骨髓龕中不同細胞群體的關(guān)聯(lián)性及其分化軌跡

原創(chuàng)： 天涯清水 原文：單細胞天地

文章信息

文章利用單細胞轉(zhuǎn)錄組分析骨髓龕中不同細胞類群間的相關(guān)性及其分化軌跡中不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能禀梳。文章于2019年7月7日發(fā)表在Cell reports 雜志眠副，文章連接，DOI：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.06.031纹冤。文章標題是：Mapping Distinct Bone Marrow Niche Populations and Their Differentiation Paths。

摘要

骨髓微環(huán)境是由復(fù)雜表型和細胞成熟軌跡未知的異質(zhì)性的非造血細胞群體組成粗截。在這些非造血細胞群體中舆驶，間充質(zhì)細胞維持產(chǎn)生間質(zhì)細胞，骨細胞斯撮、脂肪細胞和軟骨細胞。闡明骨髓內(nèi)這些獨特的細胞亞群仍然具有挑戰(zhàn)性扶叉。本研究中勿锅，我們使用非造血骨髓細胞的單細胞RNA測序來定義特定的細胞亞群。此外枣氧，通過結(jié)合細胞狀態(tài)層次的計算預(yù)測和已知的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達溢十，我們繪制了針對骨細胞，軟骨細胞和脂肪細胞譜系的分化途徑达吞。 最后张弛，我們使用譜系特異性報告菌株和靶向敲除來驗證我們發(fā)現(xiàn)的基因。 我們的分析揭示了成熟基質(zhì)細胞的分化層次，確定了伴隨這些分化軌跡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子吞鸭，并增加了對骨髓微環(huán)境復(fù)雜性的理解寺董。

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樣品制備

使用scRNA-seq來分析正常8至16周齡C57BL/6小鼠的非造血細胞和非上皮細胞。用長骨的研磨和膠原酶 - 分散酶處理的組合制備單細胞懸浮液瞒大，然后分選活的CD45- Ter119-（非造血細胞）和CD31-（非內(nèi)皮細胞）細胞螃征。通過流式分選選取骨髓細胞樣品中的非造血搪桂、非表皮細胞透敌，選取CD45, Ter119和CD31陰性細胞。通過3'基于液滴的scRNA-seq（inDrops）分析分選的細胞（圖1A）踢械。

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測序數(shù)據(jù)介紹

采用 inDrops方法進行 單細胞測序酗电，稍加改進 。

建庫和測序：For the in vivo samples, two libraries (n = 1,533 cells total) were prepared for mouse 1 and three libraries (n = 3,574 cells total) were prepared for mouse 2.

For the three cultured samples, one library per sample was prepared (n = 2,837, n = 2,164, and n = 2,520 total cells, respectively).

NextSeq 500進行測序

數(shù)據(jù)分析情況

• 數(shù)據(jù)過濾：原始數(shù)據(jù)按照Zilionis et al., 2017描述的方法進行内列，生信分析流程inDrops.py除去低質(zhì)量的reads撵术。細胞過濾：

• 比對: Bowtie v.1.1.1 參考基因組是the Ensembl release 85 Mus musculus GRCm38 reference.

然后使用總計數(shù)標準化的變體對每個細胞的基因表達計數(shù)進行標準化靡挥，以避免來自非常高表達的基因的變形笙瑟。

• 細胞過濾：Each library was initially filtered to include only abundant barcodes (> 500 total counts for all in vivo libraries; > 800 counts for cultured sample 1; > 1,000 counts for cultured samples 2 and 3), based on visual inspection of the histograms of total transcript counts per cell barcode焦影。

• 基因過濾：Next, we excluded putatively stressed or dying cells with > 30% (in vivo samples) or > 20% (cultured samples) of their transcripts coming from mitochondrial genes.

  For the in vivo samples, we also used Scrublet(Wolock et al., 2019) to identify two clusters of cell doublets that co-expressed marker genes of distinct cell types. 142 putative doublets were excluded.

