細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-80℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)床嫌，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過(guò)程驶赏。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常既鞠，生化反即刻恢復(fù)煤傍。細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快，原則是慢凍快融嘱蛋，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞蚯姆，形成冰晶，影響細(xì)胞存活洒敏。

細(xì)胞復(fù)蘇是一簡(jiǎn)單的試驗(yàn)操作龄恋，但操作中有許多需要注意的事項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)小問(wèn)題凶伙，才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)保持良好郭毕。

細(xì)胞復(fù)蘇的基本原則

快速融化：細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞函荣，形成冰晶显押，影響細(xì)胞存活。

在復(fù)蘇時(shí)傻挂，需要快速升溫乘碑，在 1-2 min 內(nèi)融化并稀釋，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)外還來(lái)不及形成較大的冰晶金拒，也不會(huì)使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中兽肤，從而避免細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率绪抛。

避免溫度變化：在復(fù)蘇過(guò)程中资铡，應(yīng)盡量避免溫度的劇烈變化，以免對(duì)細(xì)胞造成額外的壓力幢码。

細(xì)胞復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)步驟

1. 開啟37℃水浴鍋笤休。預(yù)熱完全培養(yǎng)基，提前將細(xì)胞從液氮中取出蛤育，放于-80℃冰箱宛官，讓凍存管中液氮揮發(fā)葫松。

2. 潔凈工作臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備15 mL離心管，加入至少5 mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基底洗。

3. 從-80℃冰箱中取出細(xì)胞腋么。快速將凍存管置于37℃水浴鍋內(nèi)亥揖，快速晃動(dòng)珊擂，使凍存液迅速融化。

注意：（1) 融化過(guò)程必須晃動(dòng)凍存管费变，保證凍存液融化均勻摧扇。晃動(dòng)時(shí)應(yīng)避免水沒(méi)過(guò)管蓋增加污染風(fēng)險(xiǎn)挚歧。

????????（2) 管內(nèi)凍存液融化至只剩一個(gè)約2 mm直徑的冰晶時(shí)扛稽，可停止水浴。繼續(xù)晃動(dòng)凍存管至冰晶融化滑负。

4. 用75%酒精消毒凍存管表面在张。在潔凈工作臺(tái)內(nèi)小心開蓋，盡量避免氣泡溢出矮慕，輕柔吹打數(shù)次帮匾，轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備的離心管內(nèi)。用少量完全培養(yǎng)基洗滌凍存管1~2次痴鳄，一并收集至離心管內(nèi)瘟斜。

注意：此時(shí)細(xì)胞比較脆弱，細(xì)胞膜表面還未完全恢復(fù)痪寻，劇烈的吹打會(huì)造成細(xì)胞活率下降螺句。因此，需要以輕柔的方式稀釋細(xì)胞凍存懸液槽华。輕柔顛倒混勻壹蔓，充分稀釋凍存液，有條件可以靜置1分鐘猫态，使細(xì)胞恢復(fù)滲透壓，再進(jìn)行下一步操作披摄。

5. 250 g離心4 min亲雪。離心后去除上清。加入2 mL完全培養(yǎng)基疚膊，輕柔吹打細(xì)胞沉淀义辕，充分吹散、混勻寓盗。（如有臺(tái)盼藍(lán)可取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行染色計(jì)數(shù)）

6. 將細(xì)胞平均接種到1個(gè)T25培養(yǎng)瓶或底面積相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器中灌砖，加入足量完全培養(yǎng)基璧函，搖勻細(xì)胞，將培養(yǎng)容器放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)基显。

注意：添加培養(yǎng)液體積和胰酶添加量?jī)H供參考蘸吓，特殊細(xì)胞可適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

7. 復(fù)蘇次日撩幽，觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)液库继，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況窜醉。若細(xì)胞密度較高宪萄，及時(shí)傳代。

注意：貼壁/半貼壁細(xì)胞接種24 h內(nèi)不應(yīng)擾動(dòng)榨惰。部分細(xì)胞貼壁較慢拜英，復(fù)蘇后48 h不應(yīng)擾動(dòng)。

細(xì)胞復(fù)蘇的注意事項(xiàng)

1. 取凍存細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施琅催，戴好防凍手套聊记，護(hù)目鏡。如果凍存管密封不嚴(yán)恢暖，液氮可被吸入排监。由于解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸杰捂。

2. 細(xì)胞放入水浴中復(fù)蘇時(shí)注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時(shí)晃動(dòng)舆床，使其受熱均勻，且速度越快越好嫁佳，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力挨队，并防止水浴鍋的水進(jìn)入細(xì)胞凍存管造成細(xì)胞污染。

3. 打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏奢锿Ｗ⒁鉄o(wú)菌操作盛垦，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作在4℃冰盒中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性瓤漏。

4. 解凍時(shí)間在2min以內(nèi)完成腾夯，且整個(gè)過(guò)程盡量避免吹打細(xì)胞產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇后的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳蔬充。

5. 復(fù)蘇細(xì)胞的時(shí)候盡量避免凍存管接縫處沾水蝶俱，防止支原體污染，實(shí)驗(yàn)室定期用過(guò)氧化氫熏蒸饥漫，細(xì)胞小黑點(diǎn)增多時(shí)用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)榨呆，并且及時(shí)清除。

細(xì)胞復(fù)蘇的常見(jiàn)問(wèn)題

1.細(xì)胞復(fù)蘇后庸队，細(xì)胞數(shù)量很少

可能得原因：細(xì)胞凍存前活細(xì)胞少积蜻，狀態(tài)不佳闯割；細(xì)胞解凍速度過(guò)慢；細(xì)胞凍存懸液在常溫下時(shí)間太久竿拆；未充分稀釋凍存液宙拉；離心速度不恰當(dāng)。

解決辦法：

確保凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好如输，活細(xì)胞比例高鼓黔。

加快解凍速度，盡量減少在常溫下的放置時(shí)間不见。

確保凍存液充分稀釋澳化，避免對(duì)細(xì)胞造成損傷。

調(diào)整離心速度稳吮，找到最適合細(xì)胞的離心條件缎谷。

2. 細(xì)胞復(fù)蘇后，很多難以貼壁

解決辦法：

檢查緩凍快融操作是否規(guī)范灶似，避免操作不當(dāng)導(dǎo)致的損傷列林。

確認(rèn)凍存前細(xì)胞的密度和活率是否適宜。

控制好消化時(shí)間酪惭，避免過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁能力下降希痴。

3. 細(xì)胞貼壁了，卻長(zhǎng)不起來(lái)

解決辦法：

調(diào)整細(xì)胞密度春感，嘗試將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)器皿中砌创，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用。

給予細(xì)胞足夠的時(shí)間來(lái)適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境鲫懒，有些細(xì)胞復(fù)蘇后需要一段時(shí)間才能開始生長(zhǎng)嫩实。

確保凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好，避免凍存前細(xì)胞已處于凋亡狀態(tài)窥岩。

此外甲献，還需注意培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌操作，定期檢查培養(yǎng)基的成分和pH值颂翼，以及確保足夠的營(yíng)養(yǎng)供給和適宜的氣體環(huán)境（如CO?濃度）晃洒。在處理細(xì)胞時(shí)，溫和操作疚鲤，避免造成機(jī)械損傷锥累。