來(lái)源

Discriminating mild from critical COVID-19 by innate and adaptive immune single-cell profiling of bronchoalveolar lavages

影響因子： 20.507

PMID：33473155期刊年卷：Cell Res2021 Jan 21; 生物一區(qū) 細(xì)胞生物學(xué) Q1 10/190

DOI：10.1038/s41422-020-00455-9

思路

作者到涂，分析了31例輕度或重癥COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗（BAL）逾雄，納入13例非COVID-19的患者蕴侣。

1. 與非COVID-19肺炎和正常肺的BAL相比凯旋，對(duì)5例輕度和26例重癥COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗（BAL）樣品進(jìn)行了單細(xì)胞深度免疫分析国拇。使用擬時(shí)序推斷來(lái)構(gòu)建T細(xì)胞和單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞的軌跡，并沿它們模擬基因表達(dá)變化旭旭。

2. 在輕度COVID-19中咧叭，CD8 ⁺T _RM和CD4 ⁺ T-helper-17（T _H17）細(xì)胞在擬時(shí)序末端經(jīng)歷主動(dòng)的（可能是抗原驅(qū)動(dòng)的）擴(kuò)增，并具有良好的效應(yīng)子功能页滚，而在重癥的COVID-19中召边，它們?nèi)暂^原始。

3. 反之亦然逻谦，具有T-helper-1特征的CD4 ⁺ T細(xì)胞（類(lèi)似T _H1）和表達(dá)耗盡標(biāo)記的CD8 ⁺ T細(xì)胞（T _EX樣）在輕度COVID-19中的軌跡中途富集掌实，在那里它們也表現(xiàn)出良好的效應(yīng)子功能，而在重癥COVID-19中邦马，它們?cè)谲壽E結(jié)束時(shí)顯示出與炎癥相關(guān)的壓力的證據(jù)贱鼻。

4. 單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞的軌跡顯示宴卖，慢性高炎癥性單核細(xì)胞富集重癥的COVID-19，而肺泡巨噬細(xì)胞則以抗炎和抗原呈遞特征為特征而被耗盡邻悬。

5. 在重癥的COVID-19中症昏，單核細(xì)胞有助于產(chǎn)生ATP-嘌呤，從而使COVID-19相關(guān)的纖維化和疾病重癥程度惡化父丰。

6. 最后肝谭，病毒RNA跟蹤揭示了感染的肺上皮細(xì)胞以及參與病毒清除的大量嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

結(jié)果

1. ScAL-seq和BAL樣品的細(xì)胞分型

22例住院患者的BALSARS-CoV-2的qRT-PCR陽(yáng)性,13例SARS-CoV-2陰性（non-COVID-19）蛾扇，分“輕度”和“重癥”疾病組,對(duì)BAL樣品進(jìn)行scRNA-seq處理攘烛。過(guò)濾后，65,166個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到了150多個(gè)基因镀首，獲得了約1.86億個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本坟漱。其中，約51％的細(xì)胞來(lái)自COVID-19更哄。

降維和聚類(lèi)的分析聚類(lèi)（圖1a）：

淋巴樣細(xì)胞CD4 ⁺和CD8 ⁺T細(xì)胞芋齿，

自然殺傷細(xì)胞（NK），

B細(xì)胞和漿細(xì)胞成翩，

髓細(xì)胞（單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞觅捆，嗜中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞麻敌，漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞/ pDC和常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞/ cDC）

上皮細(xì)胞（包括分泌性栅炒，基底，纖毛庸论，鱗狀职辅，炎性和AT2肺上皮細(xì)胞）

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作者整合其他幾個(gè)數(shù)據(jù)集后棒呛，數(shù)據(jù)來(lái)自5位輕度和26位重癥的COVID-19患者聂示，并與10位輕度和3位重癥的非COVID-19患者進(jìn)行了比較。從數(shù)量?上看簇秒，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞是最豐富的細(xì)胞類(lèi)型鱼喉，共占COVID-19細(xì)胞的65.7％（n = 55,825）（圖 1c）。

在評(píng)估這些細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)富集或耗竭時(shí)趋观，作者發(fā)現(xiàn)與非COVID-19患者相比扛禽，COVID-19患者中單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的發(fā)生率更高，尤其是在重癥患者中（圖 1c皱坛；圖S 1i）编曼。

COVID-19中的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞較少，特別是在重癥患者中剩辟。CD8 ⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞略微富集掐场，主要發(fā)生在輕度疾病中。比較輕度和臨界COVID-19時(shí)，前者中CD8 ⁺ T細(xì)胞蜗顽，巨噬細(xì)胞和cDCs有所增加（圖 1d）验懊。

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2. COVID-19 BAL中CD8 ⁺ T細(xì)胞的表型異質(zhì)性