• 聚類和可視化：We repeated cell clustering and visualization using only the non-hematopoietic, non-endothelial clusters. Gene filtering, PCA, and kNN graph construction were performed as above, except only the top 25 principal components were used, and only seven spectral clusters were generated.

• 表達矩陣可以下載：GSE132151

主要分群情況

識別骨髓微環(huán)境中的細胞類群

小鼠重復(fù)樣品中的5,107個細胞（中值為1,651個分子和每個細胞1,085個基因）先朦，樣本間基因表達或細胞類型豐度沒有顯著差異劲绪。去除雙聯(lián)體盛撑，并除去造血細胞和內(nèi)皮細胞杜漠，我們使用剩余的2,847個細胞（每個細胞的1,394個分子的中位數(shù)和736個基因）進行下游分析腰湾。聚類分析顯示出7個聚類（P1-P7）并鑒定出每個聚類中富集的基因（圖1B）埃篓，我們使用基因集富集分析來表征來自每個細胞狀態(tài)的最重要的基因表達特征（圖1C）处坪。不同聚類的細胞群體表達與細胞粘附，細胞因子產(chǎn)生架专，HSC支持同窘，脂肪生成和骨化有關(guān)的基因。各個聚類中某些單細胞高表達的基因也可以預(yù)測該聚類的表達模式（圖1D）部脚。用SPRING可視化單細胞轉(zhuǎn)錄組想邦，揭示了形成兩個主要分支的連續(xù)細胞狀態(tài)（圖1E）。

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間質(zhì)細胞的異質(zhì)性

基于上述分析和先前的闡明的骨髓基質(zhì)細胞基因的表達模式委刘，我們細胞狀態(tài)標記分配給單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的每個聚類（圖1E和2A）丧没。這些骨髓基質(zhì)細胞包括多能間充質(zhì)干細胞，并且在單細胞數(shù)據(jù)集中最豐富的類群钱雷。脂肪細胞祖細胞（AdPs）和前脂肪細胞骂铁，成骨細胞/軟骨細胞祖細胞（OsPs），前成骨細胞 - 軟骨細胞（Pre-OCs）罩抗，成骨細胞和軟骨細胞拉庵。由于樣本制備過程中使用的膠原酶和分散處理及細胞分選會刺激轉(zhuǎn)錄因子表達改變 (van den Brink et al., 2017)。因此套蒂，選取與應(yīng)激特征無關(guān)的其他轉(zhuǎn)錄因子基因（例如钞支，Ccl2茫蛹，Ccl7，Nr4a3烁挟，Adipoq婴洼，Icam1）來識別脂肪細胞聚類（圖2B和S2A）。此外撼嗓，我們還描述了重要的骨髓龕調(diào)節(jié)因子（圖2C）柬采，轉(zhuǎn)錄因子和其他基因的表達，這些基因定位于不同的譜系（圖2D）且警。

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基質(zhì)和祖細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子軌跡

鑒定調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞類型分化的轉(zhuǎn)錄因子之前粉捻，我們首先推斷出這些細胞在分化時的基因表達軌跡。 MSCs被認為會產(chǎn)生骨骼斑芜，脂肪和軟骨肩刃，這得到了Velocyto (La Manno et al., 2018) 和我們數(shù)據(jù)的支持 (Figure 3A)。Velocyto將MSCs鑒定為我們數(shù)據(jù)集中最強的“來源”細胞狀態(tài)杏头，前脂肪細胞盈包，成骨細胞和軟骨細胞作為可能的最終狀態(tài)(Figure 3B)。然后我們使用群體平衡分析（PBA),來預(yù)測細胞的平均基因表達軌跡醇王。平均基因表達軌跡將MSCs與這些最終狀態(tài)區(qū)別開來 (Figure 3C) 和基于它們的表達模式的聚類基因沿著各自的分化軌跡(Figure 3D)呢燥。識別出成骨、軟骨和脂肪分化的轉(zhuǎn)錄因子厦画。

