染細(xì)胞可將抗原呈遞給應(yīng)答 CD4+?T 細(xì)胞尚辑，并誘導(dǎo)無能相關(guān)基因

圖9 ATL 細(xì)胞免疫抑制特性的模型

結(jié)論

基于單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，該研究提出了兩個(gè)模型來解釋 HTLV-1 感染的細(xì)胞如何逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視（圖9）盔腔，HTLV-1 感染利用了 T 細(xì)胞活化的生理機(jī)制和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)杠茬。為在 ATL 白血病發(fā)生的初始階段將 HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 ATL 細(xì)胞提供了模型月褥，并展示了受感染的克隆如何在體內(nèi)經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)：

Tan B J Y, Sugata K, Reda O, et al. HTLV-1 infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma.?Journal of Clinical Investigation, 2021, 131(24): e150472.