卵巢是女性重要的生殖器官，也是最早表現(xiàn)出衰老跡象的器官之一灾测，通常在35歲左右開(kāi)始爆价，卵巢衰老（ovarian aging，OA）是導(dǎo)致與年齡相關(guān)的不孕問(wèn)題的重要因素媳搪，包括卵泡數(shù)量和卵子質(zhì)量的逐漸下降铭段，對(duì)女性生育能力構(gòu)成威脅。m6A是一種普遍存在的RNA表觀遺傳修飾秦爆，已在多種生理和病理背景下顯示出重要作用序愚。m6A與組蛋白修飾之間的調(diào)控機(jī)制以及m6A在卵巢發(fā)育和衰老中的作用尚不清楚。

2024年10月15日等限，南京醫(yī)科大學(xué)黃伯賢團(tuán)隊(duì)以“The N6-methyladenosine landscape of ovarian development and aging highlights the regulation by RNA stability and chromatin state”為題在老年病學(xué)高分SCI《Aging Cell》上發(fā)表科研成果爸吮，研究通過(guò)m6A MeRIP-seq等實(shí)驗(yàn)揭示卵巢發(fā)育和衰老過(guò)程中N6-甲基腺苷（m6A）甲基化譜，闡明了m6A修飾在OA進(jìn)展中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制望门。

標(biāo)題：The N6-methyladenosine landscape of ovarian development and aging highlights the regulation by RNA stability and chromatin state（卵巢發(fā)育和衰老的m6A 甲基化譜揭示RNA穩(wěn)定性和染色質(zhì)狀態(tài)調(diào)控）

期刊：Aging Cell

影響因子：8

技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq等

研究首先通過(guò)m6A甲基化測(cè)序技術(shù)MeRIP-seq揭示了m6A修飾在卵巢衰老（OA）過(guò)程中高表達(dá)形娇，這與m6A去甲基化酶FTO減少和m6A甲基化酶METTL16過(guò)表達(dá)相關(guān)。接下來(lái)筹误，作者利用FTO基因敲除（KO）小鼠模型和KGN細(xì)胞系的研究桐早，同樣揭示了FTO缺失和METTL16過(guò)表達(dá)顯著增加了m6A修飾水平。這些變化會(huì)導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1下調(diào)，進(jìn)而下調(diào)H3K9me3表達(dá)哄酝。SUV39H1和H3K9me3的下調(diào)主要激活了LTR7和LTR12友存，隨后激活ERV1，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少炫七，而OA中的細(xì)胞凋亡爬立、細(xì)胞衰老標(biāo)志物和自噬標(biāo)志物水平顯著增加⊥蚰模總之侠驯，本研究為m6A在調(diào)控DNA表觀遺傳學(xué)中的角色提供了有趣的見(jiàn)解，包括H3K9me3和TEs奕巍，以及自噬鸽扁，從而加速OA骗随。

研究方法：

研究使用了多種技術(shù)，包括m6A RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）、基因敲除（KO）芝雪、過(guò)表達(dá)（OE）和敲低（KD）等方法付材。

采用m6A RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）分析10個(gè)人卵巢樣本的m6A修飾水平泛范。

使用FTO-KO小鼠模型和KGN細(xì)胞系來(lái)研究FTO缺失和METTL16過(guò)表達(dá)對(duì)m6A水平的影響需忿。

通過(guò)western blot、免疫熒光染色氓润、電子顯微鏡分析等技術(shù)來(lái)評(píng)估卵巢功能和衰老標(biāo)志物赂乐。

結(jié)果圖形

（1）卵泡發(fā)育和OA中m6A轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的整體差異分析

研究者對(duì)10個(gè)人類卵巢樣本進(jìn)行了m6A-MeRIP-seq分析，這些樣本被分為四個(gè)階段：胎兒期（Fet）咖气、年輕期（Yng）挨措、老年期（Old）和絕經(jīng)期（Mop）。

圖1：在人卵巢不同階段的轉(zhuǎn)錄組m6A的整體差異分析崩溪。 (a) ?人卵巢動(dòng)態(tài)微觀結(jié)構(gòu)和m6A MeRIP-seq測(cè)序示意圖浅役。 (b) ?人卵巢匹配樣本間m6A水平的皮爾遜相關(guān)熱圖。 (c) ?在人卵巢不同階段富集的m6A峰值和基因數(shù)量伶唯。 (d) ?在卵巢發(fā)育（OD觉既，從胎兒期到年輕期）、卵巢功能下降（OFD抵怎，從年輕期到老年期）和卵巢衰老（OA奋救，從老年期到絕經(jīng)期）期間獲得和丟失m6A的基因數(shù)量。 (e) ?在OD反惕、OFD和OA期間獲得和丟失的m6A峰值數(shù)量。 (f) ?OD演侯、OFD和OA期間m6A基因表達(dá)水平箱線圖姿染。 (g) ?OD、OFD和OA期間mRNA表達(dá)水平的箱線圖。 (h) ?OD悬赏、OFD和OA期間重疊的m6A和mRNA水平的系數(shù)相關(guān)性分析狡汉。 (i) ?OD、OFD和OA階段差異表達(dá)的m6A基因的維恩圖（p<0.05）闽颇。 (j) ?OD盾戴、OFD和OA階段比較207個(gè)基因的m6A和mRNA水平。 (k) ?模糊C均值聚類鑒定了m6A基因的四種不同的時(shí)間模式兵多。x軸代表四個(gè)階段尖啡，而y軸代表每個(gè)階段的log2轉(zhuǎn)換、標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度比率剩膘。?

