10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序—常規(guī)流程

文章中其中用到的文件獲取方式https://pan.baidu.com/s/1HCsHRXNX9Il8u8RIPXSEug?pwd=2626

1.上游分析

1.1 安裝conda碍脏、sratoolkit罪郊、cellranger 關(guān)

#安裝conda，最好去官網(wǎng)下載最新版
cd ~
wget https://repo.anaconda.com/archive/Anaconda3-2021.11-Linux-x86_64.sh
bash Anaconda3-2021.11-Linux-x86_64.sh

#安裝sratoolkit，用于下載sra數(shù)據(jù)，同時(shí)也會(huì)安裝fastq-dump
#去官網(wǎng)下載最新版本，conda安裝的不好用，https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
#conda install -c daler sratoolkit

#安裝cellranger
#官網(wǎng)下載最新版cellranger
https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest
#執(zhí)行以下命令進(jìn)行安裝
tar -xzvf cellranger-6.1.2.tar
#解壓完即可使用，但需要添加到環(huán)境變量

1.2 使用conda進(jìn)行常用軟件安裝注

conda install -y -c bioconda aspera-cli bwa samtools bedtools bowtie2 fasterq-dump hisat2 cutadapt multiqc

1.3 參考基因組下載我

##1.2 mm10
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

md5sum refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
#886eeddde8731ffb58552d0bb81f533d refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

###1.3 hg38
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

md5sum refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
#dfd654de39bff23917471e7fcc7a00cd refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

1.4 文件夾創(chuàng)建的

mkdir 1.sra 2.raw_fastq 3.cellranger

1.5 數(shù)據(jù)下載公

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE112302
#SRA Run Selector里面選擇需要的數(shù)據(jù)下載部念，在該篇文章中是下載6個(gè)tumor數(shù)據(jù)。選擇要下載的數(shù)據(jù)樣本后點(diǎn)擊Accession List獲取相應(yīng)的id號(hào)氨菇。并將其命名為id儡炼，保存在1.sra文件夾中。

cd 1.sra
cat id | while read id;do (prefetch $id &);done

1.6 SRA轉(zhuǎn)fastq 眾

cd 2.fastq
ln -s ../1.sra/SRR* ./
ls SRR* |while read id;do (nohup fasterq-dump -O ./ --split-files -e 6 ./$id --include-technical & );done

#上一步運(yùn)行完會(huì)非常占用空間查蓉，可壓縮節(jié)省空間乌询。
ls SRR*fastq | while read id;do gzip $id;done

1.7 cellranger count流程號(hào)

##修改文件名，改成cellranger可識(shí)別的文件名豌研。
cat ../1.sra/id |while read id ;do (mv ${id}_1*.gz 
${id}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;mv ${id}_2*.gz ${id}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv 
${id}_3*.gz ${id}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

##運(yùn)行cellranger
#指定參考基因組
ref=/home/data/vip10t17/software_install/10x_refernce/refdata-gex-GRCh38-2020-A
ls *.fastq.gz | cut -d "_" -f 1 |uniq |while read id;do cellranger count --id $id --transcriptome $ref --fastqs 2.raw.fastq/ --sample $id --nosecondary --localcores 10 --localmem 30;done

##參數(shù)解讀
--id 指定輸出文件夾的名字
--transcriptome 指定參考基因組的路徑
--sample 指定需要處理的fastq文件的前綴
--expect-cell 指定預(yù)期的細(xì)胞數(shù)目妹田，默認(rèn)參數(shù)是3000個(gè)
--localcores 指定計(jì)算的核心數(shù)
--mempercore 指定內(nèi)存大小 GB
--nosecondary 不需要進(jìn)行降維聚類（因?yàn)楹笃跁?huì)用R可視化）
--chemistry唬党，默認(rèn)是自動(dòng)識(shí)別chemistry，但是有些時(shí)候識(shí)別不出chemistry的時(shí)候鬼佣，需要加入?yún)?shù)特別標(biāo)明

