該文章發(fā)表在frontiers in Oncology雜志上的一篇文章，IF=4.137惹盼。頭頸癌（HNC）的免疫浸潤(rùn)與患者的預(yù)后密切相關(guān)庸汗，然而，之前的研究未能解釋免疫系統(tǒng)的多樣性細(xì)胞類型手报。本研究的目的是利用CIBERSORT方法揭示癌旁組織和腫瘤組織之間腫瘤微環(huán)境（TME）的免疫表型差異蚯舱，并探討其治療意義。
Patterns of Immune Infiltration in HNC and Their Clinical Implications: A Gene Expression-Based Study
HNC的免疫浸潤(rùn)模式及其臨床意義:一項(xiàng)基于基因表達(dá)的研究
方法步驟
數(shù)據(jù)來(lái)源與數(shù)據(jù)處理
從TCGA下載了HNC隊(duì)列的RNA-seq數(shù)據(jù)（FPKM值）枉昏，并使用Voom方法對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化陈肛。初步篩選后，該研究共納入了454例患者（11例正常和443例腫瘤凶掰，P<0.05）燥爷，其中包括41例癌旁組織和11例配對(duì)的腫瘤組織。
使用CIBERSOFT算法對(duì)TIIC****s（腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞）****進(jìn)行定量
CIBERSOFT是一種基于基因的反卷積算法懦窘，它能推斷出22種人類免疫細(xì)胞類型前翎，并使用547個(gè)標(biāo)記基因的特征來(lái)量化每種細(xì)胞類型的相對(duì)得分。為了增強(qiáng)結(jié)果的魯棒性畅涂，CIBERSOFT算法基于Monte Carlo（蒙特卡洛）采樣來(lái)獲得每個(gè)樣本的反卷積P值港华。
總T細(xì)胞被視作CD8+T細(xì)胞、CD4+記憶激活T細(xì)胞等細(xì)胞比例的總和午衰；總巨噬細(xì)胞的比例為M0立宜、M1和M2巨噬細(xì)胞比例之和；總B細(xì)胞的比例被估計(jì)為初始和記憶B 細(xì)胞比例之和臊岸。
生存分析
首先橙数，作者使用R包“survival”在LM22免疫細(xì)胞亞群和OS之間進(jìn)行了單變量Cox分析和Kaplan-Meier生存分析，篩選出22種可預(yù)測(cè)預(yù)后的人類免疫細(xì)胞表型帅戒。然后灯帮，使用多變量Cox回歸分析進(jìn)一步驗(yàn)證作為預(yù)后因素的22種免疫細(xì)胞表型。此外逻住，這項(xiàng)研究還探討了LM22免疫細(xì)胞與其他臨床信息（如TNM分期钟哥，分級(jí)）之間的關(guān)聯(lián)。
分子子類的識(shí)別
為了進(jìn)一步探索不同的TME細(xì)胞浸潤(rùn)模式瞎访，使用R包“CancerSubtypes”中的一致性聚類算法確定了簇?cái)?shù)量腻贰。為了揭示簇間TME細(xì)胞浸潤(rùn)模型的潛在差異，使用未配對(duì)的t檢驗(yàn)識(shí)別了差異表達(dá)基因（DEGs）和不同的免疫細(xì)胞類型（|log2 fold change|≥0.2扒秸，p<0.05）播演。
功能和通路富集分析
為了揭示TME亞型中DEGs的潛在生物學(xué)意義，作者使用R包“ClusterProfiler”進(jìn)行了GO和KEGG富集分析（FDR<0.05）伴奥。另外宾巍，從MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因集（c2 curated signatures），進(jìn)行了基因集變異分析（GSVA）渔伯。
結(jié)果展示
TME在HNC中的分布及其亞型的臨床病理特征
通過(guò)CIBERSOFT算法系統(tǒng)地評(píng)估了TME細(xì)胞浸潤(rùn)模型和特征基因的圖譜顶霞。圖1展示了41個(gè)配對(duì)的腫瘤樣本和11個(gè)配對(duì)的癌旁樣本，顯然，在HNC中TME細(xì)胞的比例在組內(nèi)和組間存在顯著差異选浑。HNC癌旁組織總T細(xì)胞和總B細(xì)胞的比例高于腫瘤組織蓝厌，總巨噬細(xì)胞主要分布于癌旁組織（圖2）。此外古徒，正常和腫瘤組之間拓提，濾泡輔助T細(xì)胞，初始B細(xì)胞等發(fā)生顯著改變隧膘，而記憶B細(xì)胞代态，漿細(xì)胞等沒有明顯改變（圖3）。
圖1
圖2
圖3
從圖4可以看出在HNC配對(duì)的癌旁樣本中LM22免疫細(xì)胞之間呈現(xiàn)多個(gè)高度正關(guān)疹吃，而在腫瘤樣本中蹦疑，這種相關(guān)關(guān)系有所減少。因此可推斷出TME細(xì)胞浸潤(rùn)程度的改變直接反映了兩組之間的免疫差異萨驶。
圖4
