敗血癥是一種具有挑戰(zhàn)性的臨床綜合征扼睬，由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起划煮。在這里裆操，我們在單核細胞和巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了一種意想不到的烏頭類脫羧酶1（ACOD1）的前體活性官地。以前的研究表明酿傍，ACOD1，也被稱為免疫反應(yīng)基因1驱入，是一個免疫代謝調(diào)節(jié)器赤炒，有利于烏頭酸鹽的產(chǎn)生，以抑制細菌脂多糖誘導(dǎo)的先天免疫亏较。我們使用脂多糖激活的THP1細胞的下一代測序莺褒，證明ACOD1的積累通過激活細胞因子風暴，主要是通過腫瘤壞死因子信號通路雪情，賦予強大的促炎癥反應(yīng)遵岩。我們進一步發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）在蘇氨酸-160上的磷酸化通過活化C激酶1受體介導(dǎo)了有絲分裂原激活的蛋白激酶8的激活旺罢，導(dǎo)致人類和小鼠巨噬細胞或單核細胞中JUN依賴性的ACOD1轉(zhuǎn)錄旷余。髓系細胞中CDK2或ACOD1的基因缺失，或給予CDK抑制劑dinaciclib扁达，可保護小鼠免受多菌性敗血癥的影響正卧，并與改善生存和減少細胞因子風暴有關(guān)。在一個由40名細菌性敗血癥患者組成的隊列中跪解，CDK2-ACOD1軸的表達也與疾病的嚴重程度相關(guān)炉旷。因此，我們的研究結(jié)果為ACOD1在先天性免疫中的功能提供了以前沒有認識到的證據(jù)叉讥，并表明它是治療敗血癥的一個潛在治療目標窘行。
1. CDK inhibitors block ACOD1 expression
雖然ACOD1的基礎(chǔ)表達非常低，但在小鼠巨噬細胞系中图仓，它被LPS處理（5μg/ml）高度誘導(dǎo)1罐盔。作者首先用Western blots檢測了LPS處理后ACOD1在THP1中表達的時間和劑量反應(yīng)曲線。用5 μg/ml的LPS處理6小時后救崔，THP1細胞中的誘導(dǎo)性ACOD1表達達到頂峰惶看，盡管100 ng/ml的LPS也強烈誘導(dǎo)ACOD1上調(diào) (fig. S1, A and B)。LPS是通過細胞膜上的Toll樣受體4（TLR4）或細胞質(zhì)中的caspase 11（CASP11）被細胞識別六孵。在培養(yǎng)的野生型（WT）和Casp11 -/-初級小鼠腹腔巨噬細胞（PMs）中纬黎，LPS強烈上調(diào)Acod1 mRNA，但在Tlr4 -/-小鼠的PMs中則沒有(fig. S1C)劫窒。此外本今，通過電穿孔將LPS直接送到細胞膜上，也不能誘導(dǎo)PMs中Acod1 mRNA的表達 (fig. S1C)。因此冠息，LPS誘導(dǎo)的ACOD1的上調(diào)需要TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)挪凑。
Fig 1A： 蛋白激酶是TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分。為了確定負責LPS誘導(dǎo)ACOD1表達的關(guān)鍵激酶铐达，作者使用美國食品和藥物管理局（FDA）批準的429種蛋白激酶抑制劑庫岖赋，進行了四輪劑量依賴的藥物篩選。
Fig 1B： 第一輪篩選顯示瓮孙，92個10μM的化合物，包括14個CDK抑制劑（占所有化合物的15.22%）选脊，完全阻斷了LPS誘導(dǎo)的ACOD1在THP1細胞的表達杭抠。第二輪和第三輪分別以1μM和100nM的劑量進行篩選，進一步證實CDK抑制劑是作者篩選試驗中LPS誘導(dǎo)的ACOD1蛋白表達的最有力的抑制劑恳啥。
Fig 1C： 在這些抑制劑中偏灿，10nM的dinaciclib也有效地阻斷了LPS誘導(dǎo)的ACOD1蛋白在人類單核細胞（THP1細胞）和小鼠PMs、BMDMs和RAW264.7的上調(diào)钝的。
Fig 1D： 一致的是翁垂，dinaciclib限制了LPS誘導(dǎo)的ACOD1 mRNA上調(diào)。
