bulk轉(zhuǎn)錄組最主要的作用就是根據(jù)基因表達(dá)的變化找到其中蘊(yùn)含的通路機(jī)制
常規(guī)的GO和KEGG分析苍息，屬于超幾何富集算法缩幸，使用的基因數(shù)據(jù)源是我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)組vs對(duì)照組所獲得的差異基因壹置，其中差異基因則需要根據(jù)設(shè)置的閾值進(jìn)行判斷，具有一定的主觀性表谊。并且在進(jìn)行DEseq2差異表達(dá)分析時(shí)钞护，低表達(dá)基因的真實(shí)信號(hào)較弱，容易被技術(shù)變異和背景噪聲所覆蓋爆办，從而不被認(rèn)為成差異表達(dá)基因难咕。
而基因富集分析GSEA（gene-set enrichment analysis）無需做差異分析，直接拿所有基因的表達(dá)量即可找到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有一致性差異的感興趣的通路。好處就是余佃，不經(jīng)過差異基因篩選暮刃，保留了這些關(guān)鍵信息，進(jìn)而找到那些差異不很明顯但是基因差異趨勢(shì)很一致的功能基因集爆土。
做GSEA富集分析需要準(zhǔn)備兩個(gè)輸入文件椭懊，一個(gè)是基因表達(dá)數(shù)據(jù)文件，另外一個(gè)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)文件步势，表達(dá)數(shù)據(jù)文件就是基因在每個(gè)樣品里面的一個(gè)表達(dá)量氧猬，這就是RNA-seq標(biāo)準(zhǔn)化處理后的表達(dá)矩陣，即DESeq2分析后導(dǎo)出的“normalized_count.txt”文件坏瘩。
它的第一行是固定格式#1.2盅抚。第二行是基因的數(shù)目和樣品的數(shù)目。第三行是樣品的名稱倔矾，建議順序按照組別進(jìn)行放置妄均。Description這一列必須有可以復(fù)制前面基因名一列。
行是樣本破讨，列是基因名（之間不能有空格）命名不能是“-1”可以是下劃線“_1”
所有基因的表達(dá)矩陣需要去除沒有表達(dá)的基因行丛晦，即表達(dá)值全為0的
基因表達(dá)數(shù)據(jù)文件中的基因名稱形式需要與使用的GMT基因集中的基因名稱一致
先以制表符分隔的.txt作為保存文件的類型，然后修改后綴為.gct
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)文件提陶，第一行分別是樣本數(shù)烫沙，分組數(shù)，1隙笆。第二列是 # 兩個(gè)分組名稱锌蓄。第三列是根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)中樣本的順序，0 0 0代表對(duì)照組 1 1 1代表實(shí)驗(yàn)組撑柔。所有間隔以tab鍵分隔瘸爽，不要有多余的間隔。修改后綴為.cls铅忿。
下載GSEA v4.3.3 for Windows本地軟件剪决，先點(diǎn)擊load data，將兩個(gè)輸入文件拖入灰色框內(nèi)檀训，點(diǎn)擊load these files柑潦，顯示There were NO errors即表示文件沒有問題。
然后點(diǎn)擊Run GSEA峻凫，設(shè)置參數(shù)渗鬼，選擇剛剛上傳的表達(dá)數(shù)據(jù)集，選擇參考基因集數(shù)據(jù)庫荧琼，例如我進(jìn)行小鼠的GO bp分析譬胎，選擇m5.go.bp.v2023.2.Mm.symbols.gmt差牛。
Number of permutations：設(shè)置置換次數(shù)，通常為1000堰乔。置換次數(shù)越多偏化，結(jié)果越穩(wěn)定但計(jì)算時(shí)間越長(zhǎng)。
Phenotype labels：輸入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)文件镐侯，用于定義分組信息夹孔。哪個(gè)樣品在前面，富集結(jié)果就和哪個(gè)組呈正相關(guān)
Collapse/Remap to gene symbols：是否將探針名轉(zhuǎn)化為gene symbol析孽。由于我輸入的是gene symbol搭伤，所以是false
Permutation type（置換類型）：這是決定置換時(shí)使用的參考類型⊥嗨玻可以選擇按表型（phenotype）置換或按基因集（gene set）置換怜俐。當(dāng)有兩個(gè)或多個(gè)不同的樣本組（例如對(duì)照組和處理組）時(shí)，想要比較處理組和對(duì)照組之間基因表達(dá)的差異邓尤，選擇表型置換拍鲤。當(dāng)有一個(gè)單獨(dú)的樣本組，但想評(píng)估基因集的顯著性時(shí)汞扎，選擇基因集置換季稳。
