網(wǎng)絡(luò)世界的發(fā)展造成了現(xiàn)在的信息爆炸柜思，只要真心想學(xué)寄雀，我們能在網(wǎng)上找到各式各樣的學(xué)習(xí)資料。但資料越多奶稠，卻越迷惑俯艰。隨著最近對(duì)CRISPR的進(jìn)一步了解，我愈發(fā)感受到自己對(duì)這個(gè)技術(shù)的稚嫩锌订，每當(dāng)我有這種感覺(jué)的時(shí)候竹握，總會(huì)回頭不斷補(bǔ)充我早就應(yīng)該配備的背景知識(shí)。Addgene網(wǎng)站是我最常用的CRISPR的學(xué)習(xí)站瀑志，上面有非常多優(yōu)秀的指引和poster涩搓，我們可以學(xué)習(xí)到他人整理好的精準(zhǔn)解讀和最新進(jìn)展。今天我看的是CRISPR Guide
目前我對(duì)CRISPR技術(shù)的大致認(rèn)知：
1. CRISPR機(jī)制：仿照細(xì)菌和古細(xì)菌對(duì)抗噬菌體的免疫系統(tǒng)劈猪，根據(jù)細(xì)菌種類不同昧甘，有不同的Cas核酸酶切酶。
2. Cas9（ S. pyogenes Cas9, SpCas9）是我目前接觸最多的战得，不同的Cas9又有不同的功能：
（1）野生型Cas9造成雙鍵斷裂充边，可通過(guò)NHEJ或HDR修復(fù)方式完成基因編輯；
（2）RuvC和HNH是Cas9造成DSB的功能域常侦，Cas9 nickase（Cas9n）則是Cas9的D10A突變體浇冰，它保留了一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，生成DNA nick而不是DSB聋亡，此外Cas9n的特異性較之野生型更好肘习。
（3）dead Cas9（dCas9）是沒(méi)有失去內(nèi)切酶活性的Cas9，盡管dCas9缺乏核酸內(nèi)切酶活性坡倔，但它仍然能gRNA和目標(biāo)DNA鏈結(jié)合漂佩。如果gRNA將dCas9以轉(zhuǎn)錄抑制因子/RNA聚合酶定位到靶向DNA，可以用于敲低基因表達(dá)罪塔。同樣可以在dCas9的N和C端上連接入轉(zhuǎn)錄激活因子投蝉，從而達(dá)到激活基因表達(dá)的作用。
以上是我記憶中能想到的Cas9類型征堪，但實(shí)際上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些瘩缆，例如經(jīng)過(guò)修飾后的xCas9可以識(shí)別更為廣譜的PAM序列，從原來(lái)的NGG擴(kuò)增至NG佃蚜、GAA和GAT庸娱，xCas9不僅僅PAM更為廣譜着绊，其編輯特異性也更好。
3. DNA修復(fù)方式的不同涌韩，則會(huì)有不同的效果畔柔。例如NHEJ適合構(gòu)建雜合子null敲除細(xì)胞系；有模板的HDR修復(fù)方式則可以達(dá)到精準(zhǔn)編輯的效果臣樱。此外靶擦，由于細(xì)胞周期對(duì)DNA修復(fù)活性的影響，也會(huì)影響基因編輯的效率雇毫。
正文開(kāi)始
CRIPSR guide的架構(gòu)：
- CRISPR Overview
- Generating a Knockout Using CRISPR
- Enhancing Specificity with Nickases and High Fidelity Enzymes
- Making Precise Modifications Using Homology Directed Repair (HDR)
- CRISPR Base Editing Without Double-Strand Breaks
- Activation or Repression of Target Genes Using CRISPR
- Epigenetic Modifications Using CRISPR
- Multiplex Genome Engineering with CRISPR
- Genome-Wide Screens Using CRISPR
- Visualize Genomic Loci Using Fluorophores
- Purify Genomic Regions Using dCas9
- RNA Targeting
- Cas9 Alternatives for CRISPR Genome Engineering
- Anti-CRISPR
- Plan Your CRISPR Experiment
以下我將摘取個(gè)人認(rèn)為重要并且我尚且不熟悉的部分描述