2. CDK2 phosphorylation on Thr160 drives ACOD1 expression
哺乳動物細胞含有九個CDK成員硝桩，CDK抑制劑通常針對不止一個CDK沿猜。例如，dinaciclib可抑制CDK1碗脊、CDK2啼肩、CDK5和CDK9。
Fig 1E：為了確定哪個CDK成員是LPS誘導(dǎo)的ACOD1上調(diào)的關(guān)鍵啟動器衙伶，作者分析了14種CDK抑制劑（SNS-032祈坠、flavopiridol、PHA-793887, AT7519, BS-181, AZD5438, flavopiridol, R547, dinaciclib, abemaciclib, LDC000067, SU9516, purvalanol A, and P276-00）在第一輪篩選中完全阻斷ACOD1表達矢劲。其中赦拘，有10種和8種CDK抑制劑被報道分別抑制了CDK2和CDK1。因此芬沉，作者在研究中重點關(guān)注CDK2和CDK1在調(diào)控ACOD1表達中可能發(fā)揮的作用躺同。
Fig 1F-H： 作者使用基于慢病毒的短發(fā)夾RNA（shRNA）生成CDK1-或CDK2-封鎖的THP1細胞。沉默CDK2花嘶，而不是CDK1笋籽，阻止了LPS誘導(dǎo)的ACOD1蛋白和mRNA在THP1細胞中的表達。
此外椭员，LPS誘導(dǎo)的ACOD1表達的上調(diào)在髓系細胞中Cdk2條件性敲除的小鼠（LysM-Cre;Cdk2 flox/flox小鼠车海，稱為Cdk2 Mye/-小鼠）中受到抑制。抑制CDK2未能誘導(dǎo)LPS處理的THP1細胞的細胞周期停止。將細胞暴露在dinaciclib下6小時侍芝，可抑制ACOD1的上調(diào)研铆，但對細胞周期沒有影響。因此州叠，CDK2的經(jīng)典細胞周期調(diào)控功能與LPS對ACOD1的上調(diào)無關(guān)棵红。
Fig 1I： 作者進一步觀察到，LPS迅速誘導(dǎo)CDK2在Thr 160上磷酸化咧栗，這是CDK2激酶激活的一個重要殘基逆甜。
Fig 1J, K： 為了評估CDK2在Thr 160上的磷酸化對誘導(dǎo)ACOD1表達的重要性，作者比較了WT和Thr 160突變體（T160A）CDK2在CDK2停用的細胞中恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的ACOD1表達的能力致板。與WT CDK2 cDNA相比交煞，轉(zhuǎn)導(dǎo)T160A突變體的cDNA未能挽救LPS誘導(dǎo)的ACOD1在CDK2停用細胞中的蛋白表達。因此斟或，CDK2 Thr160對于LPS誘導(dǎo)的ACOD1蛋白表達是必不可少的素征。
3. CDK2 activates the JUN-dependent ACOD1 expression
以前的一項研究表明，NF-kB途徑的激活有助于LPS誘導(dǎo)的ACOD1的表達萝挤。為了排除CDK2介導(dǎo)的ACOD1蛋白表達是否需要NF-kB途徑御毅，作者測量了p65的磷酸化，這是NF-kB激活的一個主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件怜珍。用dinaciclib對CDK2的藥理抑制或基因耗竭同樣未能抑制LPS誘導(dǎo)的p65磷酸化端蛆，表明NF-kB不負責LPS誘導(dǎo)的ACOD1蛋白表達 (fig. S4A, B)。
Fig 2A： 為了確定CDK2介導(dǎo)的ACOD1上調(diào)的關(guān)鍵下游效應(yīng)器绘面，作者使用了proteome profiler antibody array來評估CDK2清除對45個應(yīng)激相關(guān)蛋白的磷酸化的影響欺税。這一篩選顯示，LPS誘導(dǎo)的JUN（p-JUN）在Ser 63的磷酸化依賴于CDK2揭璃。
應(yīng)該用的是這個晚凿，就是高通量western，好方便的樣子哦