Chip platform：Collapse/Remap to gene symbols為TRUE才選擇，否則留空
Enrichment statistic：選擇用哪種方法來計(jì)算富集得分澈魄，如weighted景鼠，使用加權(quán)方法。
Metric for ranking genes：選擇哪種方法來對(duì)基因進(jìn)行排序痹扇。Signal2Noise適用于有兩個(gè)對(duì)比組（對(duì)照組和處理組）铛漓，每個(gè)組必須至少有三個(gè)重復(fù)，基于兩個(gè)組之間的平均值差異和標(biāo)準(zhǔn)差比值來排序基因鲫构。信號(hào)越大浓恶，噪聲越小，得分越高结笨。tTest：適用于兩個(gè)對(duì)比組的情況包晰，類似于Signal2Noise，使用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量對(duì)基因進(jìn)行排序炕吸，反映兩個(gè)組之間的差異顯著性伐憾。
Gene list sorting mode：基因列表的排序模式。real算途，表示使用真實(shí)值排序塞耕。
Gene list ordering mode：descending蚀腿，表示降序排列嘴瓤。
Max size: exclude larger sets：排除包含基因數(shù)量超過這個(gè)值的基因集扫外。
Min size: exclude smaller sets：排除包含基因數(shù)量少于這個(gè)值的基因集。
Save results in this folder：選擇保存分析結(jié)果的文件夾路徑廓脆。
Collapsing mode for probe sets => 1 gene：在有多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一基因時(shí)筛谚，選擇使用哪一個(gè)探針的數(shù)據(jù)。Max_probe：使用探針集中表達(dá)值最高的探針來代表該基因停忿。
Normalization mode（歸一化模式）：meandiv：基于均值和方差進(jìn)行歸一化
Seed for permutation（置換的種子）：timestamp：使用時(shí)間戳作為隨機(jī)種子
Randomization mode（隨機(jī)化模式）：選擇是否在隨機(jī)化過程中保持組間的平衡驾讲。no_balance：不進(jìn)行平衡隨機(jī)化。
Create GCT files（創(chuàng)建GCT文件）：false：不創(chuàng)建GCT文件席赂；Create SVG plot images（創(chuàng)建SVG繪圖）：false
Omit features with no symbol match：true：省略沒有匹配到基因符號(hào)的特征（基因）吮铭。
Make detailed gene set report：true：生成詳細(xì)報(bào)告。
Median for class metrics：選擇是否使用中值作為計(jì)算類度量（如富集分?jǐn)?shù)）的統(tǒng)計(jì)量
Number of markers：指定要顯示的標(biāo)記基因的數(shù)量颅停。默認(rèn)值為100谓晌。
Plot graphs for the top sets of each phenotype：指定要為每個(gè)表型繪制圖表的top基因集數(shù)量，默認(rèn)值為20癞揉。
Save random ranked lists：選擇是否保存基于隨機(jī)置換生成的基因排序列表纸肉。默認(rèn)false
Make a zipped file with all reports：默認(rèn)false不生成壓縮文件。
Alternate delimiter：指定用于解析輸入文件的備用分隔符喊熟。通常默認(rèn)不需要設(shè)置柏肪。
點(diǎn)擊下方的Run運(yùn)行，點(diǎn)擊最下方可以看到程序運(yùn)行的過程和狀態(tài)
數(shù)據(jù)集介紹
MH: hallmark gene sets
這些基因集總結(jié)并代表了特定生物過程或功能的基因表達(dá)模式芥牌。它們是通過計(jì)算方法從其他基因集集合中提取并映射到小鼠基因的版本烦味。
M1: positional gene sets
