今天給大家介紹一篇在2020年六月發(fā)表于cell上的一篇關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的文章随夸，Interrogation of the Microenviromental Landscape in Brain Tumors Reveals Disease-Specific Alterations of Immune Cells被啼。

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In Brief：

這篇文章利用高緯度贪嫂，多組學(xué)的方法描述了腦瘤的腫瘤微環(huán)境耐版，包括腦膠質(zhì)瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤的比較祠够。 研究結(jié)果顯示：腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的類型依賴于腫瘤的起源，以及IDH這個基因的狀態(tài)粪牲。

Highlights：

1 流式，RNA seq, 蛋白質(zhì)以及成像分析揭示了腦部的腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜。
2 腦膠質(zhì)瘤的IDH突變狀態(tài)以及腦轉(zhuǎn)移的原發(fā)腫瘤共同塑造了腦部的腫瘤微環(huán)境缀磕。
3 小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出多方面的激活
4 腫瘤微環(huán)境細(xì)胞顯示出疾病和細(xì)胞類型特異的表達(dá)模式。

Abstract

腦的腫瘤包含有原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶穿香，包括低級和高級腦膠質(zhì)瘤和來自其他顱外器官的腦部的轉(zhuǎn)移。 目前人們對于腦部腫瘤微環(huán)境的理解還是十分有限绎速，并且不知道原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤對TME是否有不同的影響皮获。于是，在這篇文章中纹冤，他們通過流式細(xì)胞儀魔市，RNA測序，蛋白質(zhì)組學(xué)赵哲，培養(yǎng)和空間組織 去分析了腦部的腫瘤微環(huán)境待德。 此項(xiàng)研究揭示了免疫細(xì)胞的疾病特異性富集，在組織駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞枫夺、浸潤的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞将宪、中性粒細(xì)胞和 T 細(xì)胞的比例豐度方面存在顯著差異。這些綜合分析還揭示了腦惡性腫瘤中的多方面免疫細(xì)胞激活橡庞，揭示了腦惡性腫瘤具有保守的轉(zhuǎn)錄組軌跡的同時(shí)较坛，也有疾病或者細(xì)胞類型特異的程序。 考慮到大家對發(fā)展腦癌腫瘤微環(huán)境靶向治療的興趣扒最，本研究對于腦癌的免疫治療提供了理論基礎(chǔ)丑勤。

Introduction

腦惡性腫瘤包括腦內(nèi)出現(xiàn)的腫瘤，例如低級別膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤吧趣，以及源自顱外原發(fā)性腫瘤的腦轉(zhuǎn)移瘤（BrMs）：顱外原發(fā)性腫瘤：包括黑色素瘤法竞、乳腺癌和肺癌。代謝酶異檸檬酸脫氫酶 1 和 2 ( IDH mut) 的膠質(zhì)瘤突變體通常是低級別 (II 或 III) 并且比IDH野生型 (WT) 腫瘤具有明顯更好的預(yù)后强挫，后者通常是 IV 級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤岔霸。盡管標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理治療包括手術(shù)后放療和替莫唑胺，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存率仍然很低俯渤。BrM 診斷后的患者存活率可能更低呆细，通常以月為單位衡量，并且在所有成人腦腫瘤中八匠，BrMs 的發(fā)病率明顯超過膠質(zhì)瘤絮爷。

鑒于目前這些患者的治療選擇有限，需要解決的一個關(guān)鍵問題是梨树，深入全面了解原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥如何在腦腫瘤微環(huán)境 (TME) 中發(fā)展是否可以揭示治療干預(yù)的有希望的新靶點(diǎn)坑夯。盡管多種 TME 細(xì)胞類型可以在廣泛的顱外腫瘤中嚴(yán)格調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展和對治療的反應(yīng)。鑒于其獨(dú)特的細(xì)胞類型劝萤，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞渊涝、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞 (MG)，我們不能簡單地將這些癌癥的發(fā)現(xiàn)外推到單一的腦 TME；該器官的免疫抑制環(huán)境跨释；以及細(xì)胞和藥物通過血腦屏障 (BBB) 所面臨的挑戰(zhàn)胸私。
免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB)、過繼細(xì)胞療法和疫苗代表了針對 TME 內(nèi)和全身性免疫細(xì)胞的治療方法鳖谈。免疫療法在某些顱外癌癥中的成功為它們在腦惡性腫瘤中的評估提供了明確的動機(jī)岁疼。然而，盡管它們在部分 BrM 患者中顯示出一些臨床療效缆娃。

迄今為止捷绒，ICB 僅對孤立的原發(fā)性膠質(zhì)瘤病例產(chǎn)生了反應(yīng)。除了腫瘤細(xì)胞內(nèi)在效應(yīng)之外贯要，這可能部分歸因于腦 TME 的免疫抑制成分暖侨，包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM)，它們已成為腦癌的主要參與者崇渗。在小鼠中進(jìn)行的譜系追蹤實(shí)驗(yàn)表明字逗，腦 TAM 可以來源于組織駐留的 巨噬細(xì)胞（MG） 或從外周循環(huán)募集的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞 (MDM)。TAM 是高度可塑性的細(xì)胞宅广，整合了來自細(xì)胞因子葫掉、生長因子和其他刺激的輸入，導(dǎo)致不同的激活狀態(tài)和細(xì)胞表型跟狱，包括促進(jìn)侵襲俭厚、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫抑制驶臊。這種可塑性及其在惡性細(xì)胞和腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞之間的關(guān)系使 TAM 成為不同癌癥中 TME 導(dǎo)向療法的有希望的靶點(diǎn)挪挤。事實(shí)上，對小鼠的研究表明资铡，TAMs 的表型改變導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤功效电禀，而 TAM 耗盡會阻止 BrM 生長。