Fig 2B： LPS誘導(dǎo)的p-JUN在3小時后在THP1瘦馍、RAW264.7和BMDM細胞中上調(diào)歼秽，這伴隨著JUN蛋白總量的增加。盡管p-JUN可以調(diào)節(jié)其自身的轉(zhuǎn)錄和隨后的蛋白表達情组，但在CDK2敲除的細胞中燥筷，LPS誘導(dǎo)的這一過程減弱了，表明CDK2是LPS誘導(dǎo)的JUN上調(diào)和磷酸化的必要條件院崇。
Fig 2C, D： 在 time course analysis 中肆氓，發(fā)現(xiàn)通過shRNA敲除JUN也減弱了LPS誘導(dǎo)的ACOD1 mRNA和蛋白的表達，而CDK2的豐度沒有改變 (fig. S6C)底瓣。然后將JUN-cDNA或帶有FLAG表位標簽的CDK2-cDNA在JUN停用的THP1細胞中過量表達谢揪。JUN的過表達 (C)，而不是CDK2的過表達 (D)，抑制了LPS誘導(dǎo)的ACOD1在JUN sh的細胞中的上調(diào)拨扶。因此凳鬓，JUN在驅(qū)動LPS誘導(dǎo)的ACOD1表達中作為CDK2的下游效應(yīng)器。
由于JUN是LPS信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子之一患民，作者探討了JUN是否通過其轉(zhuǎn)錄因子活性來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的ACOD1上調(diào)缩举。細胞分餾和免疫熒光實驗表明，LPS誘導(dǎo)p-JUN在細胞核中的Ser 63處上調(diào)和積累匹颤，這是JUN作為轉(zhuǎn)錄因子被激活的一個關(guān)鍵步驟 (fig. S7, A and B)仅孩。LPS誘導(dǎo)p-JUN的時間最早為1小時 (fig. S7C)，這比LPS誘導(dǎo)的ACOD1 mRNA表達要早印蓖，首次觀察到是在3小時 (fig. S7D)杠氢。對編碼ACOD1的基因啟動子序列的生物信息學(xué)分析確定了17個putative JUN binding motifs (table S1)。
Fig 2E： 因此另伍，作者設(shè)計了五對引物，這些引物端對端重疊绞旅，覆蓋了所有推定的結(jié)合位點摆尝，并通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析來檢測JUN與ACOD1啟動子的結(jié)合情況。
Fig 2F： 與其他預(yù)測區(qū)域相比因悲，ACOD1啟動子上-219和-86堿基對（bp）之間的一個區(qū)域堕汞，包含得分最高的JUN反應(yīng)元件（-213至-207 bp），在LPS刺激后1小時高度富集晃琳。
Fig 2G： 為了研究JUN反應(yīng)元件（-213至-207 bp）對ACOD1啟動子活性的影響讯检，我們將含有ACOD1啟動子1000bp片段或含有突變體JUN結(jié)合區(qū)的ACOD1啟動子片段的熒光素酶報告構(gòu)建體與JUN蛋白表達質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293FT胚腎細胞。在有JUN質(zhì)粒的情況下卫旱，觀察到WT啟動子報告者的熒光素酶活性增加人灼。相反，JUN反應(yīng)元件的突變導(dǎo)致ACOD1啟動子報告者的熒光素酶活性下降顾翼，進一步支持JUN反應(yīng)元件負責ACOD1啟動子的活性投放。
常規(guī)的找到目的蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，Chip+熒光報告基因驗證适贸。
4. CDK2-mediated JUN activation relies on a direct interaction with receptor for activated C kinase 1 and mitogen-activated protein kinase 8