1.8 結(jié)果解讀 2

web_summary.html：必看驶拱，官方說明 summary HTML file ，包括許多QC指標(biāo)晶衷，預(yù)估細(xì)胞數(shù)蓝纲，比對(duì)率等；
metrics_summary.csv：CSV格式數(shù)據(jù)摘要晌纫，可以不看税迷；
possorted_genome_bam.bam：比對(duì)文件，用于可視化比對(duì)的reads和重新創(chuàng)建FASTQ文件缸匪，可以不看翁狐；
possorted_genome_bam.bam.bai：索引文件类溢；
filtered_gene_bc_matrices：是重要的一個(gè)目錄凌蔬，下面又包含了 barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz闯冷、matrix.mtx.gz砂心，是下游Seurat、Scater蛇耀、Monocle等分析的輸入文件辩诞，是經(jīng)過Cell Ranger過濾后構(gòu)建矩陣所需要的所有文件；
filtered_feature_bc_matrix.h5：過濾掉的barcode信息HDF5 format纺涤，可以不看译暂；
raw_feature_bc_matrix：原始barcode信息，未過濾的可以用于構(gòu)建矩陣的文件撩炊，可以不看外永；
raw_feature_bc_matrix.h5：原始barcode信息HDF5 format，可以不看拧咳；
analysis：數(shù)據(jù)分析目錄伯顶，下面又包含聚類clustering（有g(shù)raph-based & k-means）、差異分析diffexp骆膝、主成分線性降維分析pca祭衩、非線性降維tsne，因?yàn)槲覀冏约簳?huì)走Seurat流程阅签，所以不用看掐暮；
molecule_info.h5：可用于整合多樣本，使用cellranger aggr函數(shù)政钟；
cloupe.cloupe：官方可視化工具Loupe Cell Browser 輸入文件劫乱，無代碼分析的情況下使用织中，會(huì)代碼的同學(xué)通常用不到。
將所有結(jié)果中的filtered_gene_bc_matrices文件夾保存在自己電腦output文件夾下衷戈，進(jìn)行下游分析

2. 下游分析

2.1 R包安裝狭吼、加載 6

library(Seurat)
library(ggplot2)
library(clustree)
library(cowplot)
library(dplyr)
library(harmony)
library(SingleR)
library(celldex)
library(EnhancedVolcano)
library(tidyverse)
library(ggrepel)
library(rgl)
library(fgsea)
library(clustree)
library(patchwork)

2.2 數(shù)據(jù)讀取過濾號(hào)

#設(shè)置工作路徑
setwd('E:/project/test/')

dir='E:/project/test/cellranger' 
#設(shè)置樣本名
samples=c("100","400")
samples
#獲取單細(xì)胞數(shù)據(jù)
sceList = lapply(samples,function(pro){ 
  print(pro) 
  sce=CreateSeuratObject( Read10X(file.path(dir,pro)), 
                          project = pro,
                          min.cells = 5,
                          min.features = 200) 
  return(sce)
})
#會(huì)自動(dòng)讀取output文件夾下所有的文件，同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾殖妇，
#一個(gè)基因最少細(xì)胞表達(dá)數(shù)為5刁笙，一個(gè)細(xì)胞最少基因表達(dá)量為300。

#合并數(shù)據(jù)
PBMC.all=merge(x=sceList[[1]],
              y=sceList[[2]],
              add.cell.ids = c("100","400"))

#計(jì)算^MT-線粒體基因所占的比例,人：全大寫谦趣，小鼠：全小寫
PBMC.all[["percent.mt"]] = PercentageFeatureSet(PBMC.all,pattern = "^mt-")
#計(jì)算血紅細(xì)胞相關(guān)基因比例疲吸，人：全大寫，小鼠：首字母大寫 其余小寫
PBMC.all[["percent.hb"]] = PercentageFeatureSet(PBMC.all,pattern = "^Hb[^(p)]")
#分析核糖體基因前鹅。人：全大寫摘悴，小鼠：首字母大寫 其余小寫
PBMC.all[["percent.rp"]] = PercentageFeatureSet(PBMC.all,pattern = "^Rp[sl]")

VlnPlot(PBMC.all, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt",
                               "percent.hb", "percent.rp"), ncol = 3)
#其中nFeature_RNA：一個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到的基因總數(shù)，nCount_RNA：一個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到的分子數(shù)