1. 作者總共檢索了23468個(gè)T細(xì)胞和NK細(xì)胞，將其亞簇化為14個(gè)表型（圖 2a-c嚷堡；蝗罗，圖S 2a-c）。為了避免增殖性T細(xì)胞單獨(dú)聚集蝌戒，作者在此分析中針對(duì)細(xì)胞周期基因進(jìn)行了回歸分析（請(qǐng)參閱材料和方法）串塑。
2. 確定了7個(gè)CD8 ⁺ T細(xì)胞簇，5個(gè)CD4 ⁺ T細(xì)胞簇和2個(gè)NK細(xì)胞簇北苟。

1.na?ve CD8⁺ T-cells (T_N) :CCR7拟赊，LEF1和TCF7

2.effector-memory（T _EM ):GZMK，GZMH粹淋，GZMM

3. exhaustion-like T-cells (T_EX):GZMA吸祟，GNLY，GZMB桃移，IFNG

T _EX細(xì)胞定義衰竭的免疫檢查點(diǎn):HAVCR2屋匕，CTLA4，LAG3

4.CD8⁺ resident-memory T-cells（T _RM）: ZNF683和ITGAE

5.CD8⁺recently-activated effector-memory T-cells （T _EMRA; CX3CR1借杰，F(xiàn)GFBP2过吻，F(xiàn)CGR3A）

6.identified mucosal-associated invariant T _MAIT: SLC4A10，PRSS35蔗衡，CCR6

7.gamma-delta T _γδ 細(xì)胞: TRDC纤虽，TRGC2和TRG-AS1

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圖2：輕度和重癥COVID-19 BAL中的14種T細(xì)胞表型

接下來(lái)，作者評(píng)估了COVID-19與非COVID-19疾病中每種T細(xì)胞表型的患病率绞惦，但未觀察到CD8 ⁺表型的差異（圖 2d逼纸；，圖S 2d）济蝉。當(dāng)比較輕度和臨界COVID-19時(shí)（圖 2e）杰刽，作者發(fā)現(xiàn)T _MAIT細(xì)胞在前者中略有增加。

但是王滤，對(duì)于CD8 ⁺ T _RM細(xì)胞贺嫂，輕度與臨界COVID-19的增加最大。為了理解這種差異雁乡，作者使用了Slingshot來(lái)推斷擬時(shí)序軌跡（不包括T _MAIT-和_Tγδ-細(xì)胞）第喳。作者觀察到3個(gè)不同的軌跡（圖 3a）：CD8 ⁺ T _N-細(xì)胞與T _EM-細(xì)胞連接，隨后分支為3個(gè)不同的譜系踱稍，即T _RM-細(xì)胞曲饱，T _EX-細(xì)胞和T _EMRA -細(xì)胞吩跋，幾乎所有CD8 ⁺ T _N-細(xì)胞（99.6％）被所有3條軌跡共享（，圖S2e）渔工。標(biāo)記基因锌钮，抑制性檢查點(diǎn)，細(xì)胞毒性標(biāo)記和沿著這些軌跡的增殖的譜圖證實(shí)了它們的功能性注釋?zhuān)▓D 3b引矩，c）梁丘。值得注意的是，除了增加抑制性檢查點(diǎn)和細(xì)胞毒性標(biāo)記物的表達(dá)外旺韭，CD8 ⁺ T _EX細(xì)胞的特征還在于增殖（氛谜，圖S 2f），G2M和S基因得分沿軌跡逐漸增加（圖 3b区端，c）值漫。接下來(lái)，沿著這些軌跡創(chuàng)建反映每種表型狀態(tài)下T細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的密度圖（圖 3d）织盼，并針對(duì)正常組織杨何，非COVID-19和輕度或重癥COVID-19進(jìn)行分層。非COVID-19 T細(xì)胞在T _RM譜系末期富集沥邻，而在COVID-19中危虱，T _EX譜系就是這種情況（圖 3e）。相反唐全，在T _EMRA末期埃跷，細(xì)胞向正常肺富集。當(dāng)比較輕度和臨界COVID-19時(shí)邮利，來(lái)自T _RM譜系的細(xì)胞在輕度COVID-19的譜系末尾富集弥雹，而沿著T _EX譜系，這種富集對(duì)于臨界COVID-19最為突出（圖3f）延届。

3. COVID-19 BAL中CD4 ⁺ T細(xì)胞的表型異質(zhì)性

幼稚CD4 ⁺ T細(xì)胞（T _? ; CCR7剪勿，TCF7，LEF1）

效應(yīng)記憶T細(xì)胞（T _EM ; GZMH祷愉，GZMK窗宦，ANXA1）

CD4 ⁺ T輔助1狀（T _H1樣）細(xì)胞表達(dá)T _H1樣轉(zhuǎn)錄因子（TBX21赦颇，RUNX3）免疫檢查點(diǎn)（HAVCR2二鳄，LAG-3 ，PDCD1和CTLA4）和