Fig 3A： 雖然CDK2和JUN都在核區(qū)被發(fā)現(xiàn)灸芳，但IP分析沒有顯示CDK2在LPS刺激的細胞的核成分中與JUN結(jié)合。另外拜姿，CDK2也可以定位在細胞質(zhì)或細胞膜上烙样，在那里它可能通過其他信號途徑促進JUN的激活。為了測試這種可能性蕊肥，作者用IP結(jié)合定量質(zhì)譜法（IP-MS谒获，參考：免疫沉淀-質(zhì)譜聯(lián)用(IP-MS)抗體驗證）來確定THP1細胞在沒有或有LPS處理時的CDK2結(jié)合蛋白。所有組別[未處理組、LPS組和非特異性結(jié)合的免疫球蛋白G（IgG）組]共鑒定了820個蛋白究反，發(fā)現(xiàn)34個未與對照IgG結(jié)合的候選蛋白在LPS暴露后與CDK2相互作用寻定。隨后對肽譜匹配度（PSM）和覆蓋率較高的候選蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)活化C激酶1受體（RACK1）是特定CDK2結(jié)合蛋白的首要候選蛋白精耐。
Fig 3B, C： CDK2和RACK1之間的相互作用被Co-IP分析所證實狼速，這種相互作用被CDK2的sh所消除。
Fig 3D： 在用LPS或dinaciclib處理期間卦停，CDK2和RACK1之間的相互作用沒有改變向胡，這表明LPS和dinaciclib對CDK2 RACK1復(fù)合物的影響是功能性的。
Fig 3F, G, H： 通過shRNA敲除RACK1惊完，減少了LPS誘導(dǎo)的p-JUN和ACOD1在THP1細胞的豐度僵芹。由于LPS后JUN的豐度不一，RACK1和JUN之間的相互作用很難在THP1細胞中表現(xiàn)出來（圖3C）小槐，表明RACK1可能不直接調(diào)節(jié)p-JUN拇派。因為RACK1已被證明可以招募絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）來激活p-JUN以促進腫瘤生長，作者假設(shè)CDK2通過形成RACK1-MAPK8復(fù)合物來激活JUN凿跳。LPS刺激增加了RACK1和MAPK8之間的相互作用件豌，這一過程被dinaciclib減少（圖3，D和E）控嗜。敲除CDK2和RACK1也同樣減少了LPS誘導(dǎo)的MAPK8磷酸化（圖3茧彤，G和H）。
Fig 3I： 小分子化合物BI-78D3對MAPK8的抑制也削弱了LPS誘導(dǎo)的MAPK8磷酸化疆栏、p-JUN和ACOD1在THP1和BMDMs的上調(diào)曾掂。
Fig 3J： LPS誘導(dǎo)的MAPK8和JUN之間的相互作用被BI-78D3所阻斷。
Fig 3K： 此外壁顶，T160A突變體CDK2抑制了LPS引起的MAPK8的磷酸化珠洗。
5. The CDK2-JUN-ACOD1 axis mediates TNF pathway activation
Fig 4A, B： 接下來富岳，作者進行了RNA測序蛔糯，以確定LPS激活的WT、CDK2敲除（CDK2KD）和JUN敲除（JUNKD）的THP1細胞之間的轉(zhuǎn)錄組差異窖式。差異表達基因的通路富集分析顯示蚁飒，TNF信號通路是受LPS影響最大的免疫信號通路 (A)，這與LPS是細菌感染期間TNF激活的強刺激因素的觀點一致萝喘。然而淮逻，LPS對TNF信號通路的激活在CDK2KD和JUNKD細胞中受到限制（A, B）琼懊。核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體蛋白家族是一組模式識別受體，已知介導(dǎo)對感染和損傷的初始先天免疫反應(yīng)爬早，是另一個被CDK2或JUN缺失抑制的途徑（A）哼丈。
Fig 4C, D： 此外，基因集富集分析（GSEA）顯示筛严，LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)（C）和細胞因子的產(chǎn)生（D）在CDK2KD和JUNKD細胞中被減弱醉旦，支持CDK2和JUN在介導(dǎo)LPS信號中的普遍促炎作用。