盡管有這些臨床前研究笤休，但兩種個體遺傳學(xué)上不同的 TAM 細(xì)胞類型在人腦惡性腫瘤中的確切貢獻(xiàn)尚不清楚，這阻礙了臨床轉(zhuǎn)化症副。例如店雅，先前關(guān)于 TAM 在患者腦腫瘤中的作用的研究并未基于譜系追蹤衍生標(biāo)記的使用區(qū)分 MG 和 MDM≌晗常或僅關(guān)注神經(jīng)膠質(zhì)瘤闹啦。因此，我們研究了膠質(zhì)瘤和 BrM 中的 TME 辕坝，重點(diǎn)是探索 TAM窍奋，同時(shí)還研究了它們與 TME 中其他免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的關(guān)系。我們利用這種多模式資源來解決許多問題。大腦內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤形成的 TME 與從顱外部位轉(zhuǎn)移的癌癥是否不同琳袄？IDH突變狀態(tài)會影響 TME 嗎江场？不同的 TME 成分如何潛在地調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活狀態(tài)？通過整合這些問題的答案窖逗，我們提供了關(guān)于利用大腦 TME 對抗這些致命疾病的潛在策略的見解址否。

Tumor Origin and IDH Mutational Status Influence the Immune Composition of Brain Malignancies

腫瘤起源和IDH突變狀態(tài)影響腦惡性腫瘤的免疫成分

我們首先通過全組織切片的免疫熒光 (IF) 染色和非腫瘤腦組織IDH* mut 低級別的流式細(xì)胞術(shù) (FCM) 分析分析泛白細(xì)胞標(biāo)記 CD45，確定腦 TME 中廣泛的免疫細(xì)胞豐度和IDH WT 高級別膠質(zhì)瘤碎紊，以及源自不同原發(fā)性的 BrM佑附，包括乳腺癌、肺癌和黑色素瘤（圖1A仗考、1B和S1A）音同。這表明癌癥樣本中的白細(xì)胞豐度約為 20%–40%。將 CD45 ⁺細(xì)胞分層為髓系和淋巴系顯示IDH mut 和IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的髓系細(xì)胞顯著增加秃嗜，而在BrM原發(fā)腫瘤 與非腫瘤組織相比沒有相差太多（圖 1 B权均；p < 0.05，單側(cè)學(xué)生 t 檢驗(yàn)）痪寻。我們使用多色熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 分析了 100 個臨床樣本中的 14 個主要免疫細(xì)胞群（圖 S1 A螺句；表 S1和S2），并收集了來自 48 名患者的細(xì)胞用于 RNA 測序（RNA-seq）（表 S3橡类；完整的臨床注釋）

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在其他主要腦 TME 成分背景下的全局表達(dá)分析中，CD49D^低和 CD49D^高TAM 群體緊密聚集居凶，表明廣泛的轉(zhuǎn)錄組相似性虫给。因此，我們通過分析先前從譜系追蹤研究中確定的 MG 和 MDM 特異性個體發(fā)育核心基因組的關(guān)聯(lián)侠碧，進(jìn)一步詢問 CD49D 區(qū)分 TAM 種群的效用抹估，在從非惡性和腦癌組織中分選出來的人類 CD49D^低和 CD49D^高細(xì)胞中。這揭示了相應(yīng)細(xì)胞類型中個體發(fā)育核心基因集的富集（圖1C）弄兜，證明了我們能夠準(zhǔn)確區(qū)分人類樣本中不同疾病實(shí)體的 MG 和 MDM药蜻。有趣的是，這些核心特征在某些腫瘤類型中受到影響替饿，T-MDM 在IDH mut 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯示出增加的 MG 核心基因組信號语泽，而 T-MG 在 BrM 中獲得 MDM 特征，表明這些細(xì)胞的組織依賴性轉(zhuǎn)錄編程视卢，進(jìn)一步下面審問踱卵。

接下來，我們使用聚類分析評估了腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞群的分布情況（圖 S1 A据过；表 S2）惋砂，以確定細(xì)胞豐度的模式（圖 1 D；獨(dú)立性卡方檢驗(yàn)绳锅，p < 0.0001）西饵。這揭示了三個主要集群：（1）非腫瘤樣本和IDH mut 膠質(zhì)瘤，其特征是 MG 占優(yōu)勢鳞芙，其他免疫細(xì)胞數(shù)量較少眷柔；(2) IDH WT 膠質(zhì)瘤和幾個 BrMs 涌入 MDMs，在一定程度上原朝，中性粒細(xì)胞進(jìn)入腫瘤闯割，但主要排除淋巴細(xì)胞；(3) 主要是 BrM 和少數(shù)IDHWT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出最多樣化的免疫細(xì)胞景觀竿拆，T 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量浸潤。某些腫瘤含有 CD14^低/CD16 ⁺非經(jīng)典單核細(xì)胞宾尚、CD14 ⁺ /CD16 ⁺中間單核細(xì)胞丙笋、CD16 ^-粒細(xì)胞谢澈、樹突狀細(xì)胞 (DC) 或未成熟的骨髓細(xì)胞。在所有樣本中御板，淋巴細(xì)胞室主要由 T 細(xì)胞組成锥忿，自然殺傷 (NK) 細(xì)胞和 B 細(xì)胞較少。