細(xì)胞毒性基因（NKG7媒怯，GZMB订讼，GNLY，PRF1）以及

CD4 ⁺ T-helper-17（T _H17 ; RORC扇苞，IL17A / F欺殿，CCR6寄纵，IL23R）和

CD4 ⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T _REG ; FOXP3，IL2RA脖苏，IKZF2）（圖 2c ;圖S 2b）程拭。

與非COVID-19相比，作者在COVID-19中觀察到的CD4 ⁺ T _H17-細(xì)胞略少棍潘，但更多的T _H1 -like細(xì)胞恃鞋。比較輕度和重癥COVID-19，作者發(fā)現(xiàn)T _H1樣細(xì)胞在后者中顯著增加（圖亦歉。 2d恤浪，e）。

CD4 + T _REG細(xì)胞可以進(jìn)一步分為兩個(gè)表型（TNFRSF9^高和TNFRSF9^低肴楷；水由，圖S 2k，l）赛蔫，但是由于它們復(fù)雜而獨(dú)特的發(fā)育過(guò)程砂客，作者在隨后的軌跡分析中將其排除了。

擬時(shí)序的表型異質(zhì)性呵恢，識(shí)別中央記憶CD4+T_CM 細(xì)胞和干細(xì)胞樣記憶CD4+T _SCM 細(xì)胞（圖 4a鞭盟，b）。共有3條軌跡瑰剃，這些軌跡是基于共享的TCR克隆型獨(dú)立確定的（圖 4c）齿诉。

簡(jiǎn)言之，T _N 細(xì)胞和T_CM 細(xì)胞緊密相連晌姚，接著為T(mén) _EM 細(xì)胞粤剧，其支斷為3個(gè)不同的軌跡，以形式為T(mén) _H1樣挥唠，T _H17 -和T _SCM 細(xì)胞（圖S2m）抵恋。

沿著這些軌跡分析標(biāo)記基因，抑制性檢查點(diǎn)宝磨，細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)錄因子證實(shí)了它們的功能注釋?zhuān)▓D 4d）弧关。

CD4 ⁺ T _H1樣細(xì)胞的特征是沿著其軌跡增加增殖，細(xì)胞毒性和抑制性檢查點(diǎn)的表達(dá)（圖 4d唤锉，e ; 圖S 2f）世囊。

沿著這些軌跡的密度圖顯示，COVID-19在T _H1樣和T _SCM軌跡的早期和晚期富集了T細(xì)胞窿祥，反之亦然株憾，在非COVID-19和正常肺中，它們?cè)谶@些軌跡的中途富集了（圖 4f）。

在T _H17軌跡中嗤瞎，COVID-19 BAL在軌跡的前半部分中大量富集T細(xì)胞墙歪。總體而言贝奇，來(lái)自輕度COVID-19的CD4 ⁺ T細(xì)胞的行為與正常肺或非COVID-19 BAL相似（圖 4f-g）虹菲。

從COVID-19沿T _H1樣譜系，TCR富集度和均勻度均降低掉瞳，但非COVID-19沿TH1樣譜系降低（圖 4h）届惋。

值得注意的是，這種減少在重癥的COVID-19中最為顯著（圖 4i）菠赚。

相比之下脑豹，T _H17細(xì)胞和T _SCM細(xì)胞的特征是僅在其軌跡的最后才適度降低TCR富集度，這表明衡查，主要針對(duì)特定SARS-CoV-2 PAMPs / T _H1樣細(xì)胞的選擇是抗原瘩欺。

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圖4：輕度和重度COVID-19 BAL中的CD4 ⁺ T細(xì)胞發(fā)育軌跡

總體而言，輕度COVID-19的特征是類(lèi)T _H1細(xì)胞在其軌跡的一半處發(fā)生糾纏拌牲，而在重癥COVID-19中俱饿，T _H17細(xì)胞則被阻滯在其軌跡的前半部分。

4. CD4+TH1和TH17譜系的基因表達(dá)建模

沿著這些CD4+T細(xì)胞軌跡的差異基因表達(dá)分析確定了幾個(gè)基因集塌忽。在類(lèi)似T _H1的軌跡中拍埠，

第一個(gè)基因集由幼稚（LEF1，TCF7）和未分化的（CCR7土居，S1PR1）T細(xì)胞標(biāo)記組成（圖 4j枣购；表 S7）

第二組富集促炎和抗炎標(biāo)記（CXCR4，CXCL2擦耀，ANXA1棉圈，SOCS2，LTB）

第三組通過(guò)類(lèi)似效應(yīng)子的T _H1表征（軌跡的一半）IFNG眷蜓，顆粒酶（GZMA分瘾，GZMK，GZMB）吁系，CXCR3德召，PRF1，NGK7汽纤，CCL5以及CTLA4和HAVCR2

