本文是參考學習單細胞轉(zhuǎn)錄組高級分析一：多樣本合并與批次校正的學習筆記晚胡〉课玻可能根據(jù)學習情況有所改動案腺。
前言實際的科研項目中不可能只有一個樣本，多樣本的單細胞數(shù)據(jù)如何合并在一起，是否需要校正批次效應(yīng)呢衬潦？先上一張圖說明多樣本scRNA數(shù)據(jù)的批次效應(yīng)：
左邊的圖簡單地把多個單細胞的數(shù)據(jù)合并在一起，不考慮去除批次效應(yīng)，樣本之間有明顯的分離現(xiàn)象沾歪。右邊的圖是使用算法校正批次效應(yīng)，不同的樣本基本融和在一起了雾消。scRNA數(shù)據(jù)校正批次效應(yīng)的算法有很多：MNN, CCA+MNN, Harmony, Scanorama, scMerge等灾搏，本文推薦發(fā)表在Cell上的CCA+MNN方法挫望，通過Seurat包就可以實現(xiàn)。Seurat數(shù)據(jù)整合功能簡介Seurat早期版本整合數(shù)據(jù)的核心算法是CCA狂窑，文章發(fā)表在2018年的nature biotechnology媳板，作者是Seurat的開發(fā)者Andrew Butler。同年Haghverdi等人開發(fā)了MNN算法校正批次效應(yīng)泉哈，文章也發(fā)表在了nature biotechnology蛉幸。2019年Andrew等人將CCA與MNN算法結(jié)合起來，并參考SNN算法的理念設(shè)計了“錨點”評分體系丛晦，使Seurat整合數(shù)據(jù)更強大更穩(wěn)健奕纫。它不僅可以校正實驗的批次效應(yīng)，還能跨平臺整合數(shù)據(jù)烫沙，例如將10x單細胞數(shù)據(jù)匹层、BD單細胞數(shù)據(jù)和SMART單細胞數(shù)據(jù)整合在一起；也能整合單細胞多組學數(shù)據(jù)，例如將單細胞ATAC天揖、空間轉(zhuǎn)錄組與單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合在一起觉阅。本文只討論多樣本數(shù)據(jù)的合并與校正批次效應(yīng)，多組學數(shù)據(jù)的整合以后專門寫篇文章介紹仰冠。Seurat整合流程與原理
1、使用CCA分析將兩個數(shù)據(jù)集降維到同一個低維空間蝶糯，因為CCA降維之后的空間距離不是相似性而是相關(guān)性洋只，所以相同類型與狀態(tài)的細胞可以克服技術(shù)偏倚重疊在一起。CCA分析效果見下圖：
左圖使用PCA降維昼捍，細胞之間的距離體現(xiàn)的是轉(zhuǎn)錄特征相似性识虚，批次效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差會使樣本分離。右圖使用CCA降維妒茬，細胞之間的距離體現(xiàn)的是轉(zhuǎn)錄特征相關(guān)性担锤，因此同類型且同狀態(tài)的細胞可以跨越技術(shù)差異重疊在一起。
2乍钻、CCA降維之后細胞在低維空間有了可以度量的“距離”肛循，MNN(mutual nearest neighbor)算法以此找到兩個數(shù)據(jù)集之間互相“距離”最近的細胞，Seurat將這些相互最近鄰細胞稱為“錨點細胞”银择。我們用兩個數(shù)據(jù)集A和B來說明錨點多糠，假設(shè)：
A樣本中的細胞A3與B樣本中距離最近的細胞有3個（B1,B2,B3）
B樣本中的細胞B1與A樣本中距離最近的細胞有4個（A1,A2,A3,A4）
B樣本中的細胞B2與A樣本中距離最近的細胞有2個（A5,A6）
B樣本中的細胞B3與A樣本中距離最近的細胞有3個（A1,A2,A7）
那么A3與B1是相互最近鄰細胞，A3與B2浩考、B3不是相互最近鄰細胞夹孔，A3+B1就是A、B兩個數(shù)據(jù)集中的錨點之一。實際數(shù)據(jù)中搭伤，兩個數(shù)據(jù)集之間的錨點可能有幾百上千個只怎，如下圖所示：
圖中每條線段連接的都是相互最近鄰細胞
3、理想情況下相同類型和狀態(tài)的細胞才能構(gòu)成配對錨點細胞怜俐，但是異常的情況也會出現(xiàn)身堡，如上圖中query數(shù)據(jù)集中黑色的細胞團。它在reference數(shù)據(jù)集沒有相同類型的細胞佑菩，但是它也找到了錨點配對細胞（紅色連線）盾沫。Seurat會通過兩步過濾這些不正確的錨點：