所有被調(diào)查群體的相對豐度的主成分分析 (PCA) 證實(shí)怠肋，MG敬鬓、MDM、中性粒細(xì)胞以及 CD4 ⁺和 CD8 ⁺ T 細(xì)胞是大腦 TME 格局的主要免疫細(xì)胞決定因素（圖 1 E）笙各。主成分 1 (PC1) 將非腫瘤組織和IDH mut 膠質(zhì)瘤與IDH WT 膠質(zhì)瘤和 BrM 區(qū)分開來钉答，而 PC2 區(qū)分IDH WT 膠質(zhì)瘤和 BrM。對膠質(zhì)瘤中IDH狀態(tài)和 BrM 中的原發(fā)腫瘤部位進(jìn)行分層的進(jìn)一步分析證實(shí)杈抢，BrM 中淋巴細(xì)胞的比例明顯更高（圖 1 F数尿；平均_{淋巴細(xì)胞 %CD45} ⁺ = 46.23%，SEM = 4.15惶楼，t 檢驗(yàn)右蹦，p < 0.0001）。黑色素瘤 BrM 表現(xiàn)出最豐富的淋巴細(xì)胞浸潤歼捐，具有相當(dāng)大的 CD8 ⁺ T 細(xì)胞分?jǐn)?shù)（平均_CD8 ⁺ _%CD45 ⁺ = 33.01%何陆，SEM = 5.82，單向方差分析豹储，p < 0.01）贷盲。在某些 BrM 中檢測到調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs)（平均_{Treg %CD45} ⁺ = 1.2%，SEM = 0.36）颂翼，但在膠質(zhì)瘤中很少見（平均_{Treg %CD45} ⁺ = 0.25 %晃洒，SEM = 0.05，t 檢驗(yàn)朦乏，p < 0.05 ）球及。

由于 T-MG 和 T-MDM 在腦惡性腫瘤的骨髓腔中的突出地位，我們使用 IF 染色和反卷積分析來獨(dú)立驗(yàn)證它們的存在呻疹。常用的 MG 標(biāo)記吃引，如P2RY12、TMEM119和SALL1刽锤，以及 MDM 相關(guān)基因镊尺，如AHR和VDR，在不同腦惡性腫瘤中顯示出不同的 RNA 表達(dá)水平并思，同時(shí)以類似的方式保持其細(xì)胞類型特異性（圖 S2 A）正如對個體發(fā)育核心基因組所觀察到的那樣（圖1C ）庐氮。在蛋白質(zhì)水平上觀察到了相同的模式（圖 S2B)，其中 P2RY12 在非腫瘤組織中表達(dá)最高宋彼，CD68 在 BrM-TAM 群體中最豐富弄砍。這需要使用由 CD49D 補(bǔ)充的兩種標(biāo)記仙畦，以在 IF 分析中可靠地識別 MG 和 MDM（圖 S2 C）。我們使用這種策略通過全切片量化來詢問一組非腫瘤音婶、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和 BrM 樣本慨畸，確認(rèn)IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤和 BrM 中的 MDM 積累（圖2A -2C）。此外衣式，對來自相同個體樣本的 IF 和 FCM 獨(dú)立處理的組織進(jìn)行比較顯示出顯著的一致性（圖 S2 D）寸士。
我們在分選的細(xì)胞群中查詢 T-MG 和 T-MDM 特異性差異表達(dá)基因 (DEG)，將這兩個群與最豐富的其他細(xì)胞類型分開碴卧；即弱卡，CD45 ^-細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和 T 細(xì)胞（圖 S2 E）螟深。在 T-MG 中高度表達(dá)的幾個基因是公認(rèn)的 MG 標(biāo)記（P2RY12谐宙、TMEM119和TAL1），而在 T-MDM 中高度表達(dá)的基因包括替代巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記（FCGR2B和CLEC10A）和 DC 樣表型（CD1C界弧、CD1B和CD207）具有增強(qiáng)的吞噬和抗原交叉呈遞能力（CD209 )凡蜻。這些基因集還允許我們利用公開可用的集成數(shù)據(jù)集包含來自基因型組織表達(dá)項(xiàng)目 (GTEx;) 的健康皮質(zhì)腦組織的大量表達(dá)數(shù)據(jù)。 以及來自癌癥基因組圖譜 (TCGA);在大量組織轉(zhuǎn)錄組去卷積方法中垢箕。在該外部數(shù)據(jù)集（n = 711 個樣本）中獲得的 MG 和 MDM 比例估計(jì)值證實(shí)了IDH mut 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中 MG 的患病率和IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的 MDM 富集（圖2D）划栓。

MG and MDMs Exhibit a Multifaceted Polarization Phenotype in Brain Malignancies

MG 和 MDM 在腦惡性腫瘤中表現(xiàn)出多方面的極化表型

我們接下來使用 PCA 專門關(guān)注 TAM 并分析其表達(dá)受組織類型（即參考 MDM、非腫瘤腦条获、膠質(zhì)瘤和 BrM）和細(xì)胞類型（即 MG 和 MDM）影響的基因（圖 3A） . 在前兩臺 PC 中忠荞，MG 和 MDM 投射到不同的空間，體外分化的 MDM 與組織來源的樣本不同帅掘。我們觀察到 PC1 的梯度委煤，一端為非腫瘤腦組織，穿過IDH mut 和IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤修档，并以 BrMs 結(jié)束碧绞。因此，TAM 轉(zhuǎn)錄組變化受大腦 TME 本身以及特定類型的惡性腫瘤的影響吱窝。