這些基因集是按照小鼠染色體的位置分組的。每個(gè)基因集對(duì)應(yīng)于染色體上的一個(gè)特定區(qū)域壁拉，用于研究與染色體特定區(qū)域相關(guān)的基因和功能拐叉。
M2: curated gene sets
這些基因集是從多個(gè)來源整理出來的，包括在線數(shù)據(jù)庫扇商、PubMed文獻(xiàn)以及專家的知識(shí)凤瘦。它們代表了經(jīng)過深入研究的生物通路和功能。M2基因集分為兩個(gè)子集：
CGP (chemical and genetic perturbations)：基因表達(dá)特征與化學(xué)或基因干擾相關(guān)案铺。
CP (canonical pathways)：經(jīng)典通路蔬芥。
M3: regulatory target gene sets
這些基因集包含與轉(zhuǎn)錄因子或miRNA調(diào)控有關(guān)的目標(biāo)基因。它們是根據(jù)基因在非編碼區(qū)中的相似性來預(yù)測(cè)可能的調(diào)控關(guān)系控汉。M3基因集有兩個(gè)子集：
miRDB gene sets：基于miRDB數(shù)據(jù)庫中高置信度的miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)笔诵。
GTRD gene sets：基于GTRD數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。
M5: ontology gene sets
這些基因集按照Gene Ontology（GO）分類姑子。GO是一個(gè)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫乎婿，分為以下幾個(gè)部分：
BP (Biological Process)：生物過程。
CC (Cellular Component)：細(xì)胞成分街佑。
MF (Molecular Function)：分子功能谢翎。
M8: cell type signature gene sets
這些基因集包括了通過單細(xì)胞測(cè)序研究識(shí)別的小鼠組織中特定細(xì)胞類型的標(biāo)記基因捍靠，用于研究不同細(xì)胞類型的表達(dá)特征。
在得到的結(jié)果文件夾中首先找到.index.html文件
Enrichment in Phenotype: 1 (和 Phenotype: 0)
基因集上調(diào)情況：在Phenotype 1(即pehnotype labels中在前面的組森逮，這里是實(shí)驗(yàn)組和Phenotype 0（對(duì)照組）中榨婆，上調(diào)的基因集數(shù)量分別為3633/5325和1692/5325。
FDR小于25%的顯著基因集數(shù)量褒侧。在Phenotype 1中良风，有1029個(gè)基因集，而在Phenotype 0中闷供，有104個(gè)基因集烟央。
Nominal p-value：未調(diào)整的p值。顯示在不同顯著性水平下（如p < 1%和p < 5%）富集的基因集數(shù)量歪脏。在Phenotype 1中吊档，分別有585和1061個(gè)基因集顯著，而在Phenotype 0中唾糯，分別有92和147個(gè)基因集顯著怠硼。
富集結(jié)果的概述，根據(jù)Plot graphs for the top sets of each phenotype設(shè)置的默認(rèn)值20移怯，每個(gè)圖都是可以點(diǎn)進(jìn)去的鏈接
這個(gè)通路的富集結(jié)果展示了GOCC_MITOTIC_SPINDLE_POLE基因集在Phenotype 1中上調(diào)的情況柴底。Enrichment Score (ES): 0.5831028尤筐，這個(gè)值表示在排序列表中，基因集中基因的富集程度。ES值越高末秃，表示基因集在該組中富集的程度越高想幻。排序列表中的基因根據(jù)某種統(tǒng)計(jì)量（例如蛀蜜，t檢驗(yàn)或信噪比）從最顯著上調(diào)到最顯著下調(diào)進(jìn)行排序办斑。富集得分ES反映了基因集中基因在整個(gè)排序列表中是否集中出現(xiàn)在排序列表的頂部（ES正值，表示上調(diào)）或底部（ES負(fù)值赖草，表示下調(diào)）学少。富集得分的計(jì)算是通過一個(gè)步進(jìn)算法，當(dāng)遇到屬于基因集的基因時(shí)秧骑，ES增加版确；當(dāng)遇到不屬于基因集的基因時(shí)，ES減少乎折。因此绒疗，富集得分表示了基因集成員在整個(gè)排序列表中“集中”出現(xiàn)的程度。