第四組高HLA表達(dá)上岗，自動(dòng)調(diào)節(jié)標(biāo)記（LGALS1，CCL3）冒版，部分激活標(biāo)記（CXCL13）和應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記（PDIA6液茎，HSBP1，VDAC3辞嗡，PARP1）表示在運(yùn)動(dòng)軌跡的末尾捆等，提示促炎和抗炎表型與早期應(yīng)激調(diào)節(jié)的復(fù)雜混合。

第五組到線(xiàn)粒體應(yīng)激（LDHA续室，PKM栋烤，COX17，VDAC1挺狰，COX8A）明郭，與IL2戒斷相關(guān)的應(yīng)激表型（MT1E，MT1X）丰泊，蛋白毒性應(yīng)激（PSMB3 / B6 / D4 / A7 / C3薯定，HSPB11，PARK7瞳购，EIF4EBP1）和糖酵解（PGAM1）提示在T _H1樣軌跡的末端出現(xiàn)“耗竭” 话侄。

在輕度COVID-19中，T_H1樣譜系的特征在于組2基因的表達(dá)增加学赛，表明T _H1效應(yīng)子功能增加年堆。在重癥的COVID-19中，組4-5個(gè)基因的表達(dá)占主導(dǎo)地位盏浇，表明存在重癥的失調(diào)（圖S 2n）变丧。

在T _H17譜系中，作者還鑒定了5個(gè)基因集（圖 4k绢掰；表 S8）：在軌跡的早期具有高表達(dá)的前2個(gè)集不表達(dá)指示T _H17功能的標(biāo)記痒蓬。其余3個(gè)在軌跡末端高表達(dá)的基因組的特征在于T細(xì)胞效應(yīng)子功能（組3：PDCD1，CCL5滴劲，CXCR2谊却，CCR2和GZMA / B），細(xì)胞毒性活性基因的表達(dá)（組4：NKG7和PRF1）和T _H17細(xì)胞相關(guān)的白介素（第5組：IL17A哑芹，IL17F炎辨，IL23R以及IFNG和CCL4）。

值得注意的是聪姿，在輕度COVID-19中碴萧，細(xì)胞的特征在于3–5組基因的表達(dá)增加，而重癥患者則表現(xiàn)出1–2組基因的表達(dá)（圖S 2o）末购。

表明輕度COVID-19的特征在于改善的T _H1和T _H17 功能破喻。T _H1細(xì)胞和T _H17細(xì)胞的組合作用通過(guò)增強(qiáng)，平衡和調(diào)節(jié)彼此的活動(dòng)和持久性來(lái)調(diào)節(jié)針對(duì)病毒感染相關(guān)炎癥的免疫反應(yīng)盟榴。

5. COVID-19 BAL中單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的軌跡

在來(lái)自BAL的63114個(gè)單核細(xì)胞中曹质，作者鑒定出9個(gè)表型（圖 5a）。單核細(xì)胞根據(jù)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物（CD68，MSR1羽德，MRC1）和單核細(xì)胞標(biāo)記物（IL1RN几莽，FCN1，LILRA5）分開(kāi)聚集宅静。單核細(xì)胞可以進(jìn)一步分為FCN1^高章蚣，IL1B^高和HSPA6^高單核細(xì)胞（圖 5b；圖S 3a）姨夹，其特征在于經(jīng)典單核細(xì)胞標(biāo)志物（IL1RN纤垂，S100A8 / 9）的表達(dá)，促炎性細(xì)胞因子（IL1B磷账，IL6峭沦，CCL3，CCL4）和熱激蛋白（HSPA6逃糟，HSPA1A / B）吼鱼。

作者觀察到與非COVID-19相比，COVID-19中的FCN1^高和IL1B^高的單核細(xì)胞顯著增加履磨，尤其是在重癥疾病中（圖 5c蛉抓；，圖S 3c）剃诅。反之亦然巷送，在輕度和重癥疾病比較中，F(xiàn)ABP4^中等和FABP4^高泡型肺泡巨噬細(xì)胞的COVID-19均降低矛辕，盡管無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義笑跛。在輕度和臨界COVID-19中，F(xiàn)CN1^高單核細(xì)胞顯著減少聊品，而肺泡巨噬細(xì)胞增加（圖 5d）飞蹂。排除應(yīng)激誘導(dǎo)的表型（HSPA6^高單核細(xì)胞和MT1G^高巨噬細(xì)胞），作者使用擬時(shí)序 重建了兩個(gè)單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞譜系翻屈。這些由FCN1^高單核細(xì)胞的共同分支過(guò)渡為IL1B^高單核細(xì)胞陈哑，隨后是CCL2^高和CCL18^高單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞。后者隨后分支成RGS1^高單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞（RGS1譜系）伸眶，或通過(guò)FABP4^{培養(yǎng)基}成FABP4^高組織駐留巨噬細(xì)胞（肺泡譜系惊窖；圖 5e）。單核細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)沿兩個(gè)譜系均降低厘贼，而巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高（圖 5f界酒；，圖S 3d））嘴秸，如先前所報(bào)道毁欣。^{19庇谆，31，32個(gè)}密度圖顯示凭疮，在COVID-19細(xì)胞在兩個(gè)譜系（圖的前半部分中富集 5g）饭耳，證實(shí)在COVID-19單核細(xì)胞作者富集上述觀察。比較輕度和重癥的COVID-19哭尝，發(fā)現(xiàn)了相似的差異（圖 5h）哥攘。