（2）在極端卵巢衰老期間衅斩，N6-甲基腺苷（m6A）在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERVs）上的高富集情況

圖2：在四個(gè)不同階段的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的m6A甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析概況。 (a, b) 在胎兒期（Fet）怠褐、年輕期（Yng）畏梆、老年期（Old）和絕經(jīng)期（Mop）中，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的m6A和轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平奈懒。 (c) 人卵巢匹配樣本之間逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的m6A水平的皮爾遜相關(guān)熱圖奠涌。 (d) 在四個(gè)組中，帶有m6A修飾的不同類型逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的百分比磷杏。 (e) 相鄰階段之間帶有和不帶有m6A修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的維恩圖溜畅。 (f) 在卵巢發(fā)育（OD）、卵巢功能下降（OFD）和卵巢衰老（OA）期間茴丰，常見(jiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒與m6A和RNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析达皿。 (g) 在OD、OFD和OA期間逆轉(zhuǎn)錄病毒中m6A和RNA表達(dá)水平的箱線圖贿肩。 (h) 在胎兒期峦椰、年輕期、老年期和絕經(jīng)期中汰规，ERV1汤功、ERVL-MaLR和ERVL的m6A RIP和input信號(hào)的平均概況。

（3）FTO基因敲除介導(dǎo)m6A修飾增加溜哮，進(jìn)而影響自噬通量和卵巢衰老（OA）滔金。

圖3：FTO基因敲除（FTO-KO）影響卵母細(xì)胞（卵泡）發(fā)育潛力。 (a–c) 來(lái)自FTO-KO和野生型（WT）小鼠的GV期和MII期卵母細(xì)胞的數(shù)量茂嗓。 (d) FTO-KO和WT卵母細(xì)胞中γ-H2AX（紅色）和FTO（綠色）的染色圖像餐茵。 (e) FTO-KO和WT卵母細(xì)胞中每個(gè)卵母細(xì)胞的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量（***p<0.001）。 (f) FTO-KO和WT卵母細(xì)胞中染色體（紅色）和紡錘體（綠色）的染色圖像述吸。 (g) FTO-KO和WT卵母細(xì)胞中紡錘體和染色體缺陷的百分比（***p<0.001）忿族。 (h) FTO-KO和WT小鼠的卵巢大小。 (i) FTO-KO和WT小鼠卵巢重量與體重的比例（***p<0.001）。 (j) FTO-KO和WT卵巢的HE染色（比例尺道批，500微米）错英。 (k, l) FTO-KO和WT組中FTO（紅色）、VASA（綠色）和GDF9（綠色）的相對(duì)熒光素酶活性（***p<0.001）隆豹。

（4）FTO基因敲除誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的m6A水平

圖4：FTO基因敲除（FTO-KO）介導(dǎo)細(xì)胞凋亡并影響逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA m6A水平椭岩。 (a) 六月齡FTO-KO和野生型（WT）小鼠卵巢中總RNA樣本的m6A斑點(diǎn)印跡。 (b) ?FTO-KO和WT小鼠之間m6A修飾基因的維恩圖璃赡。 (c) ?FTO-KO組與WT小鼠相比的特異性m6A修飾基因皮爾遜相關(guān)性熱圖判哥。 (d) ?FTO-KO和WT小鼠中4232個(gè)重疊基因在啟動(dòng)子區(qū)域的m6A信號(hào)強(qiáng)度。 (e) ?FTO-KO和WT小鼠中4232個(gè)重疊基因的mRNA表達(dá)水平的箱線圖鉴吹。 (f) 火山圖顯示FTOKO和WT小鼠中差異表達(dá)的m6A基因姨伟。x軸代表log2轉(zhuǎn)換的倍數(shù)變化，而y軸代表log10標(biāo)準(zhǔn)化的p值豆励。 (g) ?312個(gè)差異表達(dá)的m6A修飾基因的GO分析夺荒。 (h, i) ?在Wnt和凋亡信號(hào)通路中m6A和mRNA水平的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。 (j, k) ?FTO-KO和WT小鼠中切割Caspase 9和Bad的蛋白表達(dá)（*p<0.05, ***p<0.001）良蒸。 (l) ?FTO-KO和WT小鼠中ERV1的m6A RIP和input信號(hào)的平均概況技扼。

