當(dāng)我們做轉(zhuǎn)染實驗的時候赫模，總會遇到一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。恰巧課題組研究的是原代細(xì)胞蚀腿、神經(jīng)細(xì)胞或者是免疫細(xì)胞嘴瓤，化學(xué)轉(zhuǎn)染方法反復(fù)試驗失敗，這時候就得借助電轉(zhuǎn)來幫助我們推進(jìn)實驗進(jìn)程了莉钙。
對于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，在電轉(zhuǎn)前需要進(jìn)行不同的處理筛谚。
貼壁細(xì)胞
電穿孔前一天磁玉，通過胰酶消化釋放貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含新鮮生長培養(yǎng)基的75cm2細(xì)胞瓶中驾讲，接種密度應(yīng)保證電穿孔當(dāng)天細(xì)胞能夠達(dá)到50%~70％的匯合度（多數(shù)細(xì)胞系為每次電穿孔1 X 105~ 10 X105細(xì)胞）蚊伞。
實驗當(dāng)天，吸出生長培養(yǎng)基吮铭， PBS 洗滌細(xì)胞时迫，胰酶消化釋放貼壁細(xì)胞。取胰酶消化的細(xì)胞懸液谓晌，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞密度掠拳。細(xì)胞懸液于室溫下500g 離心5min 。
用適當(dāng)?shù)碾姶┛拙彌_液按1 X 106~ 5 X 106細(xì)胞／mL 的密度重懸細(xì)胞沉淀纸肉。輕輕吹打細(xì)胞獲得均一懸液溺欧。
懸浮細(xì)胞
電穿孔前一天，于75cm2細(xì)胞瓶中用新鮮生長培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞柏肪， 以保證電穿孔當(dāng)天細(xì)胞能夠達(dá)到指數(shù)生長中期的匯合度( 0. 5 X 106~4 X 106個細(xì)胞／mL ) 姐刁。計數(shù)細(xì)胞并按上述離心收集細(xì)胞。
用適當(dāng)?shù)碾姶┛拙彌_液按1 X 106~5 X 106個細(xì)胞／mL 的密度重懸細(xì)胞沉淀烦味。輕輕吹打細(xì)胞獲得均一懸液聂使。
電穿孔操作步驟
1. 在電穿孔儀器上設(shè)置參數(shù)。根據(jù)細(xì)胞類型選擇預(yù)設(shè)程序或優(yōu)化程序谬俄。對于指數(shù)程序（即指數(shù)衰減脈沖） 柏靶， 通常電容為1050μF , 電壓在200 ~ 350V 。一般260V 起始電壓凤瘦、以50V遞增對大多數(shù)細(xì)胞有效宿礁。內(nèi)部阻抗設(shè)為無限大。
2.向電穿孔杯中加入10 ~ 50μg 質(zhì)粒DNA 蔬芥。如有必要梆靖， 可加入運載DNA控汉，使DNA 總量達(dá)到120μg 。
3.向電穿孔杯中加入細(xì)胞返吻，輕輕反復(fù)吹打使細(xì)胞和DNA 混勻姑子。
4.將電穿孔杯放進(jìn)電穿孔儀，蓋上蓋子测僵，進(jìn)行一次電脈沖街佑。
5.立即向電穿孔杯中加入0.5mL 生長培養(yǎng)基，然后將電擊后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到合適大小的組織培養(yǎng)皿或多孔板中捍靠。如有必要沐旨， 用生長培養(yǎng)基漂洗0.2cm 或0.4cm 電穿孔杯，然后將漂洗液加到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞中榨婆。
6.對每個樣品和每個電壓增量均重復(fù)步驟5和步驟6 磁携。記錄每個電穿孔杯的實際脈沖時間和時間常數(shù)以便于各次實驗間的比較。對于哺乳動物細(xì)胞良风，最適條件是場強(qiáng)為400 ~900V/cm谊迄、脈沖時間或時間常數(shù)為10 ~ 40ms 。輕輕晃動平板以使細(xì)胞均勻分布于整個孔或培養(yǎng)皿烟央。
7.將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板放到含5 %~ 7% CO2的37°C 濕潤保溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞6 ~ 24h 统诺。
8.檢測細(xì)胞活力。
9.如要分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體疑俭，可按分離步驟操作粮呢。
10.對于瞬時表達(dá)，于電穿孔后24 ~96h對細(xì)胞進(jìn)行檢測怠硼。
同時鬼贱，電穿孔效率受以下幾種因素的影響：
1.外加電場的強(qiáng)度。電壓過低香璃，培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)膜的改變不足以允許DNA 通過这难；電壓過高，細(xì)胞會受到不可逆的損傷葡秒。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞系姻乓， 電壓250~ 500V/cm時可達(dá)到最高瞬時表達(dá)水平。通常經(jīng)過電穿孔眯牧， 20% ～ 50％的細(xì)胞能夠存活（根據(jù)臺盼藍(lán)拒染法的檢測結(jié)果）蹋岩。
2.電脈沖時間的長短。通常對細(xì)胞進(jìn)行單次電脈沖学少。電脈沖的持續(xù)時間剪个、電場形狀和強(qiáng)度由電源容量及電穿孔杯尺寸決定。多數(shù)電穿孔裝置允許研究者控制脈沖參數(shù)版确，電穿孔儀有指數(shù)衰減波和方形波兩種電脈沖形狀可供選擇扣囊。
3.溫度乎折。有些研究者報道， 電穿孔過程中將細(xì)胞維持在室溫時瞬時表達(dá)水平最高侵歇；而有的將細(xì)胞保持在0 °C 獲得了更好的結(jié)果骂澄。造成以上差異的原因可能是細(xì)胞類型不同或電穿孔過程中產(chǎn)熱量不同， 較高電壓（大于1000V/cm)惕虑、較長時間電脈沖（大于l00ms) 的情況容易產(chǎn)生較多的熱量坟冲。電脈沖處理后再將細(xì)胞于電穿孔室內(nèi)孵育l ~2min 可提高瞬時表達(dá)效率 。
4.DNA 的構(gòu)象與濃度溃蔫。雖然線性和環(huán)狀DNA 均能夠通過電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染健提，但采用線性DNA 進(jìn)行瞬時表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水平均更高些 。采用1 ~40μg/mL 濃度的DNA 可獲得高效的轉(zhuǎn)染伟叛。質(zhì)粒純度也是影響電穿孔效率的重要因素矩桂。
5.培養(yǎng)基的離子成分。用緩沖鹽溶液（如HEPES 鹽緩沖液）懸浮細(xì)胞痪伦，轉(zhuǎn)染效率比用含甘露糖或蔗糖等非離子物質(zhì)的緩沖液高數(shù)倍。
6.細(xì)胞的生理狀態(tài)雹锣。生長活躍网沾、狀態(tài)健康、無污染蕊爵、最好低代次的細(xì)胞可獲得最佳轉(zhuǎn)染效果辉哥。
