剛剛發(fā)在Journal of Hepatology (IF: 25.083) 的文章孝赫，思路很清晰驗(yàn)證工作也做的非常好，是很值得學(xué)習(xí)的一篇文章挠将。
1. Single-cell RNA-seq defines hepatic cellular composition and alterations during endotoxemia
Fig 1A：為了探究內(nèi)毒素血癥中肝臟的細(xì)胞構(gòu)成和異質(zhì)性笛匙，作者對(duì)‘二次打擊’內(nèi)毒素血癥小鼠的肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序侨把。在給予lps后，取了0h妹孙，3h和12h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肝臟做了bulk RNAseq座硕，單細(xì)胞測(cè)序和流式。
這個(gè)模型是給了
Ploy(I:C)(一次打擊)涕蜂，7h后給了lps(二次打擊)。
聚肌胞聚肌胞（PolyI:C）是一種人工合成的雙鏈核糖核酸映琳，是一種干擾素誘導(dǎo)劑机隙，有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能，是TLR3的激動(dòng)劑萨西。
Fig 1BC：三個(gè)時(shí)間點(diǎn)一共得到了56828個(gè)細(xì)胞有鹿，分為9個(gè)細(xì)胞群。
Fig 1D-F：分別展示了各群的比例變化和marker基因谎脯〈邪希可以看到給予LPS后，髓系的中性粒細(xì)胞源梭、KC和巨噬細(xì)胞出現(xiàn)了明顯增加娱俺。（??變化最早也最多的還是中性粒，這么早就在肝臟中出現(xiàn)了哦～）
Fig 1G-H：是bulk RNAseq的數(shù)據(jù)废麻，用CIBERSORT 反卷積的算法計(jì)算了細(xì)胞比例荠卷，相當(dāng)于和單細(xì)胞的結(jié)果做了一個(gè)驗(yàn)證。
Fig 1I-J：流式驗(yàn)證細(xì)胞比例變化
為了test the generality of this finding in other models of acute infection烛愧，作者在Supplement還中用流式看了盲腸結(jié)扎的sepsis小鼠模型的肝臟細(xì)胞比例和數(shù)據(jù)庫下載了sepsis病人肝臟RNAseq油宜，反卷積看了細(xì)胞比例掂碱，結(jié)論基本和前面單細(xì)胞的結(jié)論一致。
單細(xì)胞數(shù)據(jù)得到的細(xì)胞比例+bulkRNAseq反卷積算法驗(yàn)證+流式驗(yàn)證
2. Endotoxemia induces macrophage recruitment and neutrophil accumulation in the liver
先前的文獻(xiàn)報(bào)道巨噬細(xì)胞群orchestrate內(nèi)毒素血癥/sepsis的進(jìn)展慎冤，所以這一部分作者對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的分析疼燥。
Fig 2A：作者對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了亞群細(xì)分，得到了3個(gè)亞群：RMs (recruited macrophage), bone marrow (BM)-derived KCs 和 yolk sac (YS)-derived KCs蚁堤。
Fig 2B：細(xì)胞比例變化提示正常肝臟中94.34%都是BM和YS起源的KCs醉者。RM則在病程中時(shí)間依賴性的增加。
Fig 2C：三類巨噬的Marker基因：
RMs：Cx3cr1, Fabp5, Ms4a7和Clec4b1
BM-derived KCs：Vsig4, Folr2和Clec4f
YS-derived KCs：Hmox1, Timd4, Ank2和Cd163
Fig 2D：WGCNA鑒定出5個(gè)基因共表達(dá)模塊违寿，模塊123主要與RM相關(guān)湃交，模塊4主要與YS-derived KCs相關(guān)，模塊5主要與BM-derived KCs相關(guān)藤巢。
Fig 2E：五個(gè)模塊的GO富集結(jié)果提示兩類derived KCs在應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染中起到重要作用搞莺。YS-derived KCs特異性的富集到response to IFN-b通路。BM-derived KCs則展示出bacterial pathogen uptake and clearance capability掂咒。時(shí)間依賴性增加的RM細(xì)胞則在分泌細(xì)胞因子才沧、趨化因子、招募淋巴細(xì)胞和循環(huán)髓系細(xì)胞中起到重要作用绍刮。