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我們還使用一組標(biāo)記基因評估了 T-MG 和 T-MDM 的 M1 和 M2 極化狀態(tài)港准。然而浅缸，在膠質(zhì)瘤或 BrM T-MG 或 T-MDM 中沒有出現(xiàn)明確的 M1 與 M2 表型的明顯模式（圖 S3 D）。為了進(jìn)一步探索 T-MG 和 T-MDM 的激活狀態(tài)，我們將它們各自上調(diào)的基因置于巨噬細(xì)胞刺激特異性程序的 ORA 中阁将。這揭示了包含典型 M1（干擾素 γ [IFNγ]）和 M2 極化（白細(xì)胞介素 4 [IL-4]）的多方面反應(yīng)（圖 3 C）狸演，包括與慢性炎癥刺激相關(guān)的表達(dá)變化（腫瘤壞死因子 α [TNF- ?] + 前列腺素 E [PGE ₂ ] 和 TNF? + PGE ₂ + Pam3CysSerLys4 [TPP]）和接觸游離脂肪酸（油酸 [OA] 和棕櫚酸 [PA]），這與調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞功能有關(guān)婿斥。這表明 T-MG 和 T-MDMs 在膠質(zhì)瘤和 BrMs 中的不同轉(zhuǎn)錄編程超出了簡單的 M1 與 M2 極化娇妓。

為了了解哪些過程與這些反應(yīng)相關(guān)并可能驅(qū)動這些反應(yīng)，我們確定了基因集富集分析（GSEA) 膠質(zhì)瘤和 BrM 中的 T-MG 和 T-MDM 中的前沿基因，并將它們聚集成具有非負(fù)矩陣分解的前沿元基因 (LEM) 荠医。這確定了每種細(xì)胞類型多達(dá) 5 個不同的 LEM，并進(jìn)行了比較，它們以成對的方式進(jìn)行了顯著重疊測試（圖 S3 E）缕棵，并使用基因本體論（GO）術(shù)語進(jìn)行了注釋（圖3D）。與有絲分裂和細(xì)胞增殖相關(guān)的 LEM 存在于膠質(zhì)瘤和 BrM 的 T-MG 和 T-MDM 中（圖 3 D，第 1 組）触趴。這些 LEM 的生物學(xué)有效性通過在非腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和 BrM 組織切片中染色 Ki-67（一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物）來驗(yàn)證（圖 3 E）披蕉，顯示 T-MG 和 T-MDM 中的增殖增加IDH WT 膠質(zhì)瘤和 BrM 以及IDH mut 膠質(zhì)瘤中的 T-MG。

有趣的是，在膠質(zhì)瘤和 BrM T-MDM 和 BrM T-MG 中檢測到富含 I 型 IFN 信號傳導(dǎo)的 LEM娜搂，但在膠質(zhì)瘤 T-MG 中未檢測到（圖3D秘豹，第 2 組）。持續(xù)的 I 型 IFN 信號傳導(dǎo)與介導(dǎo)免疫抑制和 ICB 抗性有關(guān)。這些第 2 組 LEM 的嚴(yán)格性通過建立共享 LEM 基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)得到驗(yàn)證（圖 S3 F）疲扎。除了它們在抗病毒反應(yīng)中的作用之外，PPI 網(wǎng)絡(luò)中心突出顯示的基因（圖 S3 F，紅色節(jié)點(diǎn)）還涉及多種腫瘤促進(jìn)和抑制作用棒假。類似地，更多的外圍網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)IL15和TNFSF10可能分別能夠調(diào)節(jié)有效的免疫抗腫瘤反應(yīng)或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。我們詢問這些基因是否直接由腦 TME 中的分泌因子誘導(dǎo)鹰贵，并建立了基于細(xì)胞的試驗(yàn)，以將 MDM 暴露于由新鮮分離的神經(jīng)膠質(zhì)瘤或培養(yǎng)中的 BrM 樣本的單細(xì)胞懸浮液產(chǎn)生的 TME 條件培養(yǎng)基 (CM)。分析的所有基因都被 BrM-TME-CM 上調(diào)阻荒，神經(jīng)膠質(zhì)瘤 TME-CM 在較小程度上上調(diào)（圖 3 F）粱侣。我們還在 BrM-MG、膠質(zhì)瘤 MDM 和 BrM-MDM 中檢測到炎癥和核因子 κB (NFκB) 信號相關(guān) LEM 的誘導(dǎo)（圖 3D情妖，第 3 組）情竹。指向 Th17 反應(yīng)（第 4 組）和免疫細(xì)胞募集以及不同免疫細(xì)胞區(qū)室之間相互作用的 LEM 僅在 MDM（第 5 組）中檢測到。總的來說苔货，這些分析揭示了 MG 和 MDM 在整合到腦惡性腫瘤 TME 后獲得了多方面的激活狀態(tài)姻灶。

IDH Mutation Status Associated with Changes in Glioma TAM Activation

IDH突變狀態(tài)與膠質(zhì)瘤 TAM 激活變化相關(guān)