（5）FTO基因敲除調(diào)控卵巢衰老（OA）中的SUV39H1-H3K9me3-ERV軸

圖5：FTO基因敲低（FTO-KD）在卵巢衰老期間影響了SUV39H1-H3K9me3-ERV軸。 (a, b) FTO-KD和空載體（EV）KGN細(xì)胞系中FTO蛋白的表達(dá)（***p<0.001）嫩痰。 (c, d) FTO-KD和EV組新合成RNA的熒光素酶強(qiáng)度信號(hào)（***p<0.001）剿吻。 (e) FTO-KD和EV組中m6A修飾基因的皮爾遜相關(guān)性熱圖。 (f) FTO-KD和EV組中差異表達(dá)的m6A基因散點(diǎn)圖串纺。 (g) FTO-KD和EV組中差異表達(dá)的m6A修飾基因的GO分析丽旅。 (h, i) ?FTO-KD和EV KGN細(xì)胞系中H3K9me3蛋白的表達(dá)（*p<0.05）。 (j) FTO-KD和EV組中差異TEs上的H3K9me3信號(hào)的平均值纺棺。 (k) FTO-KD和EV組中增加和減少的TEs上的H3K9me3信號(hào)榄笙。 (l) FTO-KD和EV組中增加的ERVK、ERV1和ERVL上的H3K9me3信號(hào)的平均值祷蝌。EV茅撞，empty vector。

（6）METTL16過(guò)表達(dá)在卵巢衰老（OA）中調(diào)控SUV39H1-H3K9me3-ERV軸巨朦。

圖6：METTL16過(guò)表達(dá)在卵巢衰老中調(diào)控SUV39H1-H3K9me3-ERVs軸米丘。 (a, b) M16-OE和EV KGN細(xì)胞系中METTL16蛋白的表達(dá)（***p < 0.001）。 (c, d) M16-OE和EV組新合成RNA的熒光素酶強(qiáng)度信號(hào)（***p < 0.001）糊啡。 (e) M16-OE和EV組中m6A修飾基因的皮爾遜相關(guān)性熱圖拄查。 (f) M16-OE和WT組中差異表達(dá)的m6A基因散點(diǎn)圖。 (g) M16-OE和EV組中差異表達(dá)的m6A修飾基因的GO分析棚蓄。 (h, i) M16-OE和EV KGN細(xì)胞系中H3K9me3蛋白的表達(dá)（**p < 0.01）靶累。 (j) M16-OE和EV組中差異TEs上的H3K9me3信號(hào)的平均值腺毫。 (k) M16-OE和EV組中增加和減少的TEs上的H3K9me3信號(hào)癣疟。 (l) M16-OE和EV組中增加的ERVK挣柬、ERV1和ERVL上的H3K9me3信號(hào)的平均值。

（7）m6A高甲基化誘導(dǎo)ERV1激活睛挚，從而導(dǎo)致卵巢衰老（OA）邪蛔。

圖7：由m6A高甲基化誘導(dǎo)的ERV1激活是卵巢衰老的誘導(dǎo)因子。 (a) FTO-KD和M16-OE組中差異表達(dá)的m6A修飾基因（p<0.05）的維恩圖分析扎狱。 (b) FTO-KD組中前三大m6A motif侧到。 (c) FTO-KD和M16-OE組在不同基因組區(qū)域共有m6A峰值比例。 (d) M16-OE和FTO-KD細(xì)胞系中共有增加的TEs上的H3K9me3信號(hào)平均值淤击。 (e) M16-OE和FTO-KD細(xì)胞系中共有減少的TEs上的H3K9me3信號(hào)平均值匠抗。 (f) FTO-KD組中差異表達(dá)的TEs的散點(diǎn)圖。 (g) FTO-KD組中表達(dá)變化的七個(gè)ERV1亞家族污抬，其FC>2汞贸。 (h,i) sgLTR12和sgLTR7細(xì)胞中增殖標(biāo)記KI67的免疫熒光染色（***p<0.001）。 (j,k) sgLTR12和sgLTR7細(xì)胞中衰老標(biāo)記SA-β-gal的染色結(jié)果（***p<0.001）印机。 (l,m) sgLTR12和sgLTR7細(xì)胞中衰老蛋白p21和p53的表達(dá)（*p<0.05, **p<0.01）矢腻。

研究局限：

FTO作為一種RNA去甲基化酶，可以去除如N6-甲基腺苷（m6A）射赛、N6-2-O-二甲基腺苷（m6Am）和N1-甲基腺苷（m1A）這樣的甲基基團(tuán)多柑。本研究?jī)H集中研究了FTO通過(guò)m6A修飾調(diào)控卵巢衰老（OA）的機(jī)制。未來(lái)的研究可以更深入地探討FTO如何影響m6Am和m1A修飾楣责，以闡明這一生理過(guò)程的多方面特征竣灌。

參考文獻(xiàn)：

HuX, Lu J, Ding C, Li J, Zou Q, Xia W, Qian C, Li H, Huang B. TheN6-methyladenosine landscape of ovarian development and aging highlights theregulation by RNA stability and chromatin state. Aging Cell. 2024 Oct15:e14376. doi: 10.1111/acel.14376. PubMed PMID: 39410722.