原文：信號(hào)通路研究思路_百度文庫(kù) https://wenku.baidu.com/view/449d5a41ec3a87c24128c450

證明一個(gè)藥物能通過(guò)抑制P38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，需要做的是：

要證明你的藥物是通過(guò)抑制P38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用侮繁，

首先 危融，要證明P38表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷安券。

其次，要證明你的藥物存在保護(hù)作用棺牧。

再次，證明你的藥物可以抑制P38表達(dá)。

最后截歉，證明你的藥物是由于抑制了P38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。

首先證明P38表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷烟零。

這里需要建立一個(gè)損傷模型瘪松。正如你提到的，鈣離子導(dǎo)致P38mapk的增高瓶摆，如果某種損傷可以通過(guò)鈣離子導(dǎo)致P38mapk的增高凉逛，那么你就建立起了一個(gè)損傷模型。這時(shí)群井，對(duì)P38做個(gè)RNA干擾状飞，使其表達(dá)下降，再來(lái)?yè)p傷刺激书斜，如果這時(shí)損傷刺激不會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷诬辈，那么可以說(shuō)P38mapk的增高會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷。

這里最好不要用P38的抑制劑SB來(lái)處理荐吉，因?yàn)檫@個(gè)抑制劑是針對(duì)P38活性的抑制劑焙糟，抑制的是P38的磷酸化，而不是表達(dá)量样屠。

如果說(shuō)明的問(wèn)題是p38磷酸化水平增加而導(dǎo)致?lián)p傷穿撮，那么我建議用抑制劑。這時(shí)還可以用Dominant-negative痪欲。抑制劑的實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥物不影響P38表達(dá)悦穿，而影響其活化。（應(yīng)該首先考慮選用抑制劑业踢，因?yàn)槟壳耙恍┧幬锏淖饔脵C(jī)制不是抑制靶點(diǎn)的表達(dá)栗柒，而是抑制靶點(diǎn)的激活。如果在此應(yīng)用RNAi的話知举，很可能會(huì)漏掉這個(gè)機(jī)制或增加實(shí)驗(yàn)步驟瞬沦。）

其次太伊，要證明你的藥物存在保護(hù)作用。

當(dāng)然就是用你的藥物先處理一下逛钻，再來(lái)?yè)p傷刺激僚焦，如果這時(shí)損傷刺激不會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷，那么可以說(shuō)你的藥物存在保護(hù)作用绣的。

再次叠赐，證明你的藥物可以抑制P38表達(dá)。

用你的藥物先處理一下屡江，再來(lái)?yè)p傷刺激芭概，再檢測(cè)P38表達(dá)，如果用藥組相對(duì)于沒(méi)有用藥組P38表達(dá)下降惩嘉，那么可以說(shuō)你的藥物可以抑制P38表達(dá)罢洲。

最后，證明你的藥物是由于抑制了P38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用文黎。

這一步看似不必要惹苗，其實(shí)是最重要的步驟，而國(guó)內(nèi)的文章往往忽略了這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)耸峭。

這里建議還是用RNA干擾P38表達(dá)桩蓉，再用你的藥物處理，再進(jìn)行損傷刺激劳闹，如果用藥組與沒(méi)有用藥組的損傷程度一致院究，那么才可以說(shuō)你的藥物是由于抑制了P38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。

抑制劑也有其局限性本涕，有時(shí)是“致命”的业汰，主要原因是抑制劑缺乏特異性。雖然我們?cè)谖恼吕锟吹接靡种苿┑臅r(shí)候都說(shuō)是什么什么的特異性抑制劑菩颖，但真的那么特異嗎样漆？其實(shí)往往是作者為了寫文章發(fā)文章的需要而夸大了抑制劑的特異性。細(xì)胞里無(wú)數(shù)的信號(hào)通路晦闰，誰(shuí)也不能保證抑制劑在作用于靶分子時(shí)不會(huì)影響其他信號(hào)通路放祟。其實(shí)無(wú)論什么抑制劑，對(duì)劑量的要求都相對(duì)比較苛刻呻右，為什么舞竿？就是因?yàn)橐坏舛雀吡耍筒恢罆?huì)干擾到其他哪些信號(hào)通路窿冯，從而產(chǎn)生很多說(shuō)不清道不明的現(xiàn)象。