在CCA低維空間找到的錨點，返回到基因表達數(shù)據(jù)構(gòu)建的高維空間中驗證殿漠，如果它們的轉(zhuǎn)錄特征相似性高則保留赴精，否則過濾此錨點。
檢查錨點細胞所在數(shù)據(jù)集最鄰近的30個細胞绞幌，查看它們重疊的錨點配對細胞的數(shù)量蕾哟，重疊越多分值越高，代表錨點可靠性更高莲蜘。原理見下圖：
左邊query數(shù)據(jù)集的一個錨點細胞能在reference數(shù)據(jù)集鄰近區(qū)域找到多個配對錨點細胞谭确，可以得到更高的錨點可靠性評分；右邊一個錨點細胞只能在reference數(shù)據(jù)集鄰近區(qū)域找到一個配對錨點細胞票渠，錨點可靠性評分則較低逐哈。
4、經(jīng)過層層過濾剩下的錨點細胞對问顷，可以認為它們是相同類型和狀態(tài)的細胞昂秃，它們之間的基因表達差異是技術(shù)偏倚引起的。Seurat計算它們的差異向量杜窄，然后用此向量校正這個錨點錨定的細胞子集的基因表達值肠骆。校正后的基因表達值即消除了技術(shù)偏倚，實現(xiàn)了兩個單細胞數(shù)據(jù)集的整合塞耕。
深究技術(shù)細節(jié)的朋友可以參閱原文：Tim S, Andrew Butler, Paul Hoffman , et al. Comprehensive integration of single cell data[J].Cell,2019.獲取數(shù)據(jù)集
本專題的數(shù)據(jù)來自Immune Landscape of Viral- and Carcinogen-Driven Head and Neck Cancer蚀腿，數(shù)據(jù)集GEO編號：GSE139324。建議大家練習自己下載扫外，也可以加Kinesin微信獲取數(shù)據(jù)的百度云鏈接莉钙。
后續(xù)我會摸索之后寫一篇下載數(shù)據(jù)的教程。
原數(shù)據(jù)集有63個scRNA的數(shù)據(jù)筛谚，都是分選的CD45+免疫細胞磁玉。考慮到計算資源問題刻获，挑選了10個樣本用于此次演示。
數(shù)據(jù)集合并前面講了很多數(shù)據(jù)整合的原理，大家是不是很心動呢蝎毡？所有類型的單細胞數(shù)據(jù)都要進行整合嗎厚柳，數(shù)據(jù)整合算法真的像開發(fā)者說的只消除技術(shù)偏倚不掩蓋細胞之間真實的基因表達差異嗎？如果你掌握了本文介紹的內(nèi)容沐兵，建議你整合與不整合的數(shù)據(jù)都分析試試别垮，實踐出真知！回到本節(jié)數(shù)據(jù)集合并的話題上扎谎，介紹兩種方法合并多個樣本的數(shù)據(jù)：
library(Seurat)
通過最后的dim和table函數(shù)查看數(shù)據(jù)碳想，可以發(fā)現(xiàn)兩種方法得到的基因數(shù)和細胞數(shù)完全一樣。下面我們降維聚類看看有沒有差異：
scRNA1 <- NormalizeData(scRNA1)
第一種方法合并數(shù)據(jù)的結(jié)果：
第二種方法合并數(shù)據(jù)的結(jié)果：
通過降維圖可以看出兩種方法的結(jié)果完全一致毁靶。這兩種方法真的沒有一點差異嗎胧奔，有興趣的朋友可以用GSE125449的數(shù)據(jù)集試試。
數(shù)據(jù)集整合
#scRNAlist是之前代碼運行保存好的seurat對象列表预吆，保存了10個樣本的獨立數(shù)據(jù)
與合并樣本的降維結(jié)果對比如下圖：
數(shù)據(jù)質(zhì)控
##==數(shù)據(jù)質(zhì)控==#
質(zhì)控后的數(shù)據(jù)
細胞類型鑒定
為了后續(xù)分析的方便龙填，我們先用SingleR預(yù)測每個cluster的細胞類型。
##==鑒定細胞類型==##
用兩個參考數(shù)據(jù)庫分別運行SingleR拐叉，結(jié)果有一定差異岩遗，由此可見SingleR+Marker基因人工鑒定才是可靠的細胞鑒定的方法。
我們后續(xù)分析采用左圖鑒定的結(jié)果