Fig 4E, F： 除了前50個CDK2/JUN依賴的LPS上調(diào)的基因是促炎癥介質(zhì)桨啃。熱圖分析進一步顯示车胡，LPS誘導(dǎo)的TNF信號通路中的29個上調(diào)基因在CDK2KD中被LPS inKD WT抑制，但在CDK2KD和JUNKD THP1細胞中沒有抑制照瘾，支持LPS誘導(dǎo)的ACOD1的上調(diào)是CDK2和JUN依賴的結(jié)論匈棘。
Fig 5A： 為了闡明ACOD1上調(diào)和TNF信號通路的基因表達增加之間的關(guān)系，作者使用聚類定期間隔短回文重復(fù)（CRISPR）和CRISPR相關(guān)蛋白9技術(shù)來創(chuàng)建ACOD1-/-THP1細胞析命。
Fig 5B： qPCR分析表明主卫，在WT細胞中由LPS上調(diào)的TNF信號通路的82%的基因，在ACOD1 -/-細胞中未能增加鹃愤，表明LPS誘導(dǎo)的ACOD1上調(diào)對維持TNF信號通路很重要队秩。
Fig 5C, D： 因為TNF本身也能誘導(dǎo)巨噬細胞中ACOD1的上調(diào)2，作者研究了TNF對LPS誘導(dǎo)的ACOD1豐度在CDK2 KD和JUNKD THP1細胞中的影響昼浦。LPS誘導(dǎo)的TNF mRNA和TNF釋放在CDK2 KD和JUNKD細胞中被削弱。
Fig 5E：然而筒主，外源性TNF在WT細胞中增強了LPS誘導(dǎo)的ACOD1 mRNA表達关噪，但在CDK2 KD和JUN KD細胞中沒有增強。CDK2和JUN的缺失也限制了干擾素-γ誘導(dǎo)的ACOD1 mRNA的上調(diào)乌妙，無論是否有LPS處理使兔，在THP1細胞中都是如此。3′藤韵，3′-環(huán)鳥苷5′-單磷酸-腺苷3′虐沥，5′-單磷酸（3′3′-cGAMP。刺激IFN基因的激動劑）泽艘，5′ppp-雙鏈RNA（dsRNA）（維甲酸誘導(dǎo)基因I激動劑）欲险，或ODN2006（TLR9激動劑）未能誘導(dǎo)THP1細胞中ACOD1的表達。熱殺李斯特菌（HKLM匹涮；TLR2激動劑）誘導(dǎo)的ACOD1表達在CDK2和JUN KD THP1細胞中被抑制天试。
Fig 5F：在CDK2 KD和JUN KD THP1細胞中，大腸桿菌或肺炎鏈球菌感染引起的ACOD1 mRNA上調(diào)也受到抑制然低。因此喜每，CDK2和JUN在介導(dǎo)ACOD1在各種炎癥刺激下的上調(diào)中發(fā)揮了廣泛的作用务唐。
Fig 5G：接下來，作者研究了ACOD1介導(dǎo)的TNF通路基因的上調(diào)是否取決于衣康酸的產(chǎn)生带兜。首先枫笛，作者確認在CDK2KD、JUN KD或ACOD1 -/- THP1細胞中刚照，LPS誘導(dǎo)的衣康酸生成被阻斷刑巧。其次，作者觀察到涩咖，在LPS處理過的ACOD1-/-THP1細胞中海诲，4-辛酯（4-OI）--一種可滲透到細胞中去的衣康酸鹽，只能挽救C-X-C動因趨化因子配體1（CXCL1）檩互、CXCL2和CXCL3的mRNA表達（圖5B）特幔。然而，在LPS處理的ACOD1 THP1細胞中闸昨，66%測量的TNF信號通路基因（包括TNF）沒有被衣康酸恢復(fù)（圖5蚯斯，B和H）。第三饵较，酶聯(lián)免疫吸附試驗或qPCR分析顯示拍嵌，敲入ACOD1（而不是使用4-OI）可以恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的TNF釋放（圖5I）和TNF mRNA（圖5J）在CDK2 KD , JUNKD , 和ACOD1 -/-細胞中。因此循诉，在ACOD1-/-細胞中横辆，大多數(shù)與TNF信號相關(guān)的基因（包括TNF本身）都以不依賴衣康酸的方式受到抑制。
