搜庫前準(zhǔn)備
搜庫前應(yīng)重裝系統(tǒng)，清空不必要的東西咽块，可在服務(wù)器A4, A5重裝win7 PE版本（自帶U深度PE裝機(jī)工具）;安裝完后需要激活一下win7
安裝绘面，均在A4服務(wù)器的C盤
apache(一個(gè)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器)安裝:D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
點(diǎn)擊exe安裝, 填寫郵箱名可以是假的，但必須跟后面保持一致（如66@.com）侈沪；登錄localhost時(shí)（http://127.0.0.1/）出現(xiàn) it works揭璃！為安裝成功Perl x64 語言安裝 （Mascot是基于Perl語言編寫的）
D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
3.Mascot x64 安裝:D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
安裝時(shí)，要找到安裝包內(nèi)的mascot.licence 的具體路徑亭罪，將其粘到指定的licence 框內(nèi)
mascot.licence 的具體路徑: D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
為了讓apache讀懂Mascot瘦馍，需要將/MASCOT/ 文件夾內(nèi)的httpd.config文件中的全部內(nèi)容，黏貼到/apache/文件夾內(nèi)的httpd.config文件尾部皆撩，保存后重新打開apache扣墩，restart一下apache，再刷新Mascot網(wǎng)頁扛吞。成功則可看見Mascot 網(wǎng)頁的相關(guān)搜庫內(nèi)容呻惕。
PS: 若刷新網(wǎng)頁失敗，多半是因?yàn)閍pache沒有被打開滥比，或重啟成功亚脆，多重啟嘗試則可！
4.Netframework 安裝
為了可對搜庫進(jìn)行批量操作盲泛，需要使用Daemon濒持，但Daemon安裝前键耕，需要安裝Netframework 4.5版本，Netframework在此類似JAVA柑营，用于解釋.exe軟件
存放路徑：D:\Software\Drivers\Package\NetFramework
PS: 1. Netframework 4.5用于win 7電腦屈雄；若在win10 上安裝Daemon，則不需要安裝Netframework
Daemon 安裝（也稱Mascot Daemon）D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
Daemon可對搜庫進(jìn)行批量操作官套。Scaffold安裝 D:\Program\Proteome\Q+S
1）重裝服務(wù)器后酒奶，本機(jī)的時(shí)間需要該licence的時(shí)間，安裝時(shí)將licence 粘進(jìn)對應(yīng)的框（sn.txt文件為licence）
2）在【控制面板】奶赔，進(jìn)入【防火墻】惋嚎，高級設(shè)置，選【出站規(guī)則】站刑，【新建規(guī)則】另伍，選【程序】，將Scaffold文件夾下的 jre/bin/javaw.exe block掉绞旅， 選【阻止連接】摆尝，再隨便重命名一下
c:/program file/scaffold 4
MASCOT搜庫
- peptide Mass Fingerprint 是按蛋白的KD數(shù)進(jìn)行搜庫；
- 單個(gè)Raw文件可在Ions Search進(jìn)行搜庫玻靡，但前提需要將raw文件的.wiz格式轉(zhuǎn)為mgf格式
3.搜庫前建庫：
1）可在uniprot上下載所需的物種參考氨基酸序列：
在Taxonmy下结榄，選view protein，選擇Swiss prot(這個(gè)參考序列屬于一個(gè)基因?qū)?yīng)一個(gè)全長protein)囤捻，
選擇.fasta格式進(jìn)行下載 （有時(shí)候注釋時(shí)也需要將其.txt格式的文件一起下載）
2）進(jìn)入MASCOT網(wǎng)頁，導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫http://a4/mascot
在 Configuration editor進(jìn)入邻寿，選database maintence, 進(jìn)入建庫操作面板蝎土，修改：