沿肺泡譜系建模的基因表達(dá)揭示了5個(gè)基因集（圖 5i剖煌；材鹦，表 S9）。第1組和第2組的特征是炎性標(biāo)記（CXCL1-3耕姊，CCL20桶唐，CXCL8，CXCL10茉兰，CCR1尤泽，IL1B），存活因子（RAC1规脸，JAK1坯约，ZEB2，CDKN1A）莫鸭，IFN誘導(dǎo)的（抗病毒）基因（IFITM1-3）闹丐，IFIT1-3，IRF1被因，MX1 / 2）卿拴，缺氧（HIF1A）和NF-κB（NFKB1 / 2，NFKBIZ）在譜系中早期發(fā)出信號(hào)梨与，暗示單核細(xì)胞具有高炎癥狀態(tài)堕花。第3組的特征是可能的基于CD47的巨噬細(xì)胞抑制表型。第4組的特征在于表達(dá)伴侶蛋白編碼基因（CALU粥鞋，CALR缘挽，CANX，PDIA4呻粹，HSP90B1）壕曼，這對(duì)于MHC分子的抗原加載機(jī)制的強(qiáng)大功能至關(guān)重要，而在第5組中尚猿，有明顯的抗原呈遞跡象（許多MHC II類(lèi)基因的表達(dá)）窝稿。

輕度COVID-19的特征是髓細(xì)胞中具有促吞噬功能和促進(jìn)抗原呈遞的功能，而重癥COVID-19的特征在于與單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞抑制和ATP嘌呤信號(hào)有關(guān)的令人擔(dān)憂(yōu)的疾病特征-炎癥小體凿掂，可能使COVID-19相關(guān)性纖維化伴榔，并可能加重患者的預(yù)后纹蝴。

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圖5：COVID-19 BAL中單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化

6. 定性評(píng)估COVID-19中的T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能

1. 作者使用REACTOME基因集對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分，并且在比較COVID-19與非COVID-19 BAL時(shí)踪少，作者觀察到非COVID-19 T細(xì)胞和單核細(xì)胞中的IFN信號(hào)持續(xù)降低（塘安，圖S 4a）。
2. 在輕度和重癥COVID-19中援奢，作者觀察到CD8 ⁺ T _RM-和T _EX中的IFN-（I型和II型）兼犯，白介素（例如IL12和IL6）和寡聚腺苷酸合成酶（OAS）抗病毒應(yīng)答信號(hào)通路增加了（圖 5k；集漾，圖S 4b切黔，e）。
3. CD4 ⁺ T _H1同樣以輕度COVID-19中的IFN-（I型和II型）和白介素（IL6具篇，IL12纬霞，IL21）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為特征（圖 5l；驱显，圖S 4f诗芜，g）。
4. 此外埃疫，TRAF6誘導(dǎo)的NF-κB和IRF7激活以及TGFBR復(fù)合物激活也增加了伏恐。在T _H17譜系中觀察到了類(lèi)似的效果（，圖S 4h栓霜，i）翠桦。
5. 輕度COVID-19中，肺泡巨噬細(xì)胞譜系的特征是吞噬作用相關(guān)的途徑增加（清除受體叙淌，脂類(lèi)毒素或白三烯的合成）和IFN信號(hào)傳導(dǎo)（圖 5m秤掌；，圖S 4j–m）鹰霍。
6. 反之亦然闻鉴，在重癥的COVID-19中，IL10信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（抑制IFN反應(yīng)）茂洒，趨化因子受體結(jié)合和ATF4介導(dǎo)的ER應(yīng)激反應(yīng)增加孟岛。

由于輕度和重癥COVID-19富集IFN信號(hào)通路，因此作者評(píng)估了IFN基因及其受體的特異性表達(dá)督勺，以及與抗病毒應(yīng)答有關(guān)的幾種重癥趨化因子/細(xì)胞因子（圖S5a）渠羞。IFN基因IFNG和IFNE以及IFN受體IFNAR2和IFNGR2在COVID-19和非COVID19中上調(diào)，表明IFN信號(hào)在增強(qiáng)抗SARS-Cov-2反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用智哀。這也適用于IL6次询，CCL3和CCL4，以及其他幾種IFN反應(yīng)基因（IFITM1 / 2瓷叫，MX2屯吊，IRF7送巡；圖S 5c）。