#根據(jù)數(shù)據(jù)的分布進(jìn)行過濾舰绘，主要過濾極值蹂喻，其中mt部分一般是小于10，但也不絕對(duì)
#肌肉細(xì)胞的線粒體基因占比最高可達(dá)50%捂寿，腫瘤區(qū)域的正常細(xì)胞線粒體含量有時(shí)也在30%以上
#但為了盡可能保留更多的數(shù)據(jù)可以提高這個(gè)數(shù)值口四，HB部分一般是小于3。
PBMC.all = subset(PBMC.all,subset = nFeature_RNA<7500&percent.mt<15&percent.hb<3&percent.rp<50)
#通過質(zhì)控檢測(cè)數(shù)據(jù)過濾的好壞
plot1 = FeatureScatter(PBMC.all,feature1 = "nCount_RNA",
                       feature2 = "percent.mt")+NoLegend()
plot1#會(huì)呈現(xiàn)出三角的形成
plot2 = FeatureScatter(PBMC.all,feature1 = "nCount_RNA",
                       feature2 = "percent.hb")+NoLegend()
plot2#會(huì)呈現(xiàn)成橫線狀
plot3 = FeatureScatter(PBMC.all,feature1 = "nCount_RNA",
                       feature2 = "nFeature_RNA")+NoLegend()
plot3#會(huì)呈現(xiàn)出圓弧狀
#將三張圖合并顯示
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2,plot3))

#計(jì)算基因reads數(shù)貢獻(xiàn)值
C <- PBMC.all@assays$RNA@counts
C <- Matrix::t(Matrix::t(C)/Matrix::colSums(C)) * 100
most_expressed <- order(apply(C, 1, median), decreasing = T)[20:1]

boxplot(t(as.matrix(C[most_expressed, ])), cex = 0.1, las = 1, xlab = "% total count per cell", 
        col = (scales::hue_pal())(20)[20:1], horizontal = TRUE)
#結(jié)果中根據(jù)占比秦陋，刪除占比較大的基因蔓彩，其中MALAT1的高檢測(cè)可能是一個(gè)技術(shù)問題

dim(PBMC.all)
# 過濾MALAT1基因
PBMC.all <- PBMC.all[!grepl("Malat1", rownames(PBMC.all)), ]
# 過濾線粒體基因
PBMC.all <- PBMC.all[!grepl("^mt-", rownames(PBMC.all)), ]
# 過濾核糖體基因
PBMC.all <- PBMC.all[!grepl('^Rp[sl]', rownames(PBMC.all)), ]
# 過濾血紅蛋白基因
PBMC.all <- PBMC.all[!grepl("^Hb[^(p)]", rownames(PBMC.all)), ]
dim(PBMC.all)

#PBMC.all1用于保存原始數(shù)據(jù)，方便后續(xù)調(diào)用
saveRDS(PBMC.all, "E:/project/test/PBMC.all1.rds")

2.3 標(biāo)準(zhǔn)化宇

#標(biāo)準(zhǔn)化 通過總表達(dá)值對(duì)每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)值歸一化
PBMC.all <- NormalizeData(PBMC.all, 
                     normalization.method = "LogNormalize",
                     scale.factor = 1e4)

2.4 尋找高變基因宙

#尋找差異基因
PBMC.all = FindVariableFeatures(PBMC.all)

# 選擇前10個(gè)驳概，并將前10的高變異基因在圖中標(biāo)注出來
top10 <- head(VariableFeatures(PBMC.all), 10)
plot4 = VariableFeaturePlot(object = PBMC.all)+NoLegend()
plot4
plot5 <- LabelPoints(plot = plot4, points = top10, repel = TRUE)
plot5
#合并顯示
CombinePlots(plots = list(plot4, plot5))

2.5 （可選）可通過以下方法修改組織樣本信息

timePoints <-ifelse(PBMC.all@meta.data[["orig.ident"]] == 'SRR7722939', 'PBMC_Pre', 
                    ifelse(PBMC.all@meta.data[["orig.ident"]] == 'SRR7722940', 'PBMC_EarlyD27',
                           ifelse(PBMC.all@meta.data[["orig.ident"]] == 'SRR7722941'|PBMC.all@meta.data[["orig.ident"]] == 'SRR7722942', 'PBMC_RespD376', 'PBMC_ARD614')))

#PBMC <- AddMetaData(object = PBMC.all, metadata = apply(dataPBMC, 2, sum), col.name = 'nUMI_raw')
PBMC.all <- AddMetaData(object = PBMC.all, metadata = timePoints, col.name = 'TimePoints')

2.6 細(xì)胞周期分析

#細(xì)胞周期分析
mouse_cell_cycle_genes <- readRDS("E:/project/celldex數(shù)據(jù)庫/mouse_cell_cycle_genes.rds")
s.genes=mouse_cell_cycle_genes[[1]]
g2m.genes=mouse_cell_cycle_genes[[2]]
PBMC.all <- CellCycleScoring(PBMC.all, s.features = s.genes, g2m.features = g2m.genes)

mouse_cellmarker=read.csv("E:/project/cellmarker數(shù)據(jù)庫/Cell_marker_Mouse.csv",header = TRUE)
mouse_cellmarker=unique(mouse_cellmarker$Symbol)

