接上回喳魏，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 | 聚類分析中的機(jī)器學(xué)習(xí)與統(tǒng)計(jì)方法綜述（一）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 | 聚類分析中的機(jī)器學(xué)習(xí)與統(tǒng)計(jì)方法綜述（二）中卖哎，綜述了在過(guò)去幾年間發(fā)展起來(lái)的，用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析中聚類的機(jī)器學(xué)習(xí)和統(tǒng)計(jì)方法巷嚣，重點(diǎn)介紹了如何將一些常見(jiàn)的聚類方法，如層次聚類、基于圖的聚類盟广、混合模型、k-means瓮钥、集成學(xué)習(xí)筋量、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和基于密度的聚類等加以調(diào)整及應(yīng)用，從而解決單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中的獨(dú)特挑戰(zhàn)碉熄，例如低表達(dá)基因的缺失桨武，轉(zhuǎn)錄本的不均勻覆蓋，以及由技術(shù)偏差和不相關(guān)的混雜生物變異所帶來(lái)的細(xì)胞標(biāo)記的失真锈津。我們?cè)u(píng)價(jià)了標(biāo)準(zhǔn)化呀酸、dropouts推測(cè)以及降維等預(yù)處理步驟如何提高聚類效果。
本文將繼續(xù)介紹一些能夠?qū)r(shí)間序列樣本和多個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行聚類并且檢測(cè)罕見(jiàn)細(xì)胞類型的新方法琼梆。最后性誉，對(duì)部分開(kāi)發(fā)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聚類分析的軟件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和比較，以評(píng)估其性能和效率茎杂，為未來(lái)的數(shù)據(jù)分析提供一定的指導(dǎo)和方向错览。
01?罕見(jiàn)細(xì)胞類型及單個(gè)細(xì)胞類群
在單細(xì)胞的聚類分析中，罕見(jiàn)細(xì)胞類型的檢測(cè)是一個(gè)重要問(wèn)題蛉顽，因?yàn)樵诎l(fā)育或疾病進(jìn)展中起重要作用的細(xì)胞類型往往豐度較低蝗砾。由于罕見(jiàn)細(xì)胞類型的群體規(guī)模小，在標(biāo)準(zhǔn)的聚類分析中往往難以檢測(cè)到携冤。
RaceID是專門(mén)用于從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識(shí)別稀有細(xì)胞類型的一種聚類工具悼粮。該工具首先計(jì)算細(xì)胞間Pearson相關(guān)性用于k-means聚類。在每個(gè)類群中曾棕，根據(jù)和背景噪聲模型相比的基因的變異型篩選離群細(xì)胞扣猫。最后，如果離群細(xì)胞的相關(guān)性超過(guò)原始聚類中細(xì)胞間相關(guān)性的閾值翘地，則將離群細(xì)胞合并到離群簇中申尤。
GiniClust是另一個(gè)聚焦于罕見(jiàn)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的聚類工具。在算法中使用基尼系數(shù)進(jìn)行特征基因的選擇衙耕。與常用的Fano因子相比昧穿，這種方法對(duì)細(xì)胞總量占比較低的細(xì)胞群體更加敏感。最后橙喘，利用基尼系數(shù)篩選得到的基因作為特征進(jìn)行DBSCAN密度聚類时鸵，檢測(cè)稀有細(xì)胞類型。
屬于稀有細(xì)胞類型的細(xì)胞也可以被視為聚類過(guò)程中產(chǎn)生的異常值。在大多數(shù)已公開(kāi)的單細(xì)胞聚類算法中饰潜，都可以生成數(shù)量相對(duì)較小的簇初坠，甚至該簇中只包含一個(gè)細(xì)胞。雖然這可能是由于聚類算法的初始化或收斂性差造成的彭雾，但它也可以被解釋為來(lái)自罕見(jiàn)細(xì)胞類型的異常細(xì)胞碟刺。一些算法或工具包含特定的技術(shù)和參數(shù)，能夠進(jìn)行罕見(jiàn)細(xì)胞類型的檢測(cè)薯酝。以使用層次聚類的SINCERA為例半沽，它不要求用戶指定簇之間的最小距離，而是使用允許的最低細(xì)胞數(shù)量的閾值蜜托。
02?細(xì)胞Marker基因的檢測(cè)
聚類分析的另一個(gè)重要目的是發(fā)現(xiàn)新的Marker基因抄囚，以描述通過(guò)聚類發(fā)現(xiàn)的每種細(xì)胞類型的基因表達(dá)模式和功能，從而用于未來(lái)的生物學(xué)解釋和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證橄务。大多數(shù)方法是在聚類后通過(guò)對(duì)不同類群之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析來(lái)識(shí)別Marker幔托。例如，Seurat使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)蜂挪，這是一種基于排序表達(dá)值中秩次統(tǒng)計(jì)量的非參數(shù)檢驗(yàn)方法重挑。在SINCERA中，當(dāng)樣本容量較小棠涮，同樣使用秩和檢驗(yàn)谬哀，當(dāng)樣本容量變大時(shí)則使用Welch’s t檢驗(yàn)。