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我們比較了來自IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 T-MG 和 T-MDM 與來自IDH mut 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 T-MG叛拷，因?yàn)樗鼈兎謩e構(gòu)成這些腫瘤中最豐富的 TME 細(xì)胞類型（圖 1 F 和2 C；表 S5）震庭。這揭示了 T-MG 中的 489 個 DEG（圖 4 E瑰抵；表 S5；406 個上調(diào)和 83 個下調(diào)）器联，以及 T-MDM 中的 1,478 個（圖 4 F二汛；表 S5婿崭；903 個上調(diào)和 575 個下調(diào)）。盡管這些基因列表是通過比較來自IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 T-MDM 與來自IDH mut 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 T-MG 生成的肴颊，但它們類似地將IDH mut 中的 T-MDM 與聚類分析中的IDH WT 疾裁フ弧（圖 4 F）表明它們確實(shí)反映了基于腫瘤IDH狀態(tài)的 T-MDM 改變。421 個基因在兩種 TAM 細(xì)胞類型中表現(xiàn)出相似的模式（343 個上調(diào)和 78 個下調(diào)）婿着，表明 T-MG 和 T-MDM 在IDH WT 腫瘤中也可以獲得共同的轉(zhuǎn)錄模式授瘦。共享基因中有幾種編碼細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 蛋白（圖 4 G、FN1 和VCAN）和 ECM 相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞蛋白（THBS1竟宋、TGFBI提完、LGALS3和ANGPTL4) 調(diào)節(jié) ECM 隔離配體的可用性、血管生成和腫瘤免疫丘侠。這表明 TAM 有助于塑造IDH WT 腫瘤中 ECM 蛋白的組成和效應(yīng)功能徒欣。我們還發(fā)現(xiàn)了抗炎分子ANXA1和GPNMB（圖 4 G），它們以前與促腫瘤巨噬細(xì)胞極化和抑制 T 細(xì)胞活化有關(guān)蜗字，在 T-MG 和 T-MDM 中上調(diào)打肝。

我們接下來研究了IDH WT 腫瘤 CD45 ^-群體中的炎癥介質(zhì)及其在 TAM 中的相應(yīng)受體。與IDH mut CD45 ^- 細(xì)胞相比TGFB2表達(dá)升高秽澳，并且輔助轉(zhuǎn)化生長因子 β (TGF-β) 受體ENG在IDH* WT TAM 中高度表達(dá)（圖4H）闯睹。TGFB2 在傷口愈合過程中的炎癥和組織重塑中具有多效性，并且與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的自分泌信號環(huán)路有關(guān)担神。神經(jīng)炎癥細(xì)胞因子MDK可將 TAM 極化調(diào)節(jié)為膠質(zhì)瘤中的 M2 樣表型楼吃，在來自IDH* WT 腫瘤的 CD45 ^-細(xì)胞中上調(diào)，其受體SDC4和ITGA4/CD49D在 T-MDM 與 T-MG 中差異表達(dá)（圖 4 H）妄讯，表明這種推斷的信號循環(huán)的細(xì)胞類型特異性效應(yīng)孩锡。

我們詢問從IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的 T-MDM 特異性基因集是否與患者的生存差異相關(guān)。通過邏輯回歸亥贸，我們從腦惡性腫瘤中 TAM 中上調(diào)的基因總數(shù)（圖3B）中得出了由 36 個基因組成的代表性特征（圖 S4 D ）躬窜。這包括巨噬細(xì)胞標(biāo)記RUNX3；非典型趨化因子受體ACKR3炕置，可調(diào)節(jié) CXCL12-CXCR4 信號荣挨；內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 應(yīng)激蛋白HERPUD1和抑制性 Fc 受體FCGR2B，它們可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化朴摊。; 以及影響血管生成和巨噬細(xì)胞極化的細(xì)胞因子IL19默垄。該簽名用于在低級別和高級別膠質(zhì)瘤的合并 TCGA 數(shù)據(jù)集中對患者進(jìn)行分類（圖 4 I 和S4 E）。在IDH mut 患者中甚纲，中位總生存期的降低與 T-MDM IDH WT 特征的富集有關(guān)口锭，而富集評分低的IDH WT 患者的生存期增加。這在多變量 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型中得到證實(shí)介杆，該模型包括轉(zhuǎn)錄組神經(jīng)膠質(zhì)瘤亞型（如 TCGA 數(shù)據(jù)集中注釋）和IDH狀態(tài)（圖 4J)鹃操。為了驗(yàn)證這種效應(yīng)不僅僅反映了 T-MDM 數(shù)量的變化韭寸，我們根據(jù)用于去卷積的 T-MDM 特異性基因集的富集對 TCGA 隊(duì)列進(jìn)行了分類遇革，這對存活率的影響很邪本唷（圖 S4 F）。

鑒于迄今為止在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中 PD1 或 PDL1 ICB 試驗(yàn)的結(jié)果令人失望铣焊，我們質(zhì)疑豐富的 T-MG 和 T-MDM 是否會導(dǎo)致有限的治療效果臭胜。我們對一組 20 個基因組進(jìn)行了 ORA莫其，這些基因組先前與先天性抗 PD1 抗性（IPRES；在IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 TAM DEGs 中耸三，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)大的部分在 T-MG 和 T-MDMs 中上調(diào)（圖 S4 G）乱陡。然后，我們通過 GSVA 在單樣本水平上包括 CD45 ^-群體和詢問的 IPRES 基因集富集（圖 S4 H）仪壮。這產(chǎn)生了不同程度的腫瘤細(xì)胞和 TAM 富含 IPRES 基因集的多樣化圖像憨颠。因此，來自IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的TAM 和 CD45 ^-細(xì)胞可能有助于介導(dǎo)先天 ICB 抗性积锅。

The Immune Contexture Influences the TME on a Global Level

免疫環(huán)境在全局范圍內(nèi)影響 TME

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Myeloid Cells Show a Distinct Phenotype in BrMs

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Myeloid Cells Show a Distinct Phenotype in BrMs