PI3K的抑制劑---LY294002和wortmannin,它們都能抑制PI3K和相關(guān)的激酶确徙，但LY294002的濃度達(dá)到200μM常用來(lái)抑制DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）醒串；wortmannin在濃度超過(guò)3μM常用來(lái)抑制運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張基因突變（ATM)以及DNA-PK执桌。相對(duì)而言，MEK1/2的抑制劑U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制劑SB203580就要好一些芜赌。所以研究人員一般應(yīng)用LY294002時(shí)采用20μM仰挣，應(yīng)用wortmannin時(shí)采用0.2μM，以此來(lái)最小化其他的效應(yīng)缠沈。有些學(xué)者們同時(shí)應(yīng)用兩種抑制劑進(jìn)行對(duì)比膘壶，也許也有顧及于此的原因吧。

但是洲愤，從嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕嵌戎v起特異性的話颓芭，RNAi也不能說(shuō)是絕對(duì)特異的，我們只能說(shuō)它是高特異性柬赐，因?yàn)镽NAi的機(jī)制中還有很多沒(méi)有完全闡明亡问。一些研究者會(huì)在RNAi處理后，還要在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Western來(lái)同時(shí)檢測(cè)該蛋白所在家族的其他成員的表達(dá)量變化以檢測(cè)其特異性和選擇性肛宋，以表嚴(yán)謹(jǐn)州藕。舉個(gè)例子：

比如針對(duì)Survivin進(jìn)行RNAi之后，你最好同時(shí)檢測(cè)XIAP , cIAP1/2等蛋白酝陈。當(dāng)然床玻，如果你所針對(duì)基因的siRNA構(gòu)建已經(jīng)很成熟，有前人的文章檢測(cè)特異性做基礎(chǔ)沉帮，那就另當(dāng)別論了锈死，所以給科研態(tài)度很嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膌wjssry兄弟提個(gè)醒，如果你的siRNA序列尚無(wú)很好的文獻(xiàn)應(yīng)用基礎(chǔ)遇西，這個(gè)問(wèn)題你也許應(yīng)該考慮的馅精。

臨時(shí)找到一個(gè)描訴相關(guān)內(nèi)容的06年文獻(xiàn)，影響因子3分多粱檀，截取其中的內(nèi)容供參考

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信號(hào)通路有細(xì)胞特異性和條件特異性洲敢，即同一信號(hào)通路在不同的細(xì)胞之間或同一細(xì)胞在不同的條件下，作用機(jī)理可能是不同的茄蚯。

細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用压彭，想證明哪一個(gè)分子是另一分子的充要條件真的很難。本人最近研究了一個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的兩個(gè)信號(hào)分子渗常，A和B壮不。A在細(xì)胞質(zhì)，B在細(xì)胞核皱碘。以往的研究已經(jīng)證明A是B的上游信號(hào)通路之一询一。我們的研究是想證明在某種病理過(guò)程中A和B作為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮作用。我們首先應(yīng)用能夠提升該系統(tǒng)的藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)A升高的同時(shí)B也得到升高健蕊，但這也不能說(shuō)明什么問(wèn)題菱阵。所幸的是A分子目前有特異性的阻斷劑，于是我們便對(duì)A分子的激活進(jìn)行阻斷缩功，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B分子的激活也收到抑制晴及。由此初步推測(cè)A和B可能在某種病理過(guò)程中作為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮作用。但也只能證明了A是B的必要條件而已嫡锌。

做信號(hào)傳導(dǎo)的在于你研究一種的機(jī)制有什么作用虑稼，其機(jī)制是否于信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，有哪些關(guān)系势木，是什么原因?qū)е麓诵盘?hào)傳導(dǎo)的表達(dá)蛛倦，表達(dá)后的下游基因怎么變化，這中間最好有基因敲出或者抑制劑和激動(dòng)劑干預(yù)后看看上游 下游之間的變化和你預(yù)期的結(jié)果有沒(méi)有關(guān)系跟压。如果單純的做信號(hào)傳導(dǎo)而去做沒(méi)有什么意義的胰蝠，就像前面樓上說(shuō)的一樣信號(hào)的啟動(dòng)/最終發(fā)揮功能！