就臨床特征而言歉摧，在HNC HPV陽(yáng)性組織中，CD8+T細(xì)胞腔呜，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的比例高于HNC HPV陰性組織叁温；在HNC HPV陰性樣本中，M2型巨噬細(xì)胞核畴、中性粒細(xì)胞等的比例更高（圖5）膝但。因此，這些結(jié)果表明異常的免疫浸潤(rùn)及其在HNC中的異質(zhì)性這些調(diào)控過(guò)程可能在腫瘤的發(fā)展中起重要作用谤草，也具有重要的臨床意義跟束。
圖5
識(shí)別預(yù)后的LM22免疫細(xì)胞亞型
作者進(jìn)行了單變量Cox回歸來(lái)篩選所有腫瘤樣本中的預(yù)后性LM22免疫細(xì)胞亞群，結(jié)果顯示總共有6個(gè)免疫細(xì)胞亞群（嗜酸性粒細(xì)胞咖刃、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等）與OS顯著相關(guān)（p<0.05，圖6A）憾筏。然后嚎杨，對(duì)上述免疫細(xì)胞亞群繪制了Kaplan-Meier曲線圖并進(jìn)行了對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞氧腰、活化的肥大細(xì)胞枫浙、初始B細(xì)胞和濾泡輔助T細(xì)胞與HNC患者的OS密切相關(guān)（圖7）。
圖6A
圖7
接下來(lái)古拴，多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析進(jìn)一步確定了預(yù)后的LM22免疫細(xì)胞亞群箩帚。結(jié)果表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）與改善的預(yù)后相關(guān)（圖6B）黄痪。使用ROC曲線評(píng)估LM22免疫細(xì)胞亞群的預(yù)后能力紧帕，其AUC如圖8所示，相比于其他LM22免疫細(xì)胞亞群（AUC>0.05），濾泡輔助T細(xì)胞在HNC患者的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中表現(xiàn)的效能最優(yōu)是嗜。
圖6B
圖8
隨后愈案，通過(guò)臨床特征與LM22免疫細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性來(lái)確定其相互關(guān)系。經(jīng)分析鹅搪，吸煙站绪，TNM分期等臨床協(xié)變量與LM22免疫細(xì)胞亞群沒有顯著相關(guān)性（圖9）。在這些臨床變量中丽柿，放射線恢准，分級(jí)和HPV狀態(tài)與免疫細(xì)胞亞群顯著相關(guān)（圖10）。
圖9
圖10
分子HNC子類中的免疫細(xì)胞模式
為了揭示TME在HNC中不同的免疫細(xì)胞群浸潤(rùn)情況甫题，對(duì)所有腫瘤樣本進(jìn)行無(wú)監(jiān)督一致性聚類來(lái)確定HNC的分子分類馁筐，通過(guò)K值來(lái)確定簇的最優(yōu)數(shù)量。在評(píng)估了累積分布函數(shù)（CDF）曲線和一致性熱圖下面積的相對(duì)變化之后幔睬，作者選擇了三個(gè)簇（K = 3）作為結(jié)果（圖11）眯漩。此外，在圖12中可以看出麻顶，簇與不同的生存模式相關(guān)赦抖。與簇I和簇III相比，簇II中的患者預(yù)后更好（P <0.001辅肾，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）队萤。
圖11
圖12
每個(gè)HNC****子組****中基因/LM22免疫細(xì)胞組分的差異表達(dá)分析
Kruskal-Wallis檢驗(yàn)用于識(shí)別與每個(gè)簇顯著相關(guān)的定量基因/LM22免疫細(xì)胞，這是根據(jù)LM22免疫細(xì)胞在三個(gè)簇中的比例決定的（圖13）矫钓。
然后要尔，為了尋找HNC分子亞型與衍生亞型特異性生物標(biāo)志物之間的分子差異，未配對(duì)的t檢驗(yàn)用于識(shí)別與每種亞型顯著相關(guān)的定量基因新娜。3個(gè)簇之間的兩兩比較赵辕，每個(gè)簇都能檢測(cè)到相應(yīng)的差異表達(dá)mRNA（圖14）。
圖13
圖14
分子亞型的識(shí)別
3個(gè)HNC簇的富集分析表明概龄，最顯著的GO terms包括細(xì)胞因子活性还惠、免疫/炎癥反應(yīng)和趨化因子活性。此外私杜，KEGG分析產(chǎn)生的所有通路均與免疫反應(yīng)相關(guān)（圖15）蚕键。
使用R包“GSVA”對(duì)三個(gè)簇的基因集變異進(jìn)行分析，從簇1到簇3所富集的通路數(shù)量逐漸增加衰粹。從圖16可以觀察到幾個(gè)標(biāo)志性的基因集锣光，包括“TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB”和“APICAL_JUNCTION”等。
圖15
圖16