髓系細(xì)胞在 BrM 中表現(xiàn)出不同的表型

我們將膠質(zhì)瘤中 TAMs 的表達(dá)模式（無論IDH狀態(tài)如何）與 BrMs 并列的全球分析顯示了疾病和細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄組變化。因此黑毅，我們通過關(guān)注僅與相應(yīng)參考和IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的基因上調(diào)來探索 BrM 特異性改變（圖 S6 A 和 S6B；表 S6）钦讳。各種細(xì)胞因子矿瘦、趨化因子和促炎分子在 BrM-MG 和 BrM-MDM 中升高（圖 6A），包括自身免疫性神經(jīng)炎癥的強(qiáng)效介質(zhì)CSF2和IL23A（圖 6A）和模式識別受體MARCO愿卒。有趣的是缚去，顱外腫瘤中抗體介導(dǎo)的 MARCO 靶向增加了 TAM 的 M1 樣極化并增強(qiáng)了 ICB 療效。這些效應(yīng)依賴于抗體與FCGR2B的相互作用琼开，這也是 T-MDM IDH WT 特征的一部分（圖 S2 E 和S4 C）易结。最后，RETN柜候，它與全身炎癥性疾病有關(guān)搞动，在 BrM-TAM 中上調(diào)

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GSEA 確定了額外的細(xì)胞類型特異性富集模式。BrM-MG 顯示出 IL-6 通路活性的證據(jù)（圖 S6 C）股冗，并且在 BrM-MDM 中霹陡，“Naba 核心基質(zhì)體”基因組顯著富集（圖 S6 D）。這促使我們評估了 BrM-MDM 與 BrM-MG 中編碼 ECM 和基質(zhì)細(xì)胞蛋白的基因的表達(dá)魁瞪，這揭示了編碼基質(zhì)蛋白的基因穆律，包括 III 型和 IV 型膠原蛋白FN1蛋白聚糖LUM和OGN以及基質(zhì)細(xì)胞蛋白ECM1 SPARC和SPARCL1在 BrM-MDM 中高度表達(dá)（圖 6乙）。盡管 ECM 重塑與腫瘤進(jìn)展有關(guān)导俘，但LUM峦耘、OGN、SPARCL和SPARCL1表現(xiàn)出促進(jìn)和抗轉(zhuǎn)移的特性旅薄，這強(qiáng)調(diào)了 ECM 復(fù)雜的環(huán)境依賴性作用辅髓。我們還發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶CTSB和CTSW在 BrM-MDM 中高表達(dá)（圖6B ）泣崩，它們參與多種腫瘤促進(jìn)過程，包括侵襲和轉(zhuǎn)移洛口。透明質(zhì)酸受體HMMR矫付，參與肺損傷中的巨噬細(xì)胞趨化和纖維化，在 BrM-MDM 中也更高（圖 6 B）第焰÷蛴牛總之，這些數(shù)據(jù)表明 ECM 不僅由原發(fā)部位的巨噬細(xì)胞形成挺举，但 T-MDM 也可能在 BrM 中的 ECM 生態(tài)位構(gòu)建中發(fā)揮關(guān)鍵作用杀赢，這與IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同（圖 4 G）。

鑒于CXCL8（一種關(guān)鍵的中性粒細(xì)胞趨化劑）被 BrM-MG 上調(diào)（圖 6A）湘纵，我們探討了 TME 對中性粒細(xì)胞募集的貢獻(xiàn)脂崔，這些中性粒細(xì)胞在 BrM 中非常豐富（圖1F）。對主要中性粒細(xì)胞募集趨化因子及其受體的分析顯示梧喷，在所有被詢問的骨髓細(xì)胞中廣泛表達(dá)（圖 S6 E）砌左。為了探索與 BrM 相關(guān)的中性粒細(xì)胞的表型，我們查詢了 RNA-seq 數(shù)據(jù)铺敌，結(jié)果顯示 BrM 特異性上調(diào)ITGA3（圖 6 C）汇歹，其參與敗血癥中的中性粒細(xì)胞組織浸潤，以及CXCL17偿凭，先前與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在癌癥中的募集秤朗。我們還觀察到腺苷受體ADORA2A的上調(diào)（圖 6 C），它減弱了促炎中性粒細(xì)胞的表型笔喉。此外取视，我們發(fā)現(xiàn)CD177的表達(dá)增加（圖 6 C），這是一種調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移和活化的細(xì)胞表面受體常挚，可作為 PR3 陽性中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物作谭，進(jìn)而對 T 細(xì)胞增殖產(chǎn)生負(fù)面影響。值得注意的是奄毡，MET與癌癥中免疫抑制性中性粒細(xì)胞的募集有關(guān)折欠，在中性粒細(xì)胞中以 BrM 特異性方式上調(diào)（圖6C ）『鸸總之锐秦，我們發(fā)現(xiàn)了骨髓細(xì)胞的多種疾病特異性改變，從 BrM-TAM 延伸到中性粒細(xì)胞盗忱，這對 TME 內(nèi)其他細(xì)胞類型（包括 T 細(xì)胞）的募集和激活具有潛在意義酱床。