（1）選上Active, AA(氨基酸)，mem lock(把數(shù)據(jù)放入內(nèi)存進(jìn)行搜庫)绣否；
（2）將路徑C:/MASCOT/sequence/Mouse/GRCm38.fa輸入指定框誊涯，并修改為：C:/MASCOT/sequence/Mouse/GRCm38*.fa
（3）只保留parse accession 和 parse description 這兩項(xiàng)，并且parse accession選4th項(xiàng)蒜撮，parse description 選5th項(xiàng)暴构，后面的空格全清空，再點(diǎn)擊test definition 看格式是否喜歡段磨，最后確定正確不報(bào)錯時(shí)點(diǎn)擊Apply 使用取逾。
（4）然后在MASCOT網(wǎng)頁database status（http:/a4/mascot/x-cgi/ms-status.exe）上瘋狂F5刷新，觀察status達(dá)到 In use(在刷新時(shí)苹支，索引fasta文件會慢慢進(jìn)入MASCOT砾隅，需要稍等)
Daemon的搜庫前工作
1.先導(dǎo)入/IBS/文件夾已有的參數(shù)設(shè)置：D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3\IBS ,再保存為tmp.par，再在Task Editor導(dǎo)入债蜜，保存在/IBS/parameter/晴埂。
2.導(dǎo)入餾分究反，理論上每個(gè)餾分都單獨(dú)進(jìn)行搜庫；
PS: 餾分輸入下面有一個(gè)選項(xiàng)儒洛，[Merge MS/MS]精耐，這一項(xiàng)適用于多個(gè)餾分對應(yīng)一個(gè)樣本的情況，才可以merge
- 在MASCOT建庫成功后琅锻，重啟Daemon 可見新庫已建入黍氮，run即可；
- 搜庫完成后浅浮，結(jié)果放在：MASCOT/data/.dat沫浆，均可用Scaffold進(jìn)一步整合分析，也可用高級版的MASCOT查看其他相關(guān)信息滚秩；
PS: 1. 理論上1個(gè)mgf文件對應(yīng)1個(gè)dat文件专执，均可在Daemon的進(jìn)程列表上查詢；
2.基本上按照輸入順序搜庫郁油，序號為輸出的終止時(shí)間本股。
Scaffold整合文件及分析
官網(wǎng)下載Install_Scaffold_Q+S_5.2.0_Windows_x64或4.0版本，安裝后導(dǎo)數(shù)據(jù)桐腌。
- 將MASCOT/data/.dat的搜庫結(jié)果拄显，先按組別名字劃分好文件夾，按組順序分別導(dǎo)入案站，如三次重復(fù)組：A,B,C仨組（x 21個(gè)餾分）分別進(jìn)入躬审；
- 導(dǎo)入時(shí)若報(bào)錯memory不足，可在【Edit】中的【Preference】中蟆盐，設(shè)置【Memory】為16G（16000MB）承边；
- 統(tǒng)計(jì)分析：進(jìn)入【Quant】中【Update Experimental Design】，設(shè)置：
- 設(shè)【Analysis Type】為Ratio-based;
- 設(shè)【Experiment Type】為Between-subjects(Independent Groups);
- 設(shè)【Edit Sample Names and Categories】設(shè)置組數(shù)以及對應(yīng)的組別顏色石挂；
-
設(shè)【Organize Quant Samples】中博助，將每組對應(yīng)的餾分拖進(jìn)改組，設(shè)置【Reference】為control 組的餾分痹愚，F(xiàn)inish 后 Update Samples富岳；
3e9762b407ecb2a85d746c5b2d5bade.jpg
- 保存為.sf3文件，方便后續(xù)導(dǎo)入拯腮；
- 導(dǎo)出數(shù)據(jù)前窖式，可設(shè)置:
1)【hide decoys】去掉decoys;
- Min peptides=2 或FDR threshold=1%;
- Protein Threshold=99% , Peptides Threshold=95%(若蛋白過少，可放松倆閾值到90%);
4)選擇【Quant】中【Launch Q+ Quantitation Module】模塊疾瓮，進(jìn)行需要一段時(shí)間脖镀，選擇【Display Options】為Fold Change Ratio，然后右鍵選擇【Copy All Data】，黏貼到新的Excel表格去蜒灰。