Fig 2F：因?yàn)镽M細(xì)胞特異性表達(dá)Cx3cr1温圆，所以作者構(gòu)建了CX3CR1gfp/gfp reporter鼠，一樣構(gòu)建了二次打擊模型
Fig 2G-I：報(bào)告鼠的結(jié)果也提示RM在造模后時(shí)間依賴性增加孩革，而且主要分布在門靜脈周圍岁歉。I圖是中央靜脈和門靜脈的CX3CR1+細(xì)胞之比。
Fig 2J-N：Surprisingly膝蜈，作者發(fā)現(xiàn)在內(nèi)毒素血癥早期锅移，RMs是合成一系列PD-L1誘導(dǎo)因子比如IL-17 (Il17),IL-27 (Ebi3)和IL-6 (Il6)主要細(xì)胞群。
因?yàn)镕ig1的結(jié)果中饱搏，中性粒細(xì)胞是變化最大的細(xì)胞群非剃，F(xiàn)ig. S8對(duì)中性粒細(xì)胞也進(jìn)行了一下簡單分群和功能富集。一共分了三群：Neutrophil, Early NETs associated neutrophil和Late NETs associated neutrophil推沸。都是描述性的結(jié)論备绽，而且和文章主線不相關(guān)，所以放在supplement鬓催。
3. Endotoxemia alters T lymphocyte transcriptional profiles and suppresses T cell functions
對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的分析
Fig 3A-D：T細(xì)胞進(jìn)一步分為6個(gè)群+1個(gè)NK群肺素，展示了比例變化和marker基因。LPS3h后宇驾，CD3+細(xì)胞, CD4+CD8+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞早期出現(xiàn)數(shù)量增加压怠，12h又出現(xiàn)下降。NK細(xì)胞則持續(xù)出現(xiàn)增加飞苇。
Fig 3E：流式驗(yàn)證前面的比例變化結(jié)果
Fig 3F：計(jì)算了7類細(xì)胞的Suppression, Effect, Antigen presentation, Apoptosis, Proliferation評(píng)分（沒有標(biāo)p值呢）菌瘫∥贤纾可以看到各類T細(xì)胞增殖、凋亡雨让、抗原呈遞都呈時(shí)間依賴性的增加雇盖。
既往研究顯示，T細(xì)胞的失代償和抑制是嚴(yán)重感染時(shí)的hallmark栖忠。CD4+T細(xì)胞和Trm細(xì)胞的immunosuppressive genes在3h時(shí)顯著上調(diào)崔挖，在12h則出現(xiàn)下調(diào)。因此作者推斷 the inhibition of CD4+ T細(xì)胞和Trm細(xì)胞的inhibition是被immunosuppressive genes介導(dǎo)的庵寞。
??免疫抑制相關(guān)通路可以分為3類：細(xì)胞表面抑制性受體 (比如Pdcd1 (PD-1))狸相，可溶性抑制性分子 (比如Il10)和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞 (比如Treg和其他細(xì)胞)1
Fig 3G：作者查看了上述三類分子在CD4+T細(xì)胞和Trm細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的這些抑制性分子在LPS后早期顯著上調(diào)捐川，后期又出現(xiàn)下降脓鹃。
Fig 3H：體外通過anti-CD3, anti-CD28和IL-2 co-stimulated T cell proliferation實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)給了LPS的小鼠古沥，CD4+ T細(xì)胞增殖能力顯著下降瘸右。
Fig 3I：給了LPS的小鼠和con相比，CD4+ T細(xì)胞明顯高表達(dá)抑制性受體比如PD-1岩齿，同時(shí)出現(xiàn)了功能受損太颤，表現(xiàn)為效應(yīng)分子IL2, IL4和TNFa表達(dá)的下調(diào)。
在被檢測(cè)到的抑制性受體和他們的配體中盹沈，PD-1/PD-L1是被研究的最透徹的龄章，and can be targeted by FDA-approved therapeutic reagents.