TAMs Are Poised toward an Immunomodulatory Phenotype in BrMs

TAM 有望在 BrM 中形成免疫調(diào)節(jié)表型

盡管我們通過 FCM發(fā)現(xiàn) BrM 與IDH WT 膠質(zhì)瘤中 CD4 ⁺和 CD8 ⁺ T 細(xì)胞的顯著積累，但這種對分離組織樣本的分析缺乏結(jié)構(gòu)信息趟佃。因此扇谣，我們對 IF 表型IDH WT 和 BrM 組織切片進(jìn)行了鄰域分析昧捷，以闡明 TAM 和 BrM 中的 CD3 ⁺ T 細(xì)胞之間是否存在空間關(guān)系。在IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中罐寨，T-MG 和 T-MDM 大多與同型細(xì)胞相鄰靡挥，而在其附近缺乏 T 細(xì)胞（圖 7A、7B 和S7A）鸯绿，可能反映了這些腫瘤中普遍的 T 細(xì)胞稀疏性跋破。相比之下，兩個 TAM 群體在 BrM 中更頻繁地與 T 細(xì)胞相鄰瓶蝴，表明存在相互作用的可能性（圖 7 A幔烛、7B 和S7 A）。因此囊蓝，我們研究了 BrM 中的 T 細(xì)胞活化狀態(tài)與無與倫比的健康供體血液的關(guān)系，并將它們與IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相應(yīng)群體并列令蛉。與對照組相比聚霜，來自 BrM 的CD4 ^{+ T 細(xì)胞表現(xiàn)出低反應(yīng)性、無反應(yīng)性表型的證據(jù)（}圖 7 C）珠叔，而 CD8 ⁺ T 細(xì)胞表現(xiàn)出衰竭特征（圖 7 D）蝎宇，這通常發(fā)生在慢性激活時(shí)，導(dǎo)致上調(diào)抑制性受體祷安。這些有缺陷的 T 細(xì)胞狀態(tài)可能是由 TME 中的腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的異常激活或 T 細(xì)胞抑制引起的姥芥，并且是治療癌癥的主要障礙。

為了描述 BrM TME 中可能驅(qū)動這些改變的推定機(jī)制汇鞭，我們探測了來自 CD45 ^-細(xì)胞凉唐、TAM 和 T 細(xì)胞（圖 7 E）的 RNA-seq 數(shù)據(jù)，以了解激活和抑制性免疫調(diào)節(jié)信號的表達(dá)霍骄。這揭示了各種典型 T 細(xì)胞激活劑和共激活劑的上調(diào)台囱，以及 T 細(xì)胞中的抑制介質(zhì)（PDCD1 / PD1、CD28和CTLA4）读整，而在兩個 TAM 群體（CD274 / PD ）中檢測到 T 細(xì)胞抑制和激活信號-L1和PDCD1LG 2/ PD-L2 )簿训。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)CD80上調(diào)米间，它在 T 細(xì)胞活化中具有多種作用强品，因?yàn)樗c CD274 異二聚化，通過 CD28 向 T 細(xì)胞提供共刺激信號屈糊，并通過與 CTLA4 相互作用發(fā)揮抑制作用的榛，在兩個 TAM 群體中與其正常參考和IDH WT 腫瘤群體相比（圖 7 E）。IDO1和IDO2的高表達(dá)也表明 TAMs 對代謝免疫逃避的潛在貢獻(xiàn)逻锐。
在 BrM ([圖 7]困曙。
我們使用加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA) 并將得到的表達(dá)模式與 CD4 ⁺和 CD8 ⁺細(xì)胞的配對 FCM 豐度以疾病和細(xì)胞類型特異性的方式相關(guān)聯(lián)表伦。我們確定了 15 個獨(dú)特的共表達(dá)模塊，顯示其特征基因（即模塊表達(dá)數(shù)據(jù)的第一個 PC）與任何提供的樣本特征顯著相關(guān)（p < 0.05）（圖 S7 B）慷丽。其中蹦哼，“棕色”WGCNA 模塊與特定的 BrM-MDM 注釋和 CD4 ⁺ T 細(xì)胞豐度相關(guān)。該模塊的 ORA 揭示了影響 TME 內(nèi)生長因子和細(xì)胞因子的可用性和活性的途徑的信號要糊，例如凝血和 ECM 調(diào)節(jié)（圖 S7 C）纲熏。。我們根據(jù)模塊成員強(qiáng)度和與 CD4 ⁺ T 細(xì)胞豐度的相關(guān)性對基因進(jìn)行排序锄俄，這確定了幾個具有相反免疫調(diào)節(jié)功能的因素（圖 7 F）局劲。雖然受體CD300E和BST1促進(jìn)單核細(xì)胞運(yùn)動和存活，我們還檢測到了免疫抑制的效應(yīng)物奶赠，例如肌動蛋白相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白CNN2鱼填，它負(fù)向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的運(yùn)動和吞噬活性。白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體 B 亞家族成員 LILRB2 和 LILRB3毅戈，它們減弱了骨髓細(xì)胞的活化苹丸，也是該模塊中排名靠前的基因。有趣的是苇经，LILRB2已被確定為一種限制抗腫瘤免疫的新型髓系免疫檢查點(diǎn)赘理。我們還發(fā)現(xiàn)了對 T 細(xì)胞影響的證據(jù)；CD52以其可溶形式抑制 T 細(xì)胞功能扇单，屬于 BrM-MDM 模塊基因之一商模。BrM-MDMs 經(jīng)歷與原發(fā)性顱外腫瘤不同的疾病特異性改變的觀點(diǎn)得到了這些基因上調(diào)的支持（圖 7 G），我們分析了一組外部 BrM 樣本與其匹配的原發(fā)性腫瘤組織相比（圖 7G）蜘澜。

discusssion

包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和 BrM 在內(nèi)的腦腫瘤對癌癥患者來說是一些最差的預(yù)后施流，其存活率通常在幾個月內(nèi)就可以測量出來。鑒于目前這些患者缺乏有效的治療選擇以及迄今為止評估的各種免疫療法的適度效果鄙信，確定未來臨床評估的新靶點(diǎn)至關(guān)重要嫂沉。一種潛在的豐富治療靶點(diǎn)來源是 TME。然而扮碧，盡管 TME 現(xiàn)在被廣泛接受為癌癥進(jìn)展和治療反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子趟章，但我們對腦 TME 的了解僅限于單個腦腫瘤類型或細(xì)胞區(qū)室，缺乏全面和綜合的分析慎王。