除了上述方法是將差異表達(dá)分析作為聚類的后處理步驟严肪，還有一些則是在聚類的過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行Marker基因的檢測(cè)史煎。BackSPIN計(jì)算每次分裂后每個(gè)簇中的平均基因表達(dá)量，并將每個(gè)基因分配到表達(dá)量最高的簇中驳糯。DendroSplit通過(guò)Welch’s t檢驗(yàn)識(shí)別p值最顯著的Marker基因作為類群分離評(píng)分篇梭，以決定是否需要在層次聚類中進(jìn)一步拆分分支。SAIC使用k-means對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類的同時(shí)酝枢，利用方差分析選擇Marker基因恬偷。
03?方法評(píng)估
在本節(jié)中，我們對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聚類方法進(jìn)行了兩次實(shí)驗(yàn)評(píng)估帘睦。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中袍患，我們使用人外周血單細(xì)胞數(shù)據(jù)，比較了幾種廣泛使用的單細(xì)胞聚類工具或方法竣付，以確定不同方法的優(yōu)勢(shì)和局限性诡延。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)來(lái)自5個(gè)個(gè)體的212個(gè)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了聚類古胆，以評(píng)估不同的工具在不同批次來(lái)源的多個(gè)細(xì)胞群中的聚類性能孕暇。
人外周血數(shù)據(jù)??
我們從10x Genomics網(wǎng)站下載了PBMC數(shù)據(jù)，在原始數(shù)據(jù)中總共包含了103887個(gè)細(xì)胞赤兴。除了使用整個(gè)數(shù)據(jù)集去進(jìn)行方法的比較外妖滔，我們還對(duì)原始數(shù)據(jù)按照不同大小（100桶良，1000座舍，10000）進(jìn)行向下采樣以評(píng)估其延展性。數(shù)據(jù)集最初包含32739個(gè)表達(dá)基因陨帆，我們從中選擇了至少在3個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的19630個(gè)基因曲秉。（使用的計(jì)算機(jī)參數(shù)：Intel Xeon E52687W v3 3.10GHz, 25 M Cache and 256 GB of RAM）。
(A)Y軸表示ARI值疲牵，X軸表示不同的測(cè)試數(shù)據(jù)集承二。其中不同顏色代表了不同的工具或方法。(B)Y軸表示運(yùn)行時(shí)間纲爸，X軸同圖A亥鸠。曲線截?cái)啾砻髟摲椒ㄔ谙鄳?yīng)數(shù)據(jù)集下不再適用。
如圖5所示识啦，通過(guò)對(duì)10次不同的運(yùn)行結(jié)果取均值和標(biāo)準(zhǔn)差负蚊，對(duì)ARI和運(yùn)行時(shí)間進(jìn)行了比較。結(jié)果表明颓哮，在這些方法中家妆，Monocle、cellTree冕茅、Seurat和SC3的表現(xiàn)最好伤极。但是，由于內(nèi)存問(wèn)題姨伤，Monocle哨坪、cellTree和Seurat不能擴(kuò)展到所有的測(cè)試數(shù)據(jù)集。SC3的算法中姜挺，最多對(duì)5000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行聚類齿税，剩余的細(xì)胞則通過(guò)構(gòu)造一個(gè)支持向量機(jī)（SVM）完成。而除去這一監(jiān)督學(xué)習(xí)的步驟炊豪，SC3的表現(xiàn)和cellTree凌箕、Seurat相似。pcaReduce能夠應(yīng)用于所有的數(shù)據(jù)集词渤，但運(yùn)行時(shí)間超過(guò)2天（圖5B）牵舱，同時(shí)聚類結(jié)果并沒(méi)有因?yàn)閿?shù)據(jù)集包含細(xì)胞數(shù)的增多而得到改善（圖5A）。SCRAT包在對(duì)100個(gè)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行聚類時(shí)表現(xiàn)良好缺虐，但當(dāng)使用40個(gè)單元（此處單元表示具有相關(guān)基因表達(dá)的細(xì)胞）聚類1000個(gè)細(xì)胞時(shí)變得不穩(wěn)定芜壁。此外，該工具至少需要3天時(shí)間來(lái)處理5000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集，因此不能擴(kuò)展到更大的數(shù)據(jù)集慧妄。