檸檬酸合成酶（CS）介導(dǎo)的檸檬酸鹽生產(chǎn)被克雷布斯循環(huán)酶烏頭酸酯2（ACO2）轉(zhuǎn)換為順式烏頭酸酯茄猫。然后ACOD1通過順式烏頭酸鹽的脫羧作用產(chǎn)生衣康酸狈蚤。與敲除ACOD1類似，通過shRNAs敲除CS或ACO2（圖5K）可抑制LPS誘導(dǎo)的烏頭酸鹽的產(chǎn)生（圖5L）划纽，但不能抑制TNF的產(chǎn)生（圖5M）脆侮。這些發(fā)現(xiàn)表明，ACOD1介導(dǎo)的TNF產(chǎn)生可能與它在中心碳代謝中的酶功能無關(guān)勇劣。相反靖避，在對編碼已知的ACOD1結(jié)合蛋白[谷氨酸-氧乙酸轉(zhuǎn)氨酶2、鳥苷三磷酸酶IMAP家族成員7（GIMAP7）比默、羧肽酶A6幻捏、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、細胞色素P450家族26亞家族A成員1]的基因進行小RNA干擾篩選后命咐。含有12A的鋅指CCCH型粘咖，含有66的富含亮氨酸的重復(fù)，含有四肽重復(fù)的干擾素誘導(dǎo)蛋白1侈百，芳基硫酸酯酶家族成員I和溶菌酶G2]基于STRING蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫瓮下，作者證明GIMAP7是LPS誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生所必需的（圖5翰铡，M和N）。然而讽坏，GIMAP7對LPS誘導(dǎo)的衣康酸的產(chǎn)生并不重要（圖5L）锭魔。正如所料，LPS增加了GIMAP7和ACOD1在THP1細胞中的結(jié)合和共定位（圖5路呜，O和P）迷捧。已知ACOD1與RAB32相互作用，以促進線粒體到吞噬體的運輸胀葱。與GIMAP7的敲除不同（圖5M）漠秋，RAB32的敲除未能影響LPS誘導(dǎo)的THP1細胞的TNF生產(chǎn)（圖5，Q和R）抵屿。這些發(fā)現(xiàn)表明庆锦，ACOD1可能形成不同的蛋白復(fù)合物，分別調(diào)控衣康酸運輸和TNF產(chǎn)生轧葛。
由于CXCL1搂抒、CXCL2和CXCL3是與一個共同的受體CXCR2結(jié)合的趨化因子，作者確定ACOD1介導(dǎo)的衣康酸生成是否對CXCR2相關(guān)的趨化因子有特殊要求尿扯。RNA測序數(shù)據(jù)顯示求晶，CXCL9（CXCR3的配體）、CXCL10（CXCR3的配體）和CXCL11（CXCR3的配體）是被LPS誘導(dǎo)的前20個上調(diào)基因衷笋，并受CDK2和JUN的調(diào)節(jié)（圖4芳杏，E和F）。敲除ACOD1或用4-OI處理可恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的CXCR2配體（CXCL1辟宗、CXCL2蚜锨、CXCL3和CXCL8）在CDK2 KD、JUNKD或ACOD1 -/- THP1細胞的表達（圖5J）慢蜓。然而，只有敲除ACOD1（不用4-OI處理）才能恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的CXCR3配體（CXCL9郭膛、CXCL10和CXCL11）在CDK2晨抡、JUN KD或ACOD1 -/- THP1細胞中的表達（圖5J）。因此则剃，在CDK2-JUNACOD1軸介導(dǎo)的CXCR2配體生產(chǎn)中耘柱，衣康酸是必需的，而在活化的THP1細胞中棍现，衣康酸對CXCR3配體的生產(chǎn)是不可缺少的调煎。
6. Depletion of CDK2 or ACOD1 in myeloid cells protects mice against lethal polymicrobial sepsis
糞便結(jié)扎和穿孔（CLP）模型是一種公認的敗血癥研究模型。WT己肮、Cdk2 -/-或Acod1 -/-小鼠用27號針頭（誘發(fā)輕度敗血癥）士袄、22號針頭（中度敗血癥）悲关、17號針頭（重度敗血癥）的注射器針頭做CLP處理。與WT小鼠相比娄柳，Cdk2 -/-或Acod1 -/-小鼠在CLP誘導(dǎo)的敗血癥中的存活率增加寓辱，表明CDK2和ACOD1的激活有助于小鼠敗血癥的死亡。分析與敗血癥有關(guān)的細胞因子[TNF和IL-6]赤拒、趨化因子（CXCL9和CXCL10）秫筏、HMGB1和SQSTM1的血漿濃度。在重度敗血癥模型中挎挖，組織功能障礙標志物ALT和BUN和血凝標志物（D-二聚體）進一步證實了CDK2和ACOD1在促進系統(tǒng)性炎癥和組織損傷中的作用这敬。正如預(yù)期的那樣，在Cdk2 -/或Acod1 -/-小鼠中蕉朵，CLP誘導(dǎo)的Acod1 mRNA表達的上調(diào)和PMs中的衣康酸濃度被削弱了崔涂。