在這項(xiàng)研究中蚓土，我們利用一組多樣化的分析來深入探究原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腦癌的免疫情況。通過整合多參數(shù) FCM 分析赖淤、RNA-seq 數(shù)據(jù)蜀漆、TME 細(xì)胞培養(yǎng)分析、蛋白質(zhì)陣列和空間組織表征咱旱，我們發(fā)現(xiàn)了對IDH mut 和 WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者樣本中最豐富的免疫細(xì)胞群的組成和轉(zhuǎn)錄組的重要見解和源自不同顱外原發(fā)性腫瘤的 BrM确丢。

通過探索廣泛的免疫領(lǐng)域绷耍，我們發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤和 BrM 之間的幾個顯著差異，當(dāng)直接并排比較時(shí)鲜侥。在腦腫瘤中褂始，TAM 由組織駐留的 MG 和募集的 MDM 組成，我們發(fā)現(xiàn)IDH mut 和IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤之間 MG 與 MDM 的比例發(fā)生了顯著變化描函。此外崎苗，神經(jīng)膠質(zhì)瘤含有豐富的 TAM，而 T 細(xì)胞則少得多舀寓，尤其是在IDH mut 腫瘤中胆数。這證實(shí)了膠質(zhì)瘤是免疫冷腫瘤的概念。盡管在神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型和顱內(nèi)植入腦外源性腫瘤后觀察到骨髓中的 T 細(xì)胞隔離互墓，我們的臨床 BrM 樣本顯示淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯積聚必尼。這表明在大腦內(nèi)出現(xiàn)的腫瘤確實(shí)形成了與從顱外部位轉(zhuǎn)移的癌癥不同的 TME。此外篡撵，在探索源自不同原發(fā)性腫瘤的 BrM 時(shí)判莉，還存在其他差異。例如酸休，在黑色素瘤 BrM 樣本中，CD4 ⁺和 CD8 ^{+的組合豐度}T 細(xì)胞代表主要的免疫區(qū)室祷杈，而乳房 BrM 樣本顯示出最高的中性粒細(xì)胞浸潤斑司。TME 領(lǐng)域的這些關(guān)鍵差異僅在直接并列不同的腦部惡性腫瘤時(shí)才明顯，反映了免疫療法的功效但汞，這些免疫療法在黑色素瘤患者中顯示出對控制 BrM 的有希望的功效宿刮，但迄今為止在治療排除 T 細(xì)胞的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤方面效果非常有限。

我們還發(fā)現(xiàn)了跨不同腦腫瘤的 TAM 的復(fù)雜多方面表型私蕾，這些表型超出了它們的數(shù)量豐度僵缺。T-MG 和 T-MDM 顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征和共同的表達(dá)特征，這些特征還受到潛在疾病類型（IDH mut 與IDH WT 膠質(zhì)瘤與 BrMs）的影響踩叭。源自IDH WT 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 T-MDM 特征磕潮，由巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物、趨化因子受體和細(xì)胞因子組成容贝，被證明也是IDH患者存活率的預(yù)測因子神經(jīng)膠質(zhì)瘤自脯。此外，對 T-MDM 的分析表明斤富，盡管這些募集的細(xì)胞具有處理和呈遞抗原的潛力膏潮，并且可以位于 BrM 中 T 細(xì)胞的近端，但這種潛力顯然沒有在大腦 TME 中得到充分利用满力。本研究中使用的不同實(shí)驗(yàn)測定組的正交分析揭示了對免疫抑制潛在機(jī)制的更多見解焕参。這些包括我們的發(fā)現(xiàn)轻纪，即不同的 TAM 群體產(chǎn)生促炎分子、骨髓細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)因子叠纷、與 IPRES刻帚、IDO1 和 IDO2 免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)的因子，以及可能共同幫助塑造免疫抑制生態(tài)位的特定 ECM 成分和蛋白酶讲岁。因此我擂，改變 TAM 多方面表型的治療策略，而不是簡單地消耗所有這些具有潛在相反功能的細(xì)胞缓艳，應(yīng)該更有效校摩。

除了 TAM，評估中性粒細(xì)胞的作用也很重要阶淘，特別是在 BrM 中衙吩，我們發(fā)現(xiàn)它們非常豐富，因?yàn)樗鼈兛梢宰鳛橛行У拿庖咭种萍?xì)胞溪窒，正如對其他器官的研究表明的那樣坤塞。鑒于本研究揭示的腦癌高度復(fù)雜和多方面的免疫情況，很明顯澈蚌，TME 靶向藥物的合理組合對于避免出現(xiàn)適應(yīng)性耐藥至關(guān)重要摹芙，并結(jié)合臨床前研究來幫助確定最佳⊥鹈椋總而言之浮禾，這一豐富的資源可供研究界進(jìn)一步研究，以便我們能夠共同發(fā)現(xiàn)新的治療策略份汗，釋放 TME 中不同細(xì)胞對抗不同腦部惡性腫瘤的潛力盈电。