當(dāng)比較COVID-19輕癥患者與重癥患者時(shí)盒卸，作者發(fā)現(xiàn)IFNLR1骗爆，IFNA1，CXCL9蔽介，CXCL10摘投，IL15和IL15RA在輕癥患者中被上調(diào)（圖S 5b）。在輕度COVID-19患者中虹蓄，MHC-II表達(dá)也顯著上調(diào)（HLA-DRB5犀呼，HLA-DQB2，HLA-DPB1等武花；圖S 5d）圆凰。

1. 作者使用一套廣泛的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞標(biāo)記基因杈帐，以區(qū)分從單核細(xì)胞14154個(gè)嗜中性粒細(xì)胞（圖：S 6a体箕，b），并比較了這些已公布的scRNA-SEQ的數(shù)據(jù)集挑童，以確認(rèn)它們表示可靠嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)志物（圖S 6c-e）累铅。
2. 中性粒細(xì)胞被亞群化為5個(gè)表型（圖 6a，b站叼；娃兽，圖S 6f）。
3. 第一簇由基于CXCR4和CD63的“祖細(xì)胞”嗜中性粒細(xì)胞組成尽楔，并且其特征還在于血管生成因子VEGFA的表達(dá)和組織蛋白酶（CTSA和CTSD）（圖 6c）投储。
4. 第二個(gè)簇由表達(dá)LTF，LCN2阔馋，MMP8 / 9玛荞，PADI4和ARG1的少數(shù)“未成熟”嗜中性粒細(xì)胞組成。第3組和第4組由“炎癥成熟”的中性粒細(xì)胞組成呕寝，均表達(dá)特征性足跡勋眯，突出了中性粒細(xì)胞的抗病原性：
5. 第3組表達(dá)了IFN誘導(dǎo)的基因和鈣粒蛋白（S100A8 / 9，S100A9和S100A12）下梢，可調(diào)節(jié)炎癥客蹋，而第4組則表達(dá)高水平的細(xì)胞因子（IL1B）和趨化因子（CXCL8，CCL3和CCL4）孽江。
6. 最后一個(gè)子集由于其巨噬細(xì)胞樣特征而被稱(chēng)為“雜交”嗜中性粒細(xì)胞讶坯，即表達(dá)II類(lèi)MHC和補(bǔ)體激活基因（C1QB，C1QC岗屏，CD74）辆琅，組織蛋白酶（CTSB钧舌，CTSL）和APOE。
7. 在COVID-19中涎跨，所有中性粒細(xì)胞亞群均比非COVID-19更為頻繁洼冻，但對(duì)于“祖細(xì)胞”和“炎性成熟”中性粒細(xì)胞，注意到最明顯的變化（圖 6d）隅很，對(duì)于輕度和重度COVID-19非COVID-19比較撞牢，盡管并不總是很明顯（圖 6e；叔营，圖S 6g）
8. 實(shí)際上屋彪，COVID-19中嗜中性粒細(xì)胞的富集與疾病的重癥程度，肺損傷和細(xì)菌感染（绒尊，表S11）以及年齡畜挥，性別和潛在疾病無(wú)關(guān) 。

總體而言婴谱，這表明中性粒細(xì)胞在COVID-19肺炎中起特定作用蟹但，而不僅代表重癥肺部炎癥的標(biāo)志。

9. 作者還鑒定了1410個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）谭羔，可以將其亞簇化為6個(gè)既定種群（圖 6f华糖，g；瘟裸，圖S 6h客叉，i）。在COVID-19和非COVID-19之間话告，這些均無(wú)顯著差異兼搏，而輕度COV-19與重癥COVID-19相比，遷徙DC和朗格漢斯細(xì)胞樣DC更為頻繁（圖 6h沙郭，i佛呻；，圖S 6j）棠绘。
10. 在1397個(gè)B細(xì)胞內(nèi)件相，作者獲得了4個(gè)單獨(dú)的簇（圖 6j；氧苍，圖S 6k）夜矗。
11. 濾泡性B細(xì)胞由“幼稚”（CD27 ^–）和“記憶”（CD27 ⁺）B細(xì)胞組成。前者的特征是獨(dú)特的CD27 ^– / IGHD ⁺（IgD）/ IGHM ⁺（IgM）基因集让虐，并通過(guò)在生發(fā)中心遷移形成CD27 ⁺ / IGHD ^–（IgD）/ IGHM ^–（IgM）而產(chǎn)生后者紊撕。記憶B細(xì)胞（圖 6k，1）赡突。
12. 然后对扶，記憶B細(xì)胞進(jìn)一步分化為分泌抗體的漿細(xì)胞（IGHA1区赵，IGHG1，JCHAIN）浪南，它們本身又可以分為短壽命和長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞笼才。作者未能鑒定長(zhǎng)壽命的漿細(xì)胞（因?yàn)檫@些是駐留在骨髓和脾臟，非增殖細(xì)胞^{43络凿，44}骡送，但能夠短命的漿細(xì)胞分成兩個(gè)亞簇⌒跫牵“活躍”漿細(xì)胞的第一子群集表達(dá)高水平的PRDM1（Blimp-1）和XBP1摔踱，表明具有高抗體分泌能力，而第二個(gè)簇稱(chēng)為“終末”漿細(xì)胞富集CCL2和CCL5怨愤，但其特征還在于G2M和S細(xì)胞周期評(píng)分降低線(xiàn)粒體基因表達(dá)增加派敷，表明持續(xù)的壓力（圖 6m）。
13. 值得注意的是撰洗，后一種人群的特征是BCR克隆性增加和BCR均勻性降低（圖 6n）篮愉。與非COVID-19相比，COVID-19的成熟幼稚B細(xì)胞和活性漿細(xì)胞增加了赵，而COVID-19的終末漿細(xì)胞減少潜支，盡管無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 6o）。
14. 盡管這些影響主要是由重癥COVID-19與非COVID-19（柿汛，圖S 6l）驅(qū)動(dòng)的，但輕度與重癥COVID-19（圖6p）之間沒(méi)有顯著差異 埠对。

