1.什么是轉錄因子

轉錄因子（Transcription factor旨枯，TF）的調控決定著基因的調控網(wǎng)絡以及表達水平』斐郏基因的表達驅動著一系列的細胞活動攀隔，這些表達的調控需要通過轉錄因子（蛋白）和轉錄因子結合位點（DNA元件）的相互作用實現(xiàn)。轉錄水平的調控不是一個簡單的獨立過程栖榨，它是由上百個轉錄因子昆汹，目標序列以及共調控因子所組成的高度互作的基因調控網(wǎng)絡。

2.為什么研究轉錄因子

一個課題最開始往往是研究某個基因的序列信息以及基因所行駛的功能作用婴栽，這些是屬于基因的下游研究满粗。但在下游研究累積到一定經(jīng)驗之后，老師往往開始著手于研究基因的上游調控機理愚争，即不單關注基因A如何影響細胞活動映皆，更關注哪些因素影響基因A的功能發(fā)揮挤聘。調控機理研究理論上會涉及多個層面的因素，例如：轉錄因子捅彻、蛋白激酶组去、miRNA、DNA甲基化步淹、組蛋白修飾从隆、lncRNA……

轉錄因子成為調控機理的研究大戶是最正常不過的事情。因為一個轉錄因子能同時控制多個基因的表達贤旷，同時轉錄因子的功能作用也可能受多個共作用因子的影響广料。如果能闡明如此復雜的調控網(wǎng)絡砾脑，這可是很有科研成就感的幼驶。

3.研究方法

現(xiàn)有主流的轉錄因子鑒別方法可分為兩種：傳統(tǒng)實驗鑒別（experimental methods）以及通過計算機進行的生物信息學鑒別（computational methods）。簡單來說韧衣，實驗方法主要用于尋找不同類型目標盅藻，即通過已知TF尋找未知TFBS，或通過已知TFBS找出其對應TF畅铭。而生物信息學方法更多是用于同類型的預測氏淑，即通過序列保守性分析，通過已知TF預測未知TF硕噩，或通過已知TFBS預測未知TFBS假残。這些研究思路的關系如圖1.

圖1. 轉錄因子研究方式

3.1生物信息學預測（computational methods）

無論是TF還是TFBS的同類預測，生物信息的研究手段主要依賴于蛋白質或者DNA的序列保守性進行炉擅。具體算法和軟件有隱馬爾可夫模型,Gibbs抽樣,貪婪算法等辉懒，但這次重點在于介紹研究轉錄因子的實驗方法，因此不過于敘述這部分信息谍失。

3.2實驗方法篩選（experimentalmethods）

實驗方法主要有兩種思路：1. 通過已知TF尋找未知TFBS眶俩；2.通過已知TFBS尋找未知TF。無論哪種手段快鱼，前提都是基于蛋白與DNA之間的結合關系尋找颠印，即交叉尋找目標，這有別于計算機技術的同類型尋找抹竹。

3.2.1通過已知TF尋找未知TFBS

如果已經(jīng)鎖定了一個感興趣的TF线罕，那常用思路是確定其TFBS，然后得知道它控制的下游基因窃判。從已知TF定位到未知TFBS的過程闻坚，主要的實驗方法包括ChIP-seq、DNaseI-seq兢孝、DamID-seq等體內實驗窿凤，以及DIP-seq仅偎、SELEX(-seq)、PBM等體外實驗雳殊。

這些研究的通量與應用范圍如圖2所示橘沥，其中，縱坐標表示可以從多大范圍檢測TFBS（檢測通量）夯秃，橫坐標表示TF-TFBS的結合細節(jié)（檢測精細程度）座咆。以ChIP-seq為例，它可以在全基因組水平一次發(fā)現(xiàn)超過20萬個結合位點信息仓洼，但只能確定到TFBS的序列信息（是ATTCG還是ACTCG）介陶，卻難以了解到目標TF與TFBS之間的結合程度（TFBS能與TF結合多久，結合多牢固等信息）色建。

圖2.多種轉錄因子研究方法的比較哺呜。 （CS：ConsensusSite，PWM: Position WeightMatrices）

3.2.1.1SELEX技術

Systematicevolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 是其中最早的一種體外檢測轉錄因子結合位點技術箕戳，這項技術在20多年前已被科學家們利用某残，而且它不需要已知序列信息就可以檢測到新的結合位點。它的原理是（圖3a)：1.提取并純化轉錄因子陵吸；2.隨機打斷的DNA文庫與目標轉錄因子孵育玻墅；3.提取與TF結合的DNA，進一步PCR擴增片段壮虫；4.把PCR擴增的片段重復與TF孵育澳厢，最終篩選出高結合率的DNA。SELEX技術不需要已知的DNA片段信息就可以檢測新TFBS囚似，但不足之處在于它只能找出結合率高的TFBS剩拢，因此鑒定效率較低。

為了解決鑒定效率較低的問題谆构，高通量測序技術可以聯(lián)合SELEX篩選TFBS裸扶。關聯(lián)高通量技術后，SELEX-seq只需要一輪篩選而不像之前需要多輪篩選搬素，但它的問題在需要大量的高質量純化蛋白以及前期實驗操作復雜呵晨。

3.2.1.2Protein-binding Microarrays （PBM）技術

PBM技術（圖3b）首先固定雙鏈dna列陣在芯片當中，然后加入感興趣的目標蛋白熬尺，孵育洗脫非結合蛋白后摸屠，加入帶有熒光標記的抗體靶向目標蛋白，最后通過熒光信號鑒別蛋白-DNA結合關系粱哼。熒光強度會最終換算為PositionWeight Matrices（PWM）季二，從而計算DNA的結合序列。