Fig 3J-K：作者觀察到PD-L1(CD274)在lps 3h也顯著增加，而且主要是在肝細(xì)胞表達(dá)乞封。這個(gè)結(jié)果和lps 3h時(shí)PD-1在T細(xì)胞的表達(dá)和T細(xì)胞的抑制相一致瓦堵。
4. Innate and adaptive B cell immunity is activated in endotoxemia and accompanied by spatial adaptation
B細(xì)胞的分析放在Supplementary Fig 5，跟主線不相關(guān)歌亲。
5. Hepatocytes play a key immunoregulatory role in endotoxemia
隨后作者對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行了分析
Fig 4A-D：肝細(xì)胞分為了3類：periportal hepatocytes (PPHs)，sinusoidal hepatocytes (SHs)和pericentral hepatocytes (PCHs)澜驮，展示了一下marker基因和比例變化陷揪。正常情況下，PPHs和PCHs占了總肝細(xì)胞的75%杂穷，SH則在病程中逐漸增多悍缠，在lps12h占到92%。
Fig 4H：富集分析的結(jié)果顯示耐量，PPHs有很強(qiáng)的氨基酸和脂肪酸代謝能力飞蚓，糖代謝則在PCHs更活躍（和既往報(bào)道一致）。
由于PPHs和PCHs并未出現(xiàn)凋亡增加(Fig. S12A-D, F-G)廊蜒，作者推測(cè)：LPS后PPHs和PCHs逐漸失去了它們的特征基因趴拧，丟失了功能溅漾，也不再按帶狀分布（gradually lose feature genes that identify their functions and zonation profiles during endotoxemia）
Fig 4F I：為了驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)，作者對(duì)不顯著表達(dá)periportal和pericentral基因的肝細(xì)胞進(jìn)行了PCA降維（直接做的SH細(xì)胞還是重新按marker基因?qū)?xì)胞分了類著榴？）添履，結(jié)果提示肝細(xì)胞分為2類，一類功能主要與代謝相關(guān)脑又，另一類則出現(xiàn)了明顯促炎活性暮胧。
Fig 4G H：各個(gè)亞群的top50 DEGs也可以將PIHs從PPHs, PCHs和SHs區(qū)分開來。
Fig 4J K：為了進(jìn)一步證明PIHs的來源问麸，作者分別做了PPHs, PCHs和SHs和PIHs的pairwise comparisons往衷，也就是計(jì)算了上調(diào)和下調(diào)的差異基因，發(fā)現(xiàn)PPHs和PIHs的差異基因是最少的严卖。
Fig 4L-M：隨后作者做了RNA velocity和Slingshot analysis席舍。RNA velocity定義出5條分化path，提示PIHs可以由PPHs和PCHs分化而來妄田，主要是由PPHs分化而來俺亮，而很少由SHs分化而來。Slingshot分析也提示了類似的結(jié)論疟呐。
為了進(jìn)一步探究內(nèi)毒素血癥中肝細(xì)胞介導(dǎo)的cellular communication脚曾，作者用CellChat做了細(xì)胞互作分析。
Fig 4N：互作結(jié)果提示lps后3h启具，肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的互作評(píng)分最高（沒有區(qū)分亞群）本讥。
Fig 4O：3類肝細(xì)胞和3類巨噬細(xì)胞互作的結(jié)果提示，PIHs和RMs的互作中鲁冯，CCL趨化因子通路作用最強(qiáng)拷沸。而且CCL家族中，CCL2-LLR2的互作評(píng)分最高薯演，尤其是在PIHs和RMs的互作中撞芍。
Fig 4PQ：差異分析的結(jié)果也顯示Ccl2在PIHs中顯著上調(diào)而Ccr2在RMs中顯著上調(diào)。
這些結(jié)果提示：在內(nèi)毒素血癥早期跨扮，肝細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為PIHs序无，并且通過CCL2-CCR2互作趨化巨噬細(xì)胞。
Fig 4R：值得注意的是衡创，lps后3h肝細(xì)胞表達(dá)Cd274顯著上調(diào)帝嗡。