雖然ACOD1主要在骨髓細胞（包括單核細胞和巨噬細胞）中表達，但它也可以在非免疫細胞中表達墓造，如肝細胞堪伍，以調(diào)節(jié)炎癥。為了進一步確定骨髓細胞中的CDK2-ACOD1途徑在敗血癥的發(fā)展中起主要作用觅闽，作者使用了Cdk2 Mye-/-和Acod1 Mye-/-小鼠帝雇，它們有條件地耗盡了骨髓細胞中的Cdk2或Acod1。與Cdk2 -/-或Acod1 -/小鼠相似蛉拙，Cdk2 Mye-/-和Acod1 Mye-/-小鼠在CLP誘導(dǎo)的高等級敗血癥后顯示出更高的生存率（圖6A）尸闸，減少了系統(tǒng)性炎癥（圖6，B至G）孕锄，限制了肝腎功能障礙（圖6吮廉，H和I），并降低了凝血二聚體濃度（圖6J）畸肆。這些對敗血癥的保護作用在骨髓細胞中Cdk2和Acod1雙重條件性敲除的小鼠中得到進一步加強（圖6宦芦，A至J）。衣康酸通過抑制異檸檬酸酯酶而具有已知的抗菌活性轴脐。在Acod1 Mye-/-小鼠中调卑，CLP后24小時，血液中的菌落形成單位（CFU）數(shù)量增加（圖6K）大咱。然而恬涧，這一趨勢在48小時后被逆轉(zhuǎn)（圖6K），這表明ACOD1介導(dǎo)的衣康酸生產(chǎn)可能只有利于早期階段的細菌清除碴巾。
Cdk2 Mye-/-和Acod1 Mye-/-小鼠也表現(xiàn)出對大腸桿菌感染的存活率增加（圖6L）溯捆。相反，肝細胞中Cdk2或Acod1的條件性敲除（Cdk2 Hep-/-和Acod1 Hep-/-小鼠）對CLP引起的敗血癥死亡沒有影響厦瓢，無論是否有抗生素（亞胺培南和西司他短嶙帷）處理（圖6啤月，M和N）。
7. Dinaciclib protects mice from polymicrobial sepsis
與CDK2或ACOD1缺失的小鼠類似碳锈，與對照組相比顽冶，CLP后2小時開始給予dinaciclib可抑制死亡率，這與循環(huán)炎癥細胞因子售碳、趨化因子强重、DAMPs、組織功能障礙酶和D-二聚體的產(chǎn)生減少有關(guān)贸人。Dinaciclib對抑制Acod1 mRNA表達和CLP誘導(dǎo)的衣康酸生成的效果在PMs中得到證實间景。在臨床相關(guān)的敗血癥模型中，Dinaciclib阻斷ACOD1的上調(diào)也能防止在CLP后2艺智、24倘要、48和72小時內(nèi)給予抗生素（亞胺培南和西司他丁）的敗血癥死亡十拣。此外封拧，當小鼠腹腔感染大腸桿菌或肺炎雙球菌（分別是人類因革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌感染而敗血癥死亡的主要原因）時，迪那克里布的給藥可防止敗血癥死亡夭问。最后泽西，在CLP后的24、48和72小時內(nèi)對小鼠反復(fù)腹腔注射dinaciclib缰趋，以劑量依賴的方式提高了動物的生存率捧杉。
作者根據(jù)Sepsis-3指南調(diào)查了CDK2-ACOD1途徑是否在細菌性敗血癥患者的外周血單核細胞（PBMCs）中發(fā)生改變。40名細菌性敗血癥患者隊列的患者人口學(xué)和臨床特征在作者以前的研究中顯示秘血。非幸存者隊列的順序器官衰竭評估（SOFA）和彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）得分高于幸存者隊列味抖。與幸存者或非DIC組相比，非幸存者組或DIC組的PBMC樣本表達的CDK2和ACOD1 mRNA更高（圖7灰粮，A和B）仔涩。SOFA和DIC評分與CDK2（圖7，C和D）或ACOD1（圖7粘舟，E和F）的mRNA表達相關(guān)熔脂。CDK2和ACOD1的mRNA表達與循環(huán)免疫介質(zhì)的濃度（TNF、IL-6和HMGB1）之間也有正相關(guān)（圖7G）蓖乘。
參考文獻：
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