3.2.1.3DIP-seq

DIP-seq（圖3c）是另外一種體外檢測轉錄因子與dna關系的技術。與PBM不同胯舷，這種技術不需要預先固定DNA刻蚯，它是通過檢測染色質DNA來實現(xiàn)目標鑒定。大體的實驗流程可分為：1.利用甲醛交聯(lián)轉錄因子與DNA片段桑嘶；2.切斷DNA為100到500bp的片段炊汹；3.通過轉錄因子特異性抗體，富集與TF結合的DNA逃顶；4.去交聯(lián)后讨便，富集DNA進行芯片或高通量測序。

3.2.1.4ChIP-seq

ChIP-seq的實驗過程與之間介紹的DIP-seq非常類似以政，唯一不同是霸褒，ChIP-seq可以通過甲醛原位交聯(lián)TF與DNA，而DIP-seq只能在體外交聯(lián)盈蛮。ChIP-seq的優(yōu)點是更高的分辨率废菱，更低的噪音等。但它的弊端在于1.過于依賴蛋白數(shù)量眉反，2.依賴于交聯(lián)效率昙啄，3.抗體特異性及獲取可能性穆役。4.難以分辨直接結合還是間接結合的TF寸五。

圖3. 多種主流TF鑒定技術的操作流程

3.2.1.5.mechanically induced trapping of molecular interactions（****MITOMI）

MITOMI是少數(shù)可以測量TF與DNA解離系數(shù)Kd的實驗技術，它具有中等通量耿币，但卻不適合用于de novo的TFBS鑒定梳杏。MITOMI具體流程圖4：

1.將感興趣的tf固定在玻璃上，接通微流管淹接，倒入DNA十性；

2.DNA結合到固定的tf上；

3.富集結合的DNA塑悼，并洗脫未結合的片段劲适；

4.通過富集的DNA數(shù)量計算蛋白-DNA解離系數(shù)Kd。

圖4. MITOMI原理示意圖

3.2.2.通過已知TFBS尋找未知****TF

比較常見的實驗研究方法是酵母單雜交（Yeast one Hybrid厢蒜，Y1H）及被稱為反向ChIP實驗 的PICh（Proteomicsof Isolated Chromatin segments）霞势。

3.2.2.1酵母單雜交 （Y1H）

酵母單雜交能篩選到與DNA結合的蛋白質，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質的核苷酸序列斑鸦，而無需復雜的蛋白質分離純化操作愕贡，故在蛋白研究中，具有一定的優(yōu)勢巷屿；而且固以，酵母屬真核細胞，通過酵母系統(tǒng)得到的結果，比其他體外技術獲得的結果憨琳，更能體現(xiàn)真核細胞內基因表達調控的真實情況诫钓。

主要實驗過程為：

1.把感興趣的TFBS序列（Bait）插入報告基因上游，并將帶有TFBS與報告基因的質粒整合到酵母基因組中篙螟，構建含有報告基因的酵母尖坤；

2.提取mRNA構建轉錄因子cDNA文庫，并將文庫與酵母激活因子融合相連闲擦，構建“Prey”文庫慢味。把帶有文庫的質粒轉入到步驟1的酵母中。

3.條件篩選生長酵母墅冷，如果TF與TFBS有結合楚堤，即報告基因可以順利表達。

圖5.酵母單雜交技術原理

3.2.2.2PICh實驗

PICh爱咬，又被稱為反向ChIP實驗际邻，實際是通過分離的感興趣DNA片段富集轉錄因子，最終利用質譜技術鑒定所富集的蛋白質腔彰。PICh所分離的TF難以被識別為直接還是間接結合因子叫编，同時，現(xiàn)階段來說霹抛，這項技術的通量相對較低搓逾，不適合大批量篩選TF。

注意事項

1.體外實驗雖然可以鑒別很多蛋白-DNA相互作用杯拐，但由于生物體復雜性（共調控因子霞篡，競爭性轉錄因子等），這些體外識別的相互作用難以在體內重復或發(fā)現(xiàn)端逼。

2.體內實驗比較真實地還原轉錄因子-DNA之間的作用朗兵，卻難以鑒別出直接還是間接作用關系。

3.利用PBM方法可以完成de novo TFBS鑒別顶滩。

4.檢測通量一般受限于蛋白質的純化質量及數(shù)量余掖。

5.大多數(shù)方法難以分析解離系數(shù)，因此對DNA或蛋白質的洗脫難以把握礁鲁。

6.除了實驗方法盐欺，通過計算機技術鑒別結合位點的保守性從而預測新的轉錄因子目標區(qū)域已經(jīng)被大量使用。但無論何種算法救氯，這些預測都過于簡單化TF-DNA之間的作用關系找田，從而造成極高的預測假陽性率。

7.(i)ChIP, HT-SELEX, 或PBM方法的目的在于發(fā)現(xiàn)結合序列或PWM着憨。 (ii) MITOMI分析可用于進一步分析定量信息墩衙。(iii) ChIP實驗可用于分析體內結合信息。

附錄

多種體內外TF鑒定方法的對比：

method：方法；

synomyms：實驗名稱漆改；

throughput：檢測通量心铃；

materialsneeds：所需實驗材料，其中P代表protein挫剑，D代表DNA去扣，“＋”到“＋＋＋＋”分別代表數(shù)據(jù)可用于定性，半定量樊破，定量及動力學分析愉棱；

Datatype：實驗所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)類型；

resolution：分辨率（可檢測堿基程度）哲戚。

轉載自基迪奧生物