圖5A還顯示顷牌，SC3和pcaReduce等使用k-means作為聚類步驟之一的工具在多次運(yùn)行中的方差最大，而使用層次聚類的工具cellTree塞淹、CIDR和DendroSplit窟蓝，使用基于圖聚類方法的工具SNN-Cliq和基于密度的聚類工具M(jìn)onocle在多次運(yùn)行中總是保持相同的聚類結(jié)果”テ眨混合模型TSCAN和Seurat以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法SCRAT也返回相同的聚類結(jié)果运挫，這表明在聚類實(shí)現(xiàn)的過(guò)程中使用了一些固定的初始化策略。
進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)套耕，基于層次聚類的方法顯示出非常接近的平均ARI結(jié)果谁帕。當(dāng)聚類1000個(gè)細(xì)胞時(shí)，我們可以看到BackSPIN冯袍、CIDR匈挖、DendroSplit和ICGS的ARI值大約在0.25到0.3之間。cellTree雖然也是基于層次聚類颠猴，但應(yīng)用了LDA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維关划，這似乎更適用于原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。在基于劃分的聚類方法上翘瓮，我們可以看到贮折，盡管pcaReduce使用k-means作為其框架的一部分，但通過(guò)正確使用PCA和聚類的合并策略资盅，能夠顯著改善聚類的結(jié)果调榄。SC3看起來(lái)是一種前景不錯(cuò)的方法，它結(jié)合了幾種不同的距離測(cè)量和映射方法的優(yōu)點(diǎn)呵扛，然而每庆，當(dāng)數(shù)據(jù)集增大，即SC3開(kāi)始依賴SVM對(duì)更多的細(xì)胞進(jìn)行分類時(shí)今穿，結(jié)果似乎是不穩(wěn)定的缤灵，例如聚類10000個(gè)細(xì)胞的結(jié)果要差于聚類1000個(gè)細(xì)胞的結(jié)果。使用GMM的TSCAN在大數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出比k-means更好的結(jié)果蓝晒，這表明高斯混合模型可能在聚類中發(fā)揮更好地積極推動(dòng)作用腮出。對(duì)于基于密度的聚類，Monocle在聚類10000個(gè)細(xì)胞時(shí)的性能優(yōu)于其他方法芝薇。最后胚嘲，盡管Seurat和SNN-Cliq都建立了SNN作為聚類的基礎(chǔ)，但是前者的總體表現(xiàn)更優(yōu)洛二，可能是因?yàn)镾eurat使用了Louvain算法馋劈，而SNN-Cliq則是基于團(tuán)檢測(cè)的方法攻锰。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，即使有大量的專門(mén)為單細(xì)胞分析所開(kāi)發(fā)的聚類方法妓雾，它們?cè)诰垲悢?shù)千個(gè)細(xì)胞時(shí)的結(jié)果顯示出相當(dāng)大的變化娶吞。并且我們?nèi)匀恍枰恍┓椒ǎ@些方法不像SC3那樣依賴于監(jiān)督學(xué)習(xí)君珠，就能夠應(yīng)用于大型數(shù)據(jù)集寝志，例如數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或者更多。
乳腺癌數(shù)據(jù)??
我們從公共數(shù)據(jù)中下載得到了來(lái)源于11名乳腺癌患者共515個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集策添，該數(shù)據(jù)集包含了25636和基因的TPM表達(dá)值，我們從中提取了5000個(gè)高變基因進(jìn)行此次分析毫缆。這些細(xì)胞總體包含三類：免疫細(xì)胞唯竹、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。由于一些患者的數(shù)據(jù)未覆蓋到全部三種類型苦丁，因此浸颓，我們最后使用了來(lái)自5名患者的212個(gè)細(xì)胞作為此次實(shí)驗(yàn)的對(duì)象。
該數(shù)據(jù)集的主要目的是用于比較兩個(gè)適用于混合樣本聚類的工具旺拉。首先产上，Seurat主要通過(guò)CCA的方法對(duì)來(lái)自不同患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合。運(yùn)行Seurat時(shí)蛾狗，我們選取了幾個(gè)不同的參數(shù)：特征基因數(shù)量分別為{3000,3200,...,5000}晋涣，典型相關(guān)成分{2,...,10}，分辨率{0.2,0.3,0.4,0.5}沉桌。通過(guò)幾種不同的組合分析谢鹊，我們最終發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)最優(yōu)的組合是1600+2+0.2留凭，分別對(duì)應(yīng)上面三個(gè)參數(shù)佃扼。scVDMC在數(shù)學(xué)優(yōu)化框架中使用內(nèi)嵌的特征選擇來(lái)尋找一小組共享的基因以整合數(shù)據(jù)集。我們同樣選取不同的參數(shù)進(jìn)行組合蔼夜，最后得到的最優(yōu)組合是λ = 1000兼耀，α = 3，w = 3求冷。
