DNA甲基化的前世今生
??DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾袁余，在生物個體的生長發(fā)育與繁殖過程中，維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的颖榜。在真核生物基因組中，編碼基因僅僅占一小部分掩完，例如在人類基因組中編碼基因還不到2％，那么在大量非編碼DNA存在的情況下，實現(xiàn)精確控制基因的表達夺刑，降低周圍的轉(zhuǎn)錄噪音對生物體至關(guān)重要，而DNA甲基化則為非編碼DNA的長期沉默提供了一種有效的抑制機制存淫。近年來的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生桅咆、發(fā)展坞笙、細胞癌變有著密切的聯(lián)系岩饼。DNA甲基化在腫瘤中的作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：一是甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶薛夜，造成基因突變；二是抑癌基因和DNA修復(fù)基因由于超甲基化而沉默寞冯；三是癌基因甲基化水平降低而活化晚伙；四是基因組總體甲基化水平降低使轉(zhuǎn)座子吮龄、重復(fù)序列活化導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降咆疗。這些因素是導(dǎo)致腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移胰默、惡化最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因场斑。DNA總體甲基化水平和特定基因甲基化程度改變可作為腫瘤診斷指標牵署。正是由于DNA甲基化在維持正常細胞的功能、基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定青责、遺傳印記、胚胎發(fā)育脖隶、及腫瘤和疾病的發(fā)生暇检、發(fā)展等方面發(fā)揮重要作的作用，所以在科研中受到越來越多的重視块仆。
??在基因組所有甲基化的堿基中占比最多的是5-甲基胞嘧啶（5mC），在哺乳動物中占比為98%左右庄敛，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族（Dnmts）催化甲基從S-腺嘌呤甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移至胞嘧啶殘基的第五個碳而形成科汗。與此同時藻烤，5mC可以在氧化蛋白TET的作用下轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）头滔，進一步在TET的氧化下轉(zhuǎn)化為5-甲酰基胞嘧啶（5-fC）依许，最終在TET的氧化下轉(zhuǎn)化為5-羧基胞嘧啶（5-caC）缀蹄。在基因組中含有很多CpG結(jié)構(gòu)峭跳，60%～ 90% 的CpG 都被甲基化缺前，未甲基化的CpG 成簇地組成CpG 島，位于結(jié)構(gòu)基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點拯刁。關(guān)于甲基化的維持只要受DNMT1和UHRF1兩個蛋白控制逝段，用于在DNA復(fù)制時讓新生成的鏈維持原有的甲基化模式垛玻。目前，在植物中帚桩，主要存在兩種去甲基化方式，一是被動去甲基化莫瞬，即DNA復(fù)制時新生成的鏈丟失甲基化郭蕉；二是主動去甲基化疼邀，在DNA糖基化酶（DME）和ROS1的作用下召锈，通過堿基錯配修復(fù)途徑（BER）去除甲基化。在哺乳動物中规求，被動去甲基化與植物相同卵惦，而DNA修復(fù)酶-胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）在DNA主動去甲基化上扮演了重要角色，關(guān)于主動去甲基化的過程還需進一步的研究沮尿。
??目前较解，關(guān)于DNA甲基化的測序方法分為兩大類，一類是以蛋白質(zhì)特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的富集方法印衔，該類方法類似ChIP-seq，可以將甲基化區(qū)域富集下來瞎暑，然后測序分析甲基化情況与帆，該類方法有一個很明顯的缺點就是不是單堿基分辨率水平了赌，因為富集到只是區(qū)間沒法確定具體是哪一個位置發(fā)生了甲基化玄糟。如果只是想知道某些區(qū)域是否發(fā)生甲基化，得到一個定性的結(jié)論逢并，那么用該類方法就很方便之剧；二是以C堿基轉(zhuǎn)化為T堿基為基礎(chǔ)的測序方法砍聊，隨著技術(shù)的發(fā)展，該類方法又可以分為兩種技術(shù)雇庙，一種是將未甲基化的C堿基轉(zhuǎn)化為T灶伊，另一種是將甲基化的C堿基轉(zhuǎn)化為T。目前市場上還是以未甲基化的C堿基做轉(zhuǎn)化的方法為主流胚委，這其中以重亞硫酸鹽處理的方法被大家認為是甲基化測序的“金標準”米辐。該類方法有一個很明顯的特點就是甲基化的分辨率可以達到單堿基的水平，再結(jié)合NGS的高通量特點赊窥，讓科研人員很容易就能得到全基因組上的甲基化圖譜。雖然優(yōu)勢很明顯锨能，但其也存在一些缺陷芍耘，體現(xiàn)在以下幾個方面：1、對DNA的破壞斋竞，亞硫酸鹽處理的反應(yīng)條件比較劇烈，高溫高酸的條件下會使很多DNA序列發(fā)生降解浸剩，使得DNA序列的多樣性下降。為了達到很好的建庫效果就需要高質(zhì)量高有濃度的DNA樣本乒省；2畦木、亞硫酸鹽處理方法依賴未堿基化的C堿基轉(zhuǎn)化為T堿基，而基因組范圍內(nèi)95%左右都是為甲基化的C，轉(zhuǎn)化后導(dǎo)致文庫堿基嚴重失衡蛆封，對測序結(jié)果造成影響，故這類文庫上機測序時需要參入一定比例的Phix文庫盏筐。同時砸讳，如果C->T的轉(zhuǎn)化效率低，由于其基數(shù)很大也會造成很高的假陽性簿寂。隨著技術(shù)的發(fā)展，一些將甲基化的C轉(zhuǎn)堿基化為T的方法嶄露頭角腳常遂，這些技術(shù)的天然優(yōu)勢就是甲基化的C堿基本身占比就很少，而且反應(yīng)條件比較溫和平绩，基本不會引起DNA降解保持很好的序列多樣性和復(fù)雜度漠另，通過測定C->T轉(zhuǎn)化有一種“所見即所得的感覺”，可以降低假陽性的產(chǎn)生笆搓。Bisulfite-free技術(shù)也在發(fā)展。雖然這些技術(shù)還不很成熟砚作，但其優(yōu)勢卻很明顯嘹锁，未來技術(shù)成有所突破一定會讓其成為主流。
寫在最后
??通過對DNA甲基化方面的知識做一個梳理米同，自己從中有所收獲摔竿。個人覺得了解一個方面的知識，最好的方法可能是找一些好的綜述來閱讀继低。關(guān)于DNA甲基化，下面給出了一篇不錯的綜述，雖然文章發(fā)表于2014年婿脸，距離現(xiàn)在已經(jīng)過去有些年限柄驻，但對于不了解的人來說里面的內(nèi)容還是屬于比較經(jīng)典的，值得一看鸿脓。今天就分享到這了~~~
Wu H , Zhang Y . Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.[J]. Cell, 2014, 156(1-2):45-68.