這表明COVID-19中的末端漿細(xì)胞的特征是亞最佳的分化或激活络断，這可能會(huì)導(dǎo)致COVID-19中的缺陷或適得其反的抗體反應(yīng)。

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圖6：COVID-19 BAL中的中性粒細(xì)胞项玛，樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞表型

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8. 上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的SARS-CoV-2病毒顆粒

作者檢索到22,215個(gè)上皮細(xì)胞貌笨，類(lèi)似于Chua等人對(duì)其進(jìn)行了亞群化。

1. 分為7個(gè)不同的簇（圖 7a襟沮，b锥惋；，圖S 7a–e）开伏，最大的3個(gè)簇由分泌性膀跌，纖毛和鱗狀肺上皮細(xì)胞組成。稀有的上皮細(xì)胞類(lèi)型固灵，可調(diào)節(jié)鹽平衡（圖 7c捅伤；，圖S 7f）巫玻。輕度和重癥COVID-19之間無(wú)顯著差異（圖 7d）丛忆。
2. 與非COVID-19相比祠汇，COVID-19中的ACE2和TMPRSS2表達(dá)增加，分別有2.3％和21％的COVID-19上皮細(xì)胞表達(dá)這些基因（圖 7e熄诡，f）可很。
3. 淋巴樣和髓樣的總數(shù)比上皮細(xì)胞更高的映射到（圖 7g）。RNA編碼刺突蛋白（S在細(xì)胞病毒進(jìn)入過(guò)程中與ACE2相互作用的）幾乎完全在上皮細(xì)胞中被檢測(cè)到凰浮，上皮細(xì)胞也是唯一表達(dá)ACE2和TMPRSS2的細(xì)胞（圖 7h根穷，i）。
4. 有趣的是导坟，差異基因表達(dá)分析顯示屿良，S +上皮細(xì)胞表現(xiàn)出IFN刺激基因（IFI6 / 27，ISG15 / 20惫周，IFITM1 / 3等尘惧；圖 7j）和IFN信號(hào)通路（圖 7k）的表達(dá)減少。在髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞中檢測(cè)到的核衣殼蛋白（N）以及在較小程度上編碼ORF10和ORF1a的mRNA的水平要高于上皮細(xì)胞（圖 7h）递递。
5. 嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是最常見(jiàn)的N +細(xì)胞類(lèi)型（圖 7l）喷橙。N⁺ VS N -的差異基因表達(dá)中性粒細(xì)胞鑒定出轉(zhuǎn)錄因子BCL6的上調(diào)，該因子可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的存活和病毒感染后的炎癥反應(yīng)登舞，以及許多IFN誘導(dǎo)的基因（IFITM3贰逾，IFIT1-3，MX1 / 2菠秒，ISG15疙剑，RSAD2等；圖 7m）践叠。
6. 當(dāng)比較N⁺ VS N -肺泡和-單源性巨噬細(xì)胞言缤，作者注意到參與MHC II類(lèi)表達(dá)，并在一定程度上基因也IFN-誘導(dǎo)的基因（IFIT3禁灼，IRF7管挟，MX2，OAS1弄捕，OAS3）中過(guò)表達(dá)僻孝，在是不太明顯的效果N⁺ VS N -monocytes（圖s7g-I ）。
7. 對(duì)差異表達(dá)基因的途徑分析顯示守谓，使用REACTOME和使用GO的Response_to_virus對(duì)N +-嗜中性粒細(xì)胞上調(diào)的基因進(jìn)行IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖 7n穿铆，o）。
8. 在不同的嗜中性粒細(xì)胞表型中分飞，富集表達(dá)鈣粒蛋白的“炎癥成熟”嗜中性粒細(xì)胞（圖 7p）铲敛。茎杂，臨界COVID-19與輕度COVID-19中存在明顯更多的N（S 7j砸抛，k）讹蘑。

