日期：2019年2月9日——2019-Week6
分類(lèi)：「思路,方法」
題目：An integrated chromatin accessibility and transcriptome landscape of human pre-implantation embryos
DOI: https://www.nature.com/articles/s41467-018-08244-0.pdf
雜志： Nature Communications , 21 January 2019
關(guān)鍵詞： LiCAT-seq, embryonic genome activation (EGA), chromatin accessibility (CA), gene expression (GE)
介紹
這篇文章研究的是植入前胚胎的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組圖譜壶笼，這個(gè)生物學(xué)問(wèn)題去年也發(fā)表過(guò)一些高質(zhì)量的文章引矩，如:
- Li L., et al. Single-cell multi-omics sequencing of human early embryos. Nat.
Cell Biol. 20, 847–858 (2018).- Wu, J. et al. Chromatin analysis in human early development reveals
epigenetic transition during ZGA. Nature 557, 256 (2018).- Gao, L. et al. Chromatin accessibility landscape in human early embryos and its association with evolution. Cell 173, 248–259. e215 (2018).
那么這篇文章有什么創(chuàng)新和獨(dú)特的地方，以及有什么不足的地方望蜡？
- 首先這篇文章報(bào)道了一種新的方法 LiCAT-seq
LiCAT-seq可以用于微量細(xì)胞同時(shí)分析染色質(zhì)的可及性和基因表達(dá)圖譜的方法。 - 發(fā)現(xiàn)了在人類(lèi)植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中躺苦，DUX4誘導(dǎo)了EGA基因和 MLT2A1元件處染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑源葫。
關(guān)于DUX4在EGA過(guò)程中扮演的重要作用，之前也有研究報(bào)道驱犹，這篇文章從數(shù)據(jù)分析的角度補(bǔ)充了DUX4調(diào)控的細(xì)節(jié)嘲恍，揭示了DUX4結(jié)合的一些基因，并且發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在與DUX4的結(jié)合雄驹，這個(gè)結(jié)果雖說(shuō)不是新的發(fā)現(xiàn)佃牛，但是補(bǔ)充完善了以前的機(jī)制，但是缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證医舆，整篇文章沒(méi)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出來(lái)的結(jié)論俘侠，這是這篇文章的一個(gè)不足。 - 提供了完整的代碼和數(shù)據(jù)資源
LiCAT-seq的介紹
首先裂解分離mRNA和細(xì)胞核蔬将，然后對(duì)mRNA和染色質(zhì)可及性平行建庫(kù)爷速，之后轉(zhuǎn)錄組用Smart-seq2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，ATAC-seq建庫(kù)測(cè)序的方法他們做了些優(yōu)化霞怀，LiCAT-seq可實(shí)現(xiàn)最少可用于10個(gè)細(xì)胞的建庫(kù)和分析的目的惫东。
技術(shù)上的優(yōu)化主要是以下兩個(gè)方面：
- Tn5轉(zhuǎn)座酶標(biāo)記后充分裂解細(xì)胞核
- 預(yù)擴(kuò)增后使用Tn5接頭的引物純化基因組DNA
轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性圖譜的整體變化
他們主要關(guān)注從受精卵（ zygote）到囊胚（blastocyst ）時(shí)期以及卵母細(xì)胞（oocytes）和精子（ sperm）時(shí)期轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性圖譜的變化。受精卵到囊胚經(jīng)歷了2毙石、4廉沮、8細(xì)胞和桑葚胚（morula），其中囊胚時(shí)期細(xì)分為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)外胚層(TE)徐矩。所以共包括9個(gè)時(shí)期滞时。
他們通過(guò)對(duì)ATAC-seq peaks數(shù)目的統(tǒng)計(jì)觀(guān)察到從2細(xì)胞到胚胎發(fā)育晚期，染色質(zhì)可及性的區(qū)域逐漸增多丧蘸，卵子時(shí)期染色質(zhì)可及性區(qū)域非常少漂洋，只有54個(gè)peaks遥皂，但是精子的染色質(zhì)可及性卻明顯不同，開(kāi)放區(qū)域還是較多的刽漂，有趣的是受精卵時(shí)期的染色質(zhì)可及性出現(xiàn)短暫的增強(qiáng)演训。他們進(jìn)一步比較了精子和卵子時(shí)期染色質(zhì)可及性的區(qū)域重合部分很少，而且精子的開(kāi)放區(qū)域分布在gene-poor區(qū)域贝咙，與其他時(shí)期明顯不同（fig 1d）, 在卵子和胚胎發(fā)育其他時(shí)期reads數(shù)和gene數(shù)成正比样悟，精子展現(xiàn)出相反的規(guī)律（fig 1e），精子染色質(zhì)可及性區(qū)域的gene數(shù)目少的特征可能對(duì)母本的TFs的結(jié)合至關(guān)重要庭猩，從而促使完成父本的重編程窟她。