2.7 PCA分析

#使用scaleData改變每個(gè)基因的表達(dá)赤嚼，使細(xì)胞間的平均表達(dá)為0；縮放每個(gè)基因的表達(dá)顺又，
#使細(xì)胞間的差異為1更卒，這樣高表達(dá)基因就不會(huì)影響后續(xù)分析
#這是pca等降維技術(shù)之前的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)處理步驟，同時(shí)去除細(xì)胞周期相關(guān)基因
PBMC.all = ScaleData(PBMC.all, vars.to.regress = c("S.Score", "G2M.Score"),
                      features = rownames(PBMC.all),split.by = "orig.ident")

PBMC.all <- RunPCA(PBMC.all, npcs=30,features = mouse_cellmarker,verbose = FALSE)
#其中npcs要設(shè)置的大一點(diǎn)待榔，在后面主成分分析的時(shí)候會(huì)受限于這個(gè)數(shù)值

#使用Harmony進(jìn)行整合逞壁，消除樣本間的批次效應(yīng)
PBMC.all <- RunHarmony(PBMC.all,'orig.ident')

#查看去除批次效應(yīng)前后的結(jié)果
DimPlot(PBMC.all,reduction = "pca",group.by = "orig.ident")+NoLegend()
DimPlot(PBMC.all,reduction = "harmony",group.by = "orig.ident")+NoLegend()

#用熱圖查看前500個(gè)細(xì)胞在前18個(gè)PCA中的熱圖,但分群較多，分三組展示
DimHeatmap(PBMC.all, dims = 1:6, cells = 500, balanced = TRUE)
DimHeatmap(PBMC.all, dims = 7:12, cells = 500, balanced = TRUE)
DimHeatmap(PBMC.all, dims = 13:18, cells = 500, balanced = TRUE)
#PBMC.all3用于亞群數(shù)分析锐锣，確定resolution
saveRDS(PBMC.all, "E:/project/lc_test/PBMC.all3.rds")
#PBMC.all=readRDS("E:/project/lc_test/PBMC.all3.rds")

2.8 非線性降維

#使用確定好的resolution進(jìn)行后續(xù)分析
PBMC.all = FindNeighbors(PBMC.all,reduction = "harmony",dims = 1:30)
PBMC.all <- FindClusters(object = PBMC.all,method = "igraph",resolution = 0.1)
#進(jìn)行TSNE和UMAP降維
#若前期進(jìn)行了harmony整合腌闯，需要設(shè)置reduction = "harmony"，
#若前期沒有進(jìn)行harmony整合雕憔，需要設(shè)置reduction = "pca"
PBMC.all <- RunTSNE(PBMC.all,dims = 1:30,reduction = "harmony")
PBMC.all <- RunUMAP(PBMC.all,dims = 1:30,reduction = "harmony")

#TSNE和UMAP降維結(jié)果可視化
#可以傳入split.by = "orig.ident"姿骏，按照樣品名進(jìn)行拆分再可視化，
#也可以傳入group.by = "orig.ident"斤彼，按照樣品名進(jìn)行整體可視化分瘦。以查看
#之前進(jìn)行的harmony整合是否合理
DimPlot(PBMC.all, reduction = "umap",label = T) 
DimPlot(PBMC.all, reduction = "umap", split.by = "orig.ident")
DimPlot(PBMC.all, reduction = "umap", group.by = "orig.ident")

DimPlot(PBMC.all, reduction = "tsne",label = T) 
DimPlot(PBMC.all, reduction = "tsne", split.by = "orig.ident")
DimPlot(PBMC.all, reduction = "tsne", group.by = "orig.ident")

2.9 分析各亞群的marker基因

#確定每個(gè)分群相應(yīng)的marker基因
markers = FindAllMarkers(PBMC.all,only.pos = TRUE,min.pct = 0.1,
                         logfc.threshold = 0.2,return.thresh = 0.01)
saveRDS(markers, "E:/project/lc_test/markers.rds")
top10 <- markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(PBMC.all, features = top10$gene)
#可分析特定基因在降維圖中的表達(dá)情況
FeaturePlot(PBMC.all,features = "GAPDH")