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使用細胞命運標記報告基因確證基質(zhì)細胞亞群

為了確證基于單細胞轉(zhuǎn)錄組分析識別的細胞類型和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子疮茄，采用熒光酶素的標記的小鼠間質(zhì)細胞進行實驗驗證。

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識別基質(zhì)細胞亞型及其潛在的細胞譜系

通過敲低實驗驗證成骨根暑、成軟骨和成脂分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的功能力试，揭示出轉(zhuǎn)錄因子在基質(zhì)細胞命運決定中的重要作用。

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臨床意義

本研究中排嫌，我們闡明了基質(zhì)細胞直接分化成成骨細胞畸裳，軟骨細胞，脂肪細胞的轉(zhuǎn)錄過程淳地。研究產(chǎn)生的scRNA-seq基因表達譜可以實時描述骨髓微環(huán)境中及其命運選擇相關(guān)的動態(tài)過程怖糊。這項研究的主要結(jié)果是詳細描述了骨髓間質(zhì)細胞的三種不同的分化路徑。我們確定了每條分化路徑的中間體細胞類群颇象，這些中間體細胞類群可以被前瞻性地選擇來測試其分化譜系的潛力伍伤。最后，我們發(fā)現(xiàn)這些群體與細胞命運標記的所顯示的譜系是一致的遣钳，并且它們預(yù)測的分化潛能在培養(yǎng)中被展現(xiàn)出來扰魂。

近年來，在穩(wěn)態(tài)和疾病期間表征基質(zhì)細胞群方面取得了重大進展，我們的研究為更好地理解調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境細胞分化的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)提供了一個廣泛的視角 (Hoggatt et al., 2016, Méndez-Ferrer et al., 2010, Mercier et al., 2011, Morrison and Scadden, 2014, Tikhonova et al., 2019, Baryawno et al., 2019)劝评〗阒保基質(zhì)細胞的失調(diào)與一些病理生理過程相關(guān)，如肥胖蒋畜、骨質(zhì)減少声畏、骨質(zhì)疏松、癌癥姻成、牙齒脫落和衰老(Engblom et al., 2017, Medyouf et al., 2014, Mendelson and Frenette, 2014, Raaijmakers et al., 2010, Zambetti et al., 2016) 插龄。因此，理解調(diào)節(jié)間質(zhì)細胞分化的機制可能導致對這些疾病的發(fā)病機理的進一步了解佣渴，并最終獲得新的治療方法辫狼。

我們的擬時分析結(jié)果以及轉(zhuǎn)錄驗證支持亞群之間的關(guān)系初斑，并允許我們探索基質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)錄層次辛润。雖然scRNA-seq工具不斷進步及其應(yīng)用的不斷擴展，轉(zhuǎn)錄組掃描并不能提供細胞狀態(tài)的完整視圖 (Cie?lik and Chinnaiyan, 2018, Kumar et al., 2017)见秤。因此砂竖，采用多模態(tài)分析有助于獲得更深入的理解，因為這些技術(shù)具有測量多種分子表型的能力鹃答。此外乎澄，理解MSCs命運決定的進展將需要使用炎癥和疾病模型以及基于我們初步發(fā)現(xiàn)的患者樣本進行更深入的研究。我們在這里展示了用命運圖和報告菌株驗證scrna-seq數(shù)據(jù)的重要性测摔。同樣的模型也可以在微擾過程中進一步研究特定轉(zhuǎn)錄因子在譜系承諾決策中的意義置济。

總之，本研究對骨髓微環(huán)境的細胞組成和向成骨細胞锋八、軟骨細胞和脂肪細胞脂肪的分化途徑的轉(zhuǎn)錄中間產(chǎn)物提供了重要的見解浙于。此外，盡管體內(nèi)和培養(yǎng)的基質(zhì)細胞之間存在顯著的差異挟纱，但體外分化實驗證明有助于分析轉(zhuǎn)錄因子與不同基質(zhì)命運的相關(guān)性羞酗。我們的數(shù)據(jù)集和分析將作為研究基質(zhì)細胞分化的未來研究的資源。
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