(A)Y軸表示ARI值瘤运，X軸表示不同工具和數(shù)據(jù)集的組合。(B)同圖A遵倦。
我們也將這兩個(gè)工具和上一節(jié)中表現(xiàn)最好的Monocle尽超，SC3以及cellTree在兩個(gè)層面進(jìn)行了比較：按照樣本來(lái)源分離單獨(dú)進(jìn)行聚類；合并樣本聚類梧躺。圖2展示了比較的結(jié)果似谁。從圖6A中我們可以看到傲绣，SC3和cellTree在合并聚類的得分中要差很多，提示我們簡(jiǎn)單的合并樣本不適用于整合多個(gè)不同來(lái)源的單細(xì)胞數(shù)據(jù)巩踏。我們還注意到scVDMC和Seurat都獲得了較高的ARI秃诵。其中，scVDMC的平均值為0.681塞琼，Seurat的平均值為0.675菠净。盡管scVDMC的均值更高，但其方差也比較大彪杉，與Seurat的差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.3511）毅往。另外，scVDMC相較于Seurat擁有更少的運(yùn)行時(shí)間（p=2E-14）派近∨饰ǎ總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明對(duì)于混合的樣本使用內(nèi)置批次矯正方法（如包含CCA的Seurat）的工具更為有效渴丸。
04
討論
? ??在過(guò)去的幾年里侯嘀，專門(mén)用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的聚類算法已經(jīng)有了實(shí)質(zhì)性的發(fā)展。這些算法旨在解決單細(xì)胞數(shù)據(jù)中固有的挑戰(zhàn)谱轨，例如細(xì)胞特異性偏差戒幔、dropouts和技術(shù)噪聲。一些用于解決特定情況（批次土童、罕見(jiàn)細(xì)胞诗茎、時(shí)間序列）的工具已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。此外娜扇，不同的方法也越來(lái)越關(guān)注數(shù)據(jù)的預(yù)處理错沃，如標(biāo)準(zhǔn)化、降維和相似性度量等雀瓢，這些方法有助于減少執(zhí)行聚類前的技術(shù)差異枢析。總之刃麸，這些計(jì)算方法的進(jìn)步為單細(xì)胞數(shù)據(jù)的聚類分析提供了非常大的幫助醒叁。
我們也注意到，由于單細(xì)胞平臺(tái)的發(fā)展泊业，細(xì)胞捕獲和測(cè)序的成本及時(shí)間也越來(lái)越低把沼，捕獲的細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越高。因此吁伺，越來(lái)越多的研究更需要擴(kuò)展性良好的聚類工具或方法饮睬，以便能夠在更大的數(shù)據(jù)集中進(jìn)行使用。而這一發(fā)展也為分析帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)篮奄，大多數(shù)現(xiàn)有的工具都無(wú)法很好地應(yīng)用到數(shù)萬(wàn)個(gè)甚至更多的單細(xì)胞數(shù)據(jù)捆愁，所以也限制了部分算法在未來(lái)研究中的適用性割去。
另一個(gè)現(xiàn)有方法的缺陷是關(guān)于數(shù)據(jù)的整合。如今昼丑，單細(xì)胞數(shù)據(jù)集仍然在不斷地快速增長(zhǎng)呻逆，這些開(kāi)放的大量數(shù)據(jù)將會(huì)使我們對(duì)特定細(xì)胞類型、細(xì)胞標(biāo)記菩帝、表達(dá)模式等擁有更深的了解咖城。此外，這些數(shù)據(jù)還有助于構(gòu)建大規(guī)模不同疾病隊(duì)列的單細(xì)胞圖譜呼奢。然而宜雀，目前的聚類方法中，很少有專門(mén)應(yīng)用于多數(shù)據(jù)的合并聚類分析控妻，往往需要借助其它工具的使用州袒。
除了本文中主要描述的無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法之外，還有一種使用監(jiān)督或半監(jiān)督學(xué)習(xí)方式來(lái)進(jìn)行細(xì)胞聚類的替代方法弓候。例如，SC3包使用監(jiān)督學(xué)習(xí)將多余的細(xì)胞分配給通過(guò)共識(shí)聚類發(fā)現(xiàn)的簇他匪，提高了其在大數(shù)據(jù)集應(yīng)用上的延展性菇存。再比如，當(dāng)有一個(gè)已知類別的參考數(shù)據(jù)集時(shí)邦蜜，通過(guò)Scmap依鸥，可以將其他數(shù)據(jù)集中未知的細(xì)胞比對(duì)到該參考數(shù)據(jù)集中最相似的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的聚類悼沈。
最后贱迟，除了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)之外，更多不同類型的單細(xì)胞組學(xué)方法也呈現(xiàn)風(fēng)靡之勢(shì)絮供。盡管面對(duì)新類型的單細(xì)胞數(shù)據(jù)衣吠，現(xiàn)有的方法仍然部分適用。但是在未來(lái)壤靶，也迫切需要應(yīng)對(duì)多組學(xué)整合聚類的新的計(jì)算方法缚俏。
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