另外他們也用Y叔ChIPseeker R包對(duì)開(kāi)放區(qū)域的基因組分布特征做了統(tǒng)計(jì)，并用PCA對(duì)ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)分析蔼水，觀(guān)察胚胎發(fā)育每個(gè)時(shí)期變化的關(guān)系震糖。
聚類(lèi)然后分析每個(gè)模塊的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性圖譜
胚胎基因組的激活（ embryonic genome activation ，EGA)是胚胎植入前發(fā)育的重要事件趴腋。為了探究染色質(zhì)可及性對(duì)EGA的影響作用吊说，作者采用Mfuzz的聚類(lèi)方法，將2細(xì)胞到桑葚胚時(shí)期的CA圖譜聚成6類(lèi)优炬。
他們主要關(guān)注EGA中上調(diào)的基因颁井，并將上調(diào)的基因與CA每個(gè)cluster相匹配觀(guān)測(cè)啟動(dòng)子與遠(yuǎn)端區(qū)域的染色質(zhì)可及性的變化，總體上CA和GE動(dòng)態(tài)變化展現(xiàn)出相似的趨勢(shì)蠢护。另外他們還挑選出特定的基因展示了CA和GE的變化雅宾。
整合RNA-seq和 ATAC-seq分析轉(zhuǎn)錄因子
用Homer鑒定胚胎發(fā)育每個(gè)時(shí)期染色質(zhì)可及性差異區(qū)域的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如圖a所示葵硕，展示了每個(gè)時(shí)期特異的轉(zhuǎn)錄因子的富集信號(hào)和基因表達(dá)水平眉抬。之前的研究報(bào)道過(guò)DUX4在EGA過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但是缺乏人植入前胚胎的表觀(guān)數(shù)據(jù)贬芥，對(duì)DUX4如何調(diào)控其靶基因的機(jī)制并不是很清晰吐辙，因此，他們接下來(lái)主要關(guān)注DUX4在EGA過(guò)程中發(fā)揮作用的機(jī)制蘸劈。
從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)他們發(fā)現(xiàn)DUX4, NFY 和SP1在4細(xì)胞時(shí)期表達(dá)量高昏苏，在隨后的時(shí)期急劇減少。那么DUX4的結(jié)合與染色質(zhì)可及性有什么關(guān)系呢威沫？他們接下來(lái)通過(guò)DUX4的ChIP-seq數(shù)據(jù)贤惯，發(fā)現(xiàn)DUX4在2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期富集信號(hào)強(qiáng)，隨后減少棒掠。并且發(fā)現(xiàn)DUX4的結(jié)合區(qū)域與CA的cluster 1重合比例最大孵构，這也表明了DUX4在EGA起始中扮演的重要作用。
作者將DUX4結(jié)合位置的上下游10kb內(nèi)的基因定義為DUX4的靶基因烟很，然后觀(guān)察其靶基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況颈墅，并將表達(dá)模式歸結(jié)為3類(lèi)蜡镶。第1類(lèi)，基因的表達(dá)在4恤筛，8細(xì)胞時(shí)期短暫升高官还，第2類(lèi)，基因的表達(dá)在胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸降低毒坛，表明這些基因最初可能是母系轉(zhuǎn)錄本望伦，第3類(lèi)，基因的表達(dá)在胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸升高煎殷，表明DUX4可能起始了其他TFs的結(jié)合屯伞。DUX4可能通過(guò)誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑來(lái)激活EGA基因。
這一部分選擇哪個(gè)TF做進(jìn)一步探究需要熟悉相關(guān)的研究進(jìn)展豪直，哪些因子的作用是已知的劣摇，哪些是未知的，是否真正發(fā)揮作用需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顶伞，文章的這一部分做的并不是很完善饵撑。
逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)圖譜的分析
這一部分算是文章的一個(gè)亮點(diǎn)，探究了逆轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)圖譜唆貌。
逆轉(zhuǎn)座子認(rèn)為是古病毒感染的殘留物，占人類(lèi)基因組的40%以上垢乙，包括LTR/ERV（ long terminal repeats containing elements锨咙，termed “LTR retrotransposons” or “endogenous retroviruses (ERVs)”）和LTR-lacking elements（such as LINEs, SINEs, and SVA elements），可作為調(diào)控元件影響宿主基因的轉(zhuǎn)錄追逮。
他們觀(guān)察到ERV元件最早的開(kāi)放出現(xiàn)在4細(xì)胞期（如：LTR12C 和MLT2A1）酪刀，另外OTX4和DUX家族的TFs在MLT2A1處顯著富集，在LTR12C未出現(xiàn)相同的的富集钮孵。接下來(lái)計(jì)算了人ESCs中OTX4和DUX4的結(jié)合位點(diǎn)與4細(xì)胞階段可接近的MLT2A1元件的交叉點(diǎn)骂倘，他們發(fā)現(xiàn)在4細(xì)胞階段30.2%的MLT2A1元件被DUX4結(jié)合，只有9.5%被OTX2結(jié)合巴席，表面DUX4在激活MLT2A1發(fā)揮的作用強(qiáng)于OTX2历涝。
以上的結(jié)果表明DUX4通過(guò)結(jié)合到MLT2A1元件來(lái)激活HERVL，這是EGA期間ERV激活的主要事件漾唉。
代碼和數(shù)據(jù)
- 代碼
https://github.com/single-cell-BGI/Human_Embryo_LiCAT - 數(shù)據(jù)