“想證明哪一個(gè)分子是另一分子的充要條件真的很難”震蒋。我最近正在做一個(gè)實(shí)驗(yàn)茸塞，證明A對(duì)B的作用。先用外源物處理細(xì)胞查剖，跑wetern blot钾虐，發(fā)現(xiàn)A和B都有所增加，B的量增加在A之后笋庄。于是用抑制劑抑制A效扫，以及用siRNA使A knockdown，然后看B的表達(dá)量也下來(lái)了直砂。但是這也只能證明A和B有關(guān)聯(lián)菌仁，無(wú)法證明A對(duì)B是直接作用還是間接作用。甚至無(wú)法說(shuō)明B的改變是A信號(hào)knockdown造成的静暂，還是A信號(hào)knockdown以后济丘，細(xì)胞為了彌補(bǔ)該信號(hào)的不足，補(bǔ)充促進(jìn)了C信號(hào)洽蛀，而C信號(hào)可以改變B信號(hào)摹迷。最近在考慮用Co-IP證明A和B有結(jié)合作用，也許能證明A和B的直接關(guān)系郊供。

探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中分子間的充要條件峡碉，與探討數(shù)學(xué)中的充要條件是不一樣的，因?yàn)榧?xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路往往存在反饋機(jī)制驮审。即使X是上游信號(hào)鲫寄，Y是下游信號(hào)吉执，改變Y信號(hào)也會(huì)通過(guò)反饋機(jī)制使得X信號(hào)發(fā)生改變。所以塔拳，在考慮生物體內(nèi)的信號(hào)分子間充要條件時(shí)會(huì)復(fù)雜得多鼠证，要慎之又慎下結(jié)論。

信號(hào)分子的環(huán)路效應(yīng)普遍存在

個(gè)人覺(jué)得研究A分子與某個(gè)信號(hào)通路應(yīng)該更具體得分為兩種情況：

1靠抑，以前還不知道A分子是這個(gè)信號(hào)通路的成分，這時(shí)我們要證明A分子是這個(gè)信號(hào)通路的成分适掰，這時(shí)的研究就是上文談到的研究?jī)?nèi)容了颂碧。

2，A分子是信號(hào)通路的成分类浪，這是已知的载城，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)某個(gè)現(xiàn)象跟這個(gè)通路有關(guān)，現(xiàn)在我們要證明A分子是這個(gè)信號(hào)通路參與這個(gè)現(xiàn)象的關(guān)鍵分子费就，則又是另一種模式诉瓦。1，“創(chuàng)造信號(hào)通路”力细，別人沒(méi)有研究過(guò)A和B 之間的相互作用睬澡，而你發(fā)現(xiàn)了，并證明了眠蚂，這就是創(chuàng)造煞聪，其實(shí)準(zhǔn)確點(diǎn)說(shuō)應(yīng)該是“發(fā)現(xiàn)”，因?yàn)樾盘?hào)通路是客觀存在的逝慧，只不過(guò)被找到了而已昔脯，不過(guò)用“創(chuàng)造”這個(gè)詞比較形象。這一類的研究是開(kāi)創(chuàng)性的笛臣，比較困難的云稚，研究的時(shí)候常常是用免疫共沉淀去把與某個(gè)蛋白結(jié)合的一堆蛋白都搞出來(lái)，再做質(zhì)譜分析沈堡，進(jìn)行鑒定静陈，再進(jìn)一步證明兩者間的相互作用，這就涉及到充分必要條件的證明踱蛀。單純進(jìn)行這一類的研究缺乏目的性和研究的意義窿给，所以通常還是建立于某種現(xiàn)象基礎(chǔ)上的，用自己“創(chuàng)造”的信號(hào)通路來(lái)解釋某種現(xiàn)象率拒，也就是下面說(shuō)的第二種模式崩泡。

2，“利用信號(hào)通路”猬膨，利用別人或自己“創(chuàng)造”的信號(hào)通路來(lái)解釋某個(gè)具體的現(xiàn)象角撞，比如呛伴，某個(gè)藥物、某種毒物谒所、某種應(yīng)激热康、某種射線、等等劣领，在這些刺激下姐军，具體到某種細(xì)胞的某條信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用。

在第一類中尖淘，是用充分必要條件來(lái)證實(shí)A分子與B分子的作用奕锌。

在第二類中，是用充分必要條件來(lái)證實(shí)A現(xiàn)象與B信號(hào)通路之間的關(guān)系村生。

看文獻(xiàn)是最基礎(chǔ)的訓(xùn)練惊暴，看文獻(xiàn)，一是看思路趁桃，二是學(xué)技術(shù)和邏輯思維辽话。思路告訴我們?yōu)槭裁慈プ觯夹g(shù)和邏輯思維教我們?cè)趺慈プ觥?/strong>