Fig 4S：而lps后3h在三種肝細(xì)胞中，PIHs的Cd274表達(dá)最高璃氢，其次是PPHs哟玷。肝細(xì)胞中Cd274 (encoded PD-L1) 的表達(dá)pattern與T細(xì)胞中Cd279 (encoded PD-1)的表達(dá)模式一致。這可能提示了內(nèi)毒素血癥中T cell suppression的新機(jī)制一也。
6. Validation of hepatocyte recruitment of macrophages via a CCL2-mediated pathway
為了驗(yàn)證Fig5的結(jié)論巢寡，作者做了體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了肝細(xì)胞通過CCL2-CCR2趨化巨噬細(xì)胞喉脖。
Fig 5A-B：qPCR結(jié)果提示不管是肝臟組織還是原代肝細(xì)胞，給了lps之后Ccl2都有一個(gè)時(shí)間依賴性的顯著增加讼渊，和前面的結(jié)論一致动看。
Fig 5C-E：使用AAV-8-shCCL2，作者成功的在肝臟組織和肝細(xì)胞中抑制了LPS誘導(dǎo)的Ccl2表達(dá)爪幻。Ccl2的表達(dá)下降程度超過50%菱皆。
Fig 5F：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示AAV-8-shCCL2處理肝細(xì)胞后，hepatocyte-induced BMDMs migration顯著下降挨稿。
Fig 5G：抑制了肝細(xì)胞Ccl2的小鼠仇轻，在lps誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥后，存活率上升奶甘。
Fig 5H：Elisa結(jié)果也顯示和AAV-8-NC-treated小鼠相比篷店，給予AAV-8-shCCL2的小鼠外周血促炎因子(MCP1 (CCL2), IL1和TNFα)水平顯著下降。
Fig 5I：肝細(xì)胞中Ccl2的抑制也減輕了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷臭家，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶 (ALT和AST) 的下降疲陕。
Fig 5J-L：流式，HE和Tunel染色同樣證實(shí)了CCL2 inhibition減輕了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡钉赁。
In summary, this in vitro and in vivo evidence showed that hepatocytes recruited RMs to the liver via CCL2-mediated pathways during endotoxemia.
7. Upregulation of PD-L1 in hepatocytes induces T cell suppression during endotoxemia
前面的結(jié)果提示蹄殃，內(nèi)毒素血癥時(shí)PIHs中的Cd274出現(xiàn)上調(diào) (Fig. 4R-S)。作者進(jìn)一步針對(duì)這個(gè)結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證你踩。
Fig 6A：poly(I:C)和LPS處理后的小鼠分離出的肝臟原代細(xì)胞在BMDM缺乏的時(shí)候诅岩，Cd274的表達(dá)并沒有明顯上調(diào)。（BMDM換成THP-1/肝臟原代細(xì)胞換成LO2肝細(xì)胞也是一樣的結(jié)論）
Fig 6B：在體內(nèi)带膜，qPCR結(jié)果提示AAV-8-shCCL2介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞招募減少顯著抑制了肝組織和肝細(xì)胞中Cd274的表達(dá)吩谦。(流式結(jié)果提示Cd274編碼的PD-L1也降低)
前面的結(jié)果提示內(nèi)毒素血癥中T細(xì)胞出現(xiàn)明顯免疫抑制，表現(xiàn)為一系列免疫抑制基因比如Pdcd1, Lag3, Sh2d1a, Cd160和Ctla4的上調(diào)(Fig. 3G)膝藕。
為了驗(yàn)證肝細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞抑制是否是通過PD-1/PD-L1軸式廷，作者在LPS-challenged mice中使用AAV-8-shPD-L1抑制了PD-L1的表達(dá)。
Fig 6C：作者使用qPCR(和流式)檢測(cè)了內(nèi)毒素血癥中Cd274的表達(dá)芭挽。在給予LPS后滑废，肝細(xì)胞表達(dá)Cd274顯著上調(diào)，給予AAV- 8-shPD-L1后表達(dá)則受到抑制览绿。