2.10 singleR 預(yù)測(cè)亞群名稱

#為singleR獲取可識(shí)別的數(shù)據(jù)集
PBMC.all_for_SingleR <- GetAssayData(PBMC.all, slot="data")
clusters=PBMC.all@meta.data$seurat_clusters
#singleR預(yù)測(cè)亞群名稱
#獲取用來自動(dòng)預(yù)測(cè)亞群的數(shù)據(jù)庫蘸泻，可用的數(shù)據(jù)庫在celldex R包里

#開始預(yù)測(cè)
load("E:/project/celldex數(shù)據(jù)庫/MouseRNAseqData.Rdata")
pred.mouseImmu_M <- SingleR(test = PBMC.all_for_SingleR, ref = MouseRNAseqData, 
                          labels = MouseRNAseqData$label.main,
                          method = "cluster", clusters = clusters, 
                          assay.type.test = "logcounts", assay.type.ref = "logcounts")
print(plotScoreHeatmap(pred.mouseImmu_M,show_colnames =TRUE))

load("E:/project/celldex數(shù)據(jù)庫/ImmGenData.Rdata")
pred.mouseImmu_I <- SingleR(test = PBMC.all_for_SingleR, ref = ImmGenData, 
                          labels = ImmGenData$label.main,
                          method = "cluster", clusters = clusters, 
                          assay.type.test = "logcounts", assay.type.ref = "logcounts")
print(plotScoreHeatmap(pred.mouseImmu_I,show_colnames =TRUE))

 #獲取預(yù)測(cè)結(jié)果
cellType=data.frame(ClusterID=levels(PBMC.all@meta.data$seurat_clusters),
                    ref.se=pred.mouseImmu_M$labels)
#可通過 fix(cellType) 對(duì)亞群名稱進(jìn)行修改

#將預(yù)測(cè)到的細(xì)胞亞群傳給原始數(shù)據(jù)集
new.cluster.ids <- cellType$ref.se
names(new.cluster.ids) <- levels(PBMC.all)
PBMC.all <- RenameIdents(PBMC.all, new.cluster.ids)
DimPlot(PBMC.all, reduction = 'umap', 
        label = TRUE, pt.size = 0.5)
###若分群不明顯，可將所有細(xì)胞分為腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞嘲玫，對(duì)免疫細(xì)胞重新進(jìn)行分析悦施，也可通過marker基因的方式，人工確定亞群名稱去团，也可結(jié)合數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)抡诞。
saveRDS(PBMC.all, "E:/project/lc_test/PBMC.all4.rds")

最后編輯于：2023.07.19 20:01:53

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萬榮殺人案實(shí)錄
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?護(hù)林員之死
正文獨(dú)居荒郊野嶺守林人離奇死亡种樱，尸身上長有42處帶血的膿包…… 初始之章·張勛以下內(nèi)容為張勛視角年9月15日...
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?白月光啟示錄
正文我和宋清朗相戀三年蒙袍，在試婚紗的時(shí)候發(fā)現(xiàn)自己被綠了。大學(xué)時(shí)的朋友給我發(fā)了我未婚夫和他白月光在一起吃飯的照片嫩挤。...
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活死人
序言：一個(gè)原本活蹦亂跳的男人離奇死亡害幅，死狀恐怖，靈堂內(nèi)的尸體忽然破棺而出岂昭，到底是詐尸還是另有隱情以现，我是刑警寧澤，帶...
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?日本核電站爆炸內(nèi)幕
正文年R本政府宣布约啊，位于F島的核電站邑遏，受9級(jí)特大地震影響，放射性物質(zhì)發(fā)生泄漏恰矩。R本人自食惡果不足惜记盒，卻給世界環(huán)境...
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男人毒藥：我在死后第九天來索命
文/蒙蒙一、第九天我趴在偏房一處隱蔽的房頂上張望外傅。院中可真熱鬧纪吮，春花似錦、人聲如沸萎胰。這莊子的主人今日做“春日...
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一樁弒父案，背后竟有這般陰謀
文/蒼蘭香墨我抬頭看了看天上的太陽奥洼。三九已至巷疼，卻和暖如春，著一層夾襖步出監(jiān)牢的瞬間，已是汗流浹背嚼沿。一陣腳步聲響...
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情欲美人皮
我被黑心中介騙來泰國打工估盘，沒想到剛下飛機(jī)就差點(diǎn)兒被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留，地道東北人骡尽。一個(gè)月前我還...
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代替公主和親
正文我出身青樓遣妥，卻偏偏與公主長得像，于是被迫代替她去往敵國和親攀细。傳聞我的和親對(duì)象是個(gè)殘疾皇子箫踩，可洞房花燭夜當(dāng)晚...
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