1. CRISPR Overview （需要達(dá)到閉著眼睛就能畫(huà)出來(lái)的效果）
在CRISPR之前玄捕，像鋅指核酸酶(ZFNs)或轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(TALENs)這樣的基因組工程方法要求科學(xué)家為每個(gè)基因組目標(biāo)設(shè)計(jì)并生成新的核酸酶對(duì)。而CRISPR系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單棚放，包含兩個(gè)組成部分：一個(gè)是導(dǎo)向RNA (gRNA或sgRNA)枚粘，另一個(gè)是CRISPR相關(guān)的內(nèi)切酶(Cas蛋白)。
gRNA由Cas結(jié)合所必的支架序列（scaffold） 和靶向目的基因序列的20個(gè)核苷酸組成飘蚯。CRISPR最初被用于敲除各種細(xì)胞類型和生物體中的靶基因馍迄，但對(duì)各種Cas酶的修飾使CRISPR的應(yīng)用得以擴(kuò)展，可選擇性地激活/抑制靶基因局骤，純化DNA的特定區(qū)域攀圈，在活細(xì)胞中成像DNA，并精確地編輯DNA和RNA峦甩。
2. Generating a Knockout Using CRISPR--基操
gRNA的特性：
（1）與基因組的其他部分相比赘来，這個(gè)序列是獨(dú)一無(wú)二的。
（2）靶序列與相鄰基序(PAM)相鄰凯傲。
Cas9在與靶基因結(jié)合后發(fā)生二次構(gòu)象變化犬辰，形成核酸酶結(jié)構(gòu)域，稱為RuvC和HNH冰单，以剪切DNA幌缝。Cas9介導(dǎo)的DNA裂解的最終結(jié)果是在目標(biāo)DNA (PAM序列上游的3-4個(gè)核苷酸)內(nèi)發(fā)生雙鏈斷裂(DSB)。通過(guò)NHEJ和HDR完成DNA修復(fù)诫欠。
NHEJ修復(fù)途徑是最活躍的修復(fù)機(jī)制狮腿，它導(dǎo)致DSB位點(diǎn)上的小核苷酸插入或缺失(indels)。在大多數(shù)情況下呕诉，NHEJ在目標(biāo)DNA中產(chǎn)生小的indel，導(dǎo)致氨基酸缺失吃度、插入或移碼突變甩挫，導(dǎo)致目標(biāo)基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)中的過(guò)早終止密碼子，理想的最終結(jié)果是目標(biāo)基因的功能缺失突變椿每。
關(guān)于DNA修復(fù)對(duì)于CRISPR實(shí)驗(yàn)的影響可以移步到我之前整理的文章
CRISPR-Cas9基因編輯不只是剪開(kāi)DNA這么簡(jiǎn)單
3. Enhancing Specificity with Nickases and High Fidelity Enzymes--使用Nickase Cas9
由于Cas9n只能形成一個(gè)單鏈小缺口伊者，且DNA并不解鏈英遭。因此，需要兩個(gè)相反的Nickases Cas9才能在目標(biāo)DNA中生成DSB亦渗，如果兩個(gè)Cas9n太遠(yuǎn)挖诸，也不能形成DSB，因此成對(duì)Cas9n的使用可用于提高基因編輯的特異性法精。Nickase系統(tǒng)也可以與HDR介導(dǎo)的基因編輯相結(jié)合進(jìn)行特定的基因編輯多律。
鑒于Cas9的潛在脫靶效應(yīng)，科學(xué)家們想辦法降低Cas9的非特異性搂蜓。2015年狼荞，研究人員利用合理的誘變技術(shù)開(kāi)發(fā)了兩種高保真Cas9: eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1。
（1）eSpCas9(1.1)含有丙氨酸取代物帮碰，削弱了HNH/RuvC溝與非靶標(biāo)DNA鏈之間的相互作用相味，降低了脫靶效應(yīng)。
（2）SpCas9-HF1也有丙氨酸取代殉挽，而丙氨酸取代破壞了Cas9與DNA磷酸基的相互作用丰涉。
（3）HypaCas9包含REC3域突變，增加了Cas9的校對(duì)和目標(biāo)識(shí)別斯碌。
這三種高保真酶比野生型Cas9產(chǎn)生更少的脫靶編輯一死。相應(yīng)的其他Cas9變體，如果有感興趣可以進(jìn)一步查閱输拇。
4. Making Precise Modifications Using Homology Directed Repair (HDR)