Fig 6D：流式結(jié)果提示內(nèi)毒素血癥 (和CLP誘導(dǎo)的sepsis)中，肝細(xì)胞PD-L1的抑制顯著增加了肝臟中CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例穗慕。
Fig 6E：AAV-8-shPD-L1抑制肝臟Cd274的表達(dá)后饿敲，小鼠死亡率也下降。
這些結(jié)果提示內(nèi)毒素血癥中逛绵，肝臟中肝細(xì)胞PD- L1上調(diào)可以誘導(dǎo)T細(xì)胞suppression怀各。
Fig 6F：為了在體外驗(yàn)證RMs通過reprogrammed hepatocytes介導(dǎo)T-cell suppression倔韭，作者使用了一套co-culture system。在這個(gè)系統(tǒng)中瓢对，CD4+T細(xì)胞被暴露在有/沒有BMDM-derived condition medium和肝細(xì)胞contact的環(huán)境中寿酌。前面Fig. 2K的結(jié)果提示，內(nèi)毒素血癥中RMs表達(dá)Il27顯著升高硕蛹，作者因此也使用了IL27 p28 (又稱IL30)的中和抗體 (Nab)醇疼，看是否可以減輕肝細(xì)胞和BMDMs引起的T細(xì)胞抑制。
Fig 6G I：CCK8實(shí)驗(yàn)顯示在與LPS處理后的BMDMs的上清和肝細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)法焰，CD4+ T細(xì)胞出現(xiàn)明顯的活性抑制(G)秧荆。流式的結(jié)果也顯示胞內(nèi)增殖marker Ki67出現(xiàn)顯著下調(diào)(I)。
Fig 6H J：而這種抑制效應(yīng)可以被IL27 p28/IL30的中和抗體所阻斷埃仪。
8. Zonation patterns of liver endothelial cell injury in endotoxemia
The graded lobule microenvironment gives rise to spatial division of labor among LSECs (肝竇內(nèi)皮細(xì)胞)乙濒。
Fig 7A：使用此前報(bào)道的一個(gè)LEC(肝臟內(nèi)皮細(xì)胞) hallmark gene panel，作者將LSECs聚為了3類：periportal ECs/PECs卵蛉，pericentral ECs/CECs和sinusoidal ECs/SECs颁股。
Fig 7B-E：細(xì)胞比例變化和marker基因展示。內(nèi)毒素血癥中傻丝，LSECs整體是減少的甘有，而且PECs和CECs出現(xiàn)時(shí)間依賴性的減少。
Fig 7FG, HI：流式和免疫熒光驗(yàn)證了LSECs的減少
Fig 7J-L：GO和GSVA探究了三類EC的功能桑滩。結(jié)果提示大血管周圍的LSECs存在逐漸增強(qiáng)的炎癥和凋亡反應(yīng)和抑制的代謝反應(yīng)梧疲。此外，和肝細(xì)胞類似运准，和中央靜脈區(qū)相比幌氮，門靜脈區(qū)周圍的LSECs展示出更強(qiáng)的炎癥和凋亡反應(yīng)。
內(nèi)皮細(xì)胞的這種表現(xiàn)有利于fenestrations和循環(huán)免疫細(xì)胞進(jìn)入組織胁澳。
In summary, our study provides the first evidence from single-cell transcriptomic analyses that phenotypic transition of hepatocytes in response to endotoxemia plays central roles in the recruitment of circulating monocytes to generate an RM population and in the inhibition of T lymphocytes. This study advances the understanding of the pathophysiology of endotoxemia from the perspective of liver, and these findings provide pivotal foundations for the development of an effective therapeutic approach for acute infection.
參考文獻(xiàn)：
- Wherry EJ. T cell exhaustion. Nat Immunol 2011;12:492-499.