Normalized Enrichment Score (NES): 2.18531骂澄，這是標(biāo)準(zhǔn)化后的富集分?jǐn)?shù)吓蘑，用于不同基因集和實(shí)驗(yàn)條件之間的比較。通常坟冲，NES大于1.0被認(rèn)為是顯著富集磨镶。
FWER（Family-Wise Error Rate溃蔫，家族誤差率）是指在多重比較（multiple comparisons）中，至少出現(xiàn)一個(gè)假陽性結(jié)果的概率棋嘲。0.046表示這個(gè)基因集的富集在考慮了多重比較的情況下仍然具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
Enrichment Plot:
Running ES Score：綠色曲線表示富集得分的變化矩桂。曲線最高點(diǎn)表示這個(gè)基因集的最大富集得分沸移。Hit Indices：黑色條帶表示基因集的成員在整個(gè)基因排序列表中的位置。條帶集中在哪一部分說明這些基因集成員是哪個(gè)組中是顯著富集的侄榴。Ranking Metric Scores：灰色區(qū)域表示基因排序指標(biāo)得分雹锣。每個(gè)基因在這個(gè)排序列表中都有一個(gè)Ranking Metric Score，它反映了該基因在兩個(gè)組之間的表達(dá)差異的程度和方向癞蚕。正值表示該基因在實(shí)驗(yàn)組中上調(diào)蕊爵，負(fù)值反之¤肷剑灰色區(qū)域的形狀和分布揭示了基因在兩組中的表達(dá)模式攒射。區(qū)域較窄的部分表示這些基因的得分接近0，表明它們?cè)趦蓚€(gè)表型中的表達(dá)差異不大恒水。而較寬的部分表示得分遠(yuǎn)離0会放，表明這些基因在兩個(gè)表型中的表達(dá)差異顯著。如果灰色區(qū)域在排序列表的前端（靠左側(cè)）出現(xiàn)正向尖峰钉凌，表示這些基因集的成員在排序列表中排名靠前咧最，并且在實(shí)驗(yàn)組中上調(diào)。反之下調(diào)御雕。
圖表下方的表格列出了基因集中的主要基因矢沿，這些基因?qū)Ω患Y(jié)果的貢獻(xiàn)較大。這些基因被稱為“核心富集”（Core Enrichment）基因酸纲，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟患治鲋衅鸬搅岁P(guān)鍵作用捣鲸。
該圖顯示了GOCC_MITOTIC_SPINDLE_POLE基因集的隨機(jī)富集得分（ES）分布，用于評(píng)估該基因集在各組之間的富集情況闽坡。如果實(shí)際的ES值（通常是一個(gè)正值）超過這個(gè)圖中的正ES峰值區(qū)域摄狱，則表明這個(gè)基因集在實(shí)驗(yàn)組中的富集是顯著的，并且不是由于隨機(jī)原因引起的无午。
RANK AT MAX指的是基因集中產(chǎn)生最大富集得分（ES）的基因在整個(gè)排序列表中的位置媒役。
基因標(biāo)記數(shù)目：這里的基因標(biāo)記數(shù)目是指在Phenotype 1和Phenotype 0中與表達(dá)差異相關(guān)的基因數(shù)量。Phenotype 1：有12466個(gè)基因標(biāo)記宪迟，這些基因在Phenotype 1中表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化酣衷。Phenotype 0：有13811個(gè)基因標(biāo)記，這些基因在Phenotype 0中表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化次泽。Phenotype 1的45.1%：表示Phenotype 1中的這些基因標(biāo)記占排序列表中所有基因標(biāo)記的45.1%穿仪。
Rank ordered gene list（基因排序列表）
Dataset details數(shù)據(jù)集中包含26277個(gè)特征（基因
Gene set details基因集篩選：基因集的大小篩選條件（min=15, max=500）席爽，使得5325個(gè)基因集通過篩選被用于分析。
Global statistics and plots全局統(tǒng)計(jì)和繪圖：提供了p-value和NES的分布圖啊片，以及全局ES直方圖只锻。
Other：顯示了進(jìn)行該分析所使用的具體參數(shù)。
Comments時(shí)間戳和隨機(jī)種子：時(shí)間戳和使用的隨機(jī)種子（1720352136232）紫谷，確保結(jié)果的可重復(fù)性齐饮。
還有不太清楚的地方，可以點(diǎn)擊Guide to interpret results進(jìn)行查看