HDR需要有同源臂摘符，而同源臂的長(zhǎng)度也決定精準(zhǔn)度。但HDR的效率普遍較低(<10%的修飾等位基因)策吠。因此逛裤，許多實(shí)驗(yàn)室試圖調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)提高HDR，因?yàn)镠DR活躍于S期和G2期猴抹。涉及NHEJ的化學(xué)或遺傳抑制基因也可能增加HDR頻率带族。此外，Cas9-CtIP是Cas9與CtIP的融合蟀给，CtIP是一種參與雙鏈斷裂切除的蛋白蝙砌，可以提高HDR的效率。
5. CRISPR Base Editing Without Double-Strand Breaks （單堿基編輯跋理，無(wú)DSB）
由于HDR效率非常低择克，胞嘧啶堿基編輯器(CBEs)和腺嘌呤堿基編輯器(ABEs)應(yīng)運(yùn)而生。重點(diǎn)是在不形成DSB的情況下完成基因編輯前普，還可以給予一個(gè)模板肚邢，完成單等位基因的編輯。
6. Activation or Repression of Target Genes Using CRISPR（重點(diǎn)）
dCas9保留了gRNA靶向目標(biāo)DNA結(jié)合的能力，但卻無(wú)核酸內(nèi)切酶活性骡湖。
（1）當(dāng)dCas9結(jié)合在DNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上時(shí)贱纠，DNA聚合酶難以結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄响蕴。
（2）dCas9也可以與轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子融合谆焊，將這些dCas9融合蛋白靶向于啟動(dòng)子區(qū)域，可以產(chǎn)生強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄抑制(CRISPR interference浦夷，或CRISPRi)或下游靶基因的激活(CRISPRa)辖试。
（1）最簡(jiǎn)單的dCas9激活或抑制基因表達(dá)的方案是，將dCas9直接融合到單個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子上军拟，如上圖A剃执。
（2）表達(dá)表位標(biāo)記的dCas9+抗體激活效應(yīng)蛋白(如B)。
（3）dCas9串聯(lián)融合多個(gè)不同的激活域(如C懈息。
（4）使用修飾過(guò)的支架gRNA和附加的RNA結(jié)合輔助激活劑(如SAM激活劑肾档、panel D)共同表達(dá)dCas9-VP64。
與Cas9或Cas9 nickase誘導(dǎo)的基因組修飾不同辫继，dCas9介導(dǎo)的基因激活或抑制是可逆的怒见，因?yàn)樗粫?huì)永久地修飾基因組DNA。dCas9還被用于全基因組篩選姑宽，以激活或抑制小鼠和人類細(xì)胞中的基因表達(dá)遣耍。
7. Epigenetic Modifications Using CRISPR（新知識(shí)點(diǎn)）
滅活Cas酶可以與p300、LSD1炮车、MQ1和TET1等表觀修飾基因融合舵变，從而創(chuàng)造可編程的表觀工程工具。在而不引起雙鏈斷裂的狀態(tài)下瘦穆，通過(guò)改變基因啟動(dòng)子中胞嘧啶的甲基化狀態(tài)纪隙，或通過(guò)誘導(dǎo)組蛋白乙酰化扛或、去甲基化來(lái)改變基因表達(dá)绵咱，這個(gè)效果也是可逆的。
8. Multiplex Genome Engineering with CRISPR
同一質(zhì)粒中表達(dá)多個(gè)gRNAs熙兔，可以靶向多個(gè)靶基因悲伶，這種CRISPR可應(yīng)用于：
（1）使用雙nickases產(chǎn)生敲除或使用Cas9進(jìn)行基因編輯。
（2）移除兩個(gè)gRNA靶位點(diǎn)之間的序列住涉，造成大片段敲除麸锉。
（3）同時(shí)編輯多個(gè)基因。
總的來(lái)說(shuō)就是舆声，想怎么來(lái)怎么來(lái)淮椰。
由于篇幅太長(zhǎng)，暫將這Addgene指南分為至少2個(gè)部分來(lái)介紹（主要是我想去睡覺(jué)了，一時(shí)半會(huì)看不完）主穗，以上是第一部分內(nèi)容，主要是CRISPR的常規(guī)操作毙芜，而這之后的CRISPR應(yīng)用則是拉開(kāi)普通CRISPR和高手CRISPR的地方了（我瞎說(shuō)忽媒，因?yàn)槲也粫?huì)）。