雖然S + -（感染的）上皮細(xì)胞減少I(mǎi)FN信號(hào)傳導(dǎo)，但N + -中性粒細(xì)胞的特征是IFN信號(hào)傳導(dǎo)增加，這表明中性粒細(xì)胞是與SARS-CoV-2病毒顆粒相互作用的主要細(xì)胞類(lèi)型，并解釋了病毒材料的采購(gòu)量最高，與其作為感染的先天免疫反應(yīng)者的作用相符叨恨。

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圖7：上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的SARS-CoV-2 RNA檢測(cè)

9. 細(xì)胞間通信可揭示COVID-19 BAL的免疫情況

1. 首先，作者計(jì)算出的細(xì)胞類(lèi)型（之間的相互作用P?≤0.05）分別為輕度和臨界COVID-19挖垛，然后作者評(píng)估在特定交互的數(shù)量差異痒钝。
2. 中性粒細(xì)胞的特點(diǎn)是特異性相互作用的數(shù)量較少，在重癥性COVID-19與輕度COVID-19中較常見(jiàn)痢毒。
3. 反之亦然送矩，在所有其他免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間，尤其是在輕度COVID-19中哪替，預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)生許多特異性相互作用（圖 8a栋荸，b; 圖S 8）。
4. 在重癥的COVID-19中凭舶，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞之間的特異性相互作用幾乎總是涉及促遷移相互作用（FLT1晌块，NRP1或NRP2 / VEGFA，CXCL1或CXCL2或CXCL8 / CXCR2帅霜，CCL3或CCL7 / CCR1）匆背，并伴有免疫抑制作用交互，如LILRB1或LILRB2 / HLA-F和RPS19 / C5AR1身冀，這也誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞功能障礙（圖 8C）钝尸。
5. 一些刺激性T細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞的相互作用，包括IFNG / II型IFNR闽铐，PDCD1 / CD274蝶怔，LTA / TNFRSF1A或TNFRSF1B（圖 8d），而特定的上皮細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞的相互作用僅限于髓系混合物免疫抑制（RPS19 / C5AR1）和病毒感染相關(guān)的促炎信號(hào)（TNFRSF14 / TNFSF14）（圖 8E）兄墅。
6. 在T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一些免疫刺激或自動(dòng)調(diào)節(jié)相互作用（CTLA4或CD28 / CD80或CD86澳叉，CCL5 / CCR5）（圖 8f）隙咸，但重癥COVID-19中T細(xì)胞的特異性上皮相互作用僅限于促炎性ICAM1介導(dǎo)的相互作用（圖 8g）。
7. 在輕度COVID-19中觀察到了非常不同的情況（圖 8c-g）成洗。在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞之間的眾多相互作用中五督，作者注意到白介素信號(hào)傳導(dǎo)（雙向IL1B，IL1A瓶殃，IL1RN / A信號(hào)傳導(dǎo)充包，IL7 / IL7R，CXCR2 / CXCL1或CXCL8），還有MRC1 / PTPT（吞噬作用）和LTBR / LTB（促炎）基矮。
8. T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的特異性相互作用涉及CCR1 / CCL3或CCL3L1（促炎癥）淆储，CD2/ CD58（共刺激/免疫原性途徑）和CD94：NKG2E / HLA-F（抗病毒免疫監(jiān)視），而在上皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞之間家浇，IL1R / IL1A或IL1B或IL1R相互作用最為明顯（可促進(jìn)生產(chǎn)性嗜中性白細(xì)胞免疫在免疫控制/免疫原性的背景下）本砰。
9. 相互作用也上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞之間觀察GAS6或PROS1 / AXL（受體介導(dǎo)的吞噬作用），ADORA2B / ENTPD1（細(xì)胞外ATP降解/抑制）钢悲，CD83 / PECAM1（免疫激活）和信號(hào)量與它們的plexin和NRP受體相互作用（組織重塑和修復(fù)）点额。
10. 在上皮細(xì)胞和T細(xì)胞之間，作者觀察到主要是共刺激（CD46 / JAG1莺琳，CD40LG / CD40还棱，IL7R / IL7，MICA或RAET11 / NKG2D受體）和組織修復(fù)相互作用（TGFB1 / TGFR2和TGFB1 / TGFBR3）惭等。
11. T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞珍手，還有其他共同刺激（LTA / TNFRSF1A或TNFRSF1B或TNFRSF14，TNFSF10 / TNFRSF10B）或組織修復(fù)因子（CSF1 / CSFR1咕缎，TGFBR3 / TGFB1珠十，IL15RA / IL15），T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞毒性（的介質(zhì)FASLG / FAS）和抗病毒免疫監(jiān)視（NKG2D II受體/ MICB或MICA）凭豪。

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圖8：上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