隨著去除核糖體測(cè)序技術(shù)深入發(fā)展动看，越來(lái)越多的環(huán)狀RNA（circRNA）不斷報(bào)道發(fā)現(xiàn)，基于生物信息學(xué)分析顯示circRNA發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能斋否。然后如何采用實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)一步驗(yàn)證circRNA的生物學(xué)功能顯得尤為重要。目前circRNA常用的驗(yàn)證方法主要有以下幾種：

====qRT-PCR定量驗(yàn)證========

CircRNA定量驗(yàn)證主要通過(guò)分離得到非多聚腺苷酸化RNA或去rRNA后 的RNA赋铝、用RNase R去除線性RNA旋奢、隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA泳挥、RT-PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物跑膠驗(yàn)證至朗、PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證等技術(shù)手段屉符，其中最關(guān)鍵的步驟是針對(duì)CircRNA設(shè)計(jì)特異性的RT-PCR引物。CircRNA的環(huán)化方式有兩種：內(nèi)含子環(huán)化（ciRNA）和外顯子環(huán)化(CircRNA)锹引，通過(guò)外顯子環(huán)化產(chǎn)生的CircRNA除了back-spliced junction位點(diǎn)處與線性RNA不同外矗钟，其他區(qū)域是一致的，因此可以針對(duì)CircRNA的back-spliced junction位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的引物（divergent primers）（見(jiàn)下圖）嫌变，divergent primers可以通過(guò)網(wǎng)站直接進(jìn)行設(shè)計(jì)吨艇。

理論上對(duì)于circRNA而言，divergent引物可以利用cDNA擴(kuò)增出條帶腾啥，而利用gDNA擴(kuò)增不出條帶东涡；對(duì)作為control的線性RNA而言，cDNA和gDNA都可以擴(kuò)增出條帶倘待。

====Northern plot驗(yàn)證circRNA===

Northern blot驗(yàn)證CircRNA主要通過(guò)分離得到非多聚腺苷酸化RNA或去rRNA后的RNA疮跑、用RNase R去除線性RNA、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等技術(shù)手段來(lái)驗(yàn)證凸舵。其中根據(jù)CircRNA環(huán)化的方式設(shè)定探針序列是至關(guān)重要的步驟祖娘。對(duì)于內(nèi)含子環(huán)化產(chǎn)生的ciRNA，可以根據(jù)內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)探針（如下圖a）啊奄；對(duì)于外顯子環(huán)化產(chǎn)生的CircRNA渐苏，盡可能跨越backsplice junction位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針（如下圖b）。驗(yàn)證策略是對(duì)基因組DNA菇夸、總RNA以及CircRNA（DNA free琼富、rRNA free、linearRNA free）同時(shí)進(jìn)行雜交驗(yàn)證峻仇。

=====過(guò)表達(dá)驗(yàn)證circRNA======

CircRNA的成環(huán)機(jī)制有很多公黑，其中基于CircRNA側(cè)翼的反向互補(bǔ)序列（Alu序列）是目前公認(rèn)的一種成環(huán)機(jī)制（如下圖）。因此我們可以通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域（包含CircRNA側(cè)翼的Alu元件或者內(nèi)部的堿基互補(bǔ)序列）摄咆、根據(jù)限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切并連接到載體上凡蚜；過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染；定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率吭从；divergent primers鑒定CircRNA過(guò)表達(dá)倍數(shù)等技術(shù)手段驗(yàn)證CircRNA朝蜘。

?

過(guò)表達(dá)策略：

1. 擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補(bǔ)序列，側(cè)翼上下游1kb處過(guò)表達(dá)效率更佳涩金；

2. 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增基于基因組DNA為模版谱醇。

基于circRNA側(cè)翼Alu序列特征暇仲，PCR擴(kuò)增含側(cè)翼Alu序列的目標(biāo)DNA序列，隨后依據(jù)對(duì)應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切副渴，進(jìn)而連接pEGFP-C1載體奈附。連接載體進(jìn)而轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)細(xì)胞樣本，定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率煮剧〕饴耍基于divergent primer驗(yàn)證circRNA過(guò)表達(dá)倍數(shù)。

====RNAi驗(yàn)證circRNA====

和過(guò)表達(dá)策略相反勉盅，我們可以采用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證CircRNA佑颇。對(duì)于內(nèi)含子環(huán)化產(chǎn)生的ciRNA，可以根據(jù)內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA進(jìn)行干擾草娜，對(duì)于外顯子環(huán)化產(chǎn)生的CircRNA挑胸，可以根據(jù)back-splice junction位點(diǎn)處序列信息設(shè)計(jì)siRNA，最后通過(guò)divergent primers鑒定CircRNA敲除倍數(shù)宰闰。驗(yàn)證策略：可以同時(shí)設(shè)計(jì)三種siRNA茬贵，一種是和CircRNA backsplice junction位點(diǎn)靶標(biāo)結(jié)合的siRNA，可以特異性干擾CircRNA的表達(dá)议蟆；一種是和linear RNA靶標(biāo)結(jié)合的siRNA闷沥，可以特異性干擾linear RNA的表達(dá)；還有一種是和CircRNA咐容、linear RNA共有的外顯子序列結(jié)合的siRNA，可以同時(shí)干擾CircRNA和linear RNA的表達(dá)蚂维。

====熒光原位雜交定位CircRNA=====

位于細(xì)胞核中的circRNAs主要調(diào)控親本基因的表達(dá)戳粒，而位于細(xì)胞質(zhì)中的CircRNA主要發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（ceRNAs）的作用，一般采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對(duì)CircRNA進(jìn)行定位虫啥，以便于后續(xù)功能的進(jìn)一步研究蔚约，設(shè)計(jì)的雜交探針需要跨越backsplice junction位點(diǎn)。

===熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CircRNA======

報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)是將報(bào)告基因的編碼序列與目的基因相結(jié)合涂籽，將結(jié)合基因進(jìn)行表達(dá)苹祟，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)測(cè)定目的基因的表達(dá)量。熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物通過(guò)熒光測(cè)定儀檢測(cè)生物熒光進(jìn)而檢測(cè)熒光素酶的活性评雌，熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系树枫，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)景东。

====CircRNA翻譯功能驗(yàn)證========

CircRNA包含核糖體進(jìn)入位點(diǎn)砂轻，可以翻譯表達(dá)有效蛋白是最近研究的熱點(diǎn)，circRNA翻譯功能的驗(yàn)證可以通過(guò)NGS和生物信息學(xué)方法（翻譯組學(xué)）對(duì)ORF進(jìn)行預(yù)測(cè)斤吐；外源性功能驗(yàn)證可以通過(guò)人工合成小circRNA或者是熒光報(bào)告基因?qū)ircRNA進(jìn)行驗(yàn)證搔涝；內(nèi)源性功能驗(yàn)證可以通過(guò)Minigene表達(dá)載體厨喂、蔗糖密度梯度實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜鑒定等方法對(duì)circRNA進(jìn)行驗(yàn)證庄呈。其中Minigene表達(dá)載體包含circRNA的表達(dá)框（如下圖所示）：外顯子側(cè)翼的反向互補(bǔ)序列以及促使環(huán)化剪切的介導(dǎo)序列蜕煌。Minigene表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中可以主動(dòng)成環(huán)，因此是內(nèi)源性的circRNA的模擬物诬留，轉(zhuǎn)染后可以通過(guò)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率幌绍，divergent primers鑒定CircRNA表達(dá)量。

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