說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪特笋。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。
主要知識點(diǎn)：
--蛋白提取的質(zhì)量控制
--脫鹽的處理方法
--還原烷基化及酶解的步驟
--蛋白質(zhì)及肽段的預(yù)分級
蛋白提取的質(zhì)量控制
我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質(zhì)提取出來以后猎物，這事兒還沒完，因?yàn)槲覀冃枰獙μ崛〕鰜淼牡鞍走M(jìn)行一下質(zhì)控淘讥，以確認(rèn)是否成功提取出了足夠的蛋白堤如，是否有污染等。
如上圖蝗岖，質(zhì)量控制分兩個(gè)部分：
含量測定：檢測是否有充足的蛋白被提取出榔至。注意上圖里提到的不兼容問題唧取，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度枫弟，而可以選用BCA方法；反之淡诗，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白绪爸，可以選用Bradford法宙攻。
SDS-PAGE：檢測蛋白的提取效率介褥，以及是否有污染。比如我們上了50個(gè)樣溢陪，能看到的條帶卻很少睛廊，說明定量不準(zhǔn)確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白咆霜，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。
以上圖為例光酣，0號樣品中間的條帶不見了脉课，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異唱遭。我們可以重新提取一次呈驶，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異跌穗，建議用label free的方法虏辫，每個(gè)樣品單獨(dú)做定量，而不要用iTRAQ或TMT標(biāo)記定量羹唠，否則會因?yàn)橹虚g這個(gè)高豐度蛋白的影響娄昆，而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。
我們再看來幾種常見的問題哺眯，以及解決方法扒俯，如下圖：
情況1：提取出來的結(jié)果差異很大。這種情況需要重新提取夺姑，以檢測到底是提取不充分造成的差異掌猛，還是樣品本身的差異；
情況2：左邊是分子量marker,右邊是實(shí)際樣品废膘，可以看到實(shí)際樣品的條帶很少，可能是提取不充分站削，需要重設(shè)提取參數(shù)孵稽，使用更劇烈的條件，更長的時(shí)間园细，重新提冉有！；
情況3：橫紋鹿寻、縱紋比較多诽凌，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進(jìn)行脫鹽處理痢法，也就是利用脫鹽柱與肽段結(jié)合杜顺，而與其它物質(zhì)不結(jié)合，從而達(dá)到去除污染的目的尖奔。
情況4：兩個(gè)條帶很類似洗鸵，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢火邓？第一種情況，由于這是同樣類型的樣品铲咨，比如都是小鼠肌肉組織纤勒，一個(gè)樣品的蛋白質(zhì)抽提充分，而另外一個(gè)樣品蛋白抽提不充分摇天，就會導(dǎo)致兩條帶不一樣泉坐，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能孤钦，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE纯丸，如果兩個(gè)條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因?yàn)閰⒖嫉暮繙y定結(jié)果不準(zhǔn)確引起的俊扭，這時(shí)候需要重新定量滑凉。
脫鹽
蛋白提取后，還需要做脫鹽處理咒钟，我們來看看可以用哪些方法實(shí)現(xiàn)若未。
超濾：可以截留10kDa及以上的蛋白分子粗合，適用于體積較小的樣品。操作步驟可以是隙疚，從100μL超濾濃縮到40μL供屉，再加緩沖液至100μL溺蕉，再超濾到40μL悼做，反復(fù)幾次。事實(shí)上漓雅，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在腐泻，但當(dāng)這些污染物的濃度降到一定程度時(shí)吃衅，則樣品的純凈度我們認(rèn)為是可以接受的了徘层。
Tips:
樣品中的尿素濃度需要控制在1M以下才能不對樣品造成影響利职，我們提取蛋白時(shí)使用的是8M尿素，直接稀釋8倍的話跷敬，造成樣品體積太大热押，下一步加入酶后，則酶和蛋白的濃度會特別低拥褂，酶解效果受到很大影響牙寞。另外间雀，體積太大處理起來也不方便。這時(shí)也可以使用超濾的方法惹挟，多步稀釋连锯，將尿素的濃度降到1M以下党巾。
透析：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子霜医，適用于體積比較大的樣品驳规，比如尿液吗购，可以將鹽透析至外面的透析液里。
丙醇沉淀：-20℃丙酮（V樣品：V冷丙酮=1：3以上）沉淀2個(gè)小時(shí)以上镀梭。
C18色譜柱脫鹽法：Waters公司生產(chǎn)的XBridge C18色譜柱踱启，利用柱子上的填料與蛋白結(jié)合，而鹽類物質(zhì)則流穿過去透罢，從而達(dá)到分離的目的冠蒋。
還原烷基化及酶解
脫鹽完成以后抖剿，接下來我們就要進(jìn)行相當(dāng)重要的一步：還原烷基化及酶解。整個(gè)流程脑融，大伙兒看下面這張圖：
這里面有兩件事要先跟大伙兒聊聊孽拷。
首先，我們來說說為什么步驟里要把丙酮沉淀放在烷基化以后膜宋。通過之前的學(xué)習(xí)炼幔，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑乃秀、還原劑等圆兵，而蛋白是不會在丙酮中溶解的枢贿，而是會沉淀下來，這樣就達(dá)到了去除雜質(zhì)的目的超凳。
烷基化以后耀态，球狀蛋白變成鏈狀首装，再通過丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物，然后復(fù)溶（即重新溶解驰吓，以備下一步酶解操作）桨醋，那么鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復(fù)溶效果會更好，可以避免因?yàn)閺?fù)溶不充分而造成的損失偎蘸。因此瞬内，丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。
另外章咧，關(guān)于酶切這一步能真，有些抗體如果只用胰酶進(jìn)行酶切粉铐，由于酶切位點(diǎn)太少，導(dǎo)致切出來的肽段太長程剥，不便于質(zhì)譜檢測汤踏。這種情況下可以結(jié)合其它酶舔腾，比如Lys-C稳诚，進(jìn)行多酶酶切盾饮，使肽段變得短一些。經(jīng)過測試我們發(fā)現(xiàn)，用Lys-C+胰酶酶切徘钥，比只用胰酶酶切肢娘，可以提高10%-20%的鑒定率。
酶解需要在buffer體系下完成而钞，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發(fā)拘荡，pH 7-8）最為常用珊皿，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽粉臊，10-100mM）驶兜。
Tips:
如果做iTRAQ（或TMT）標(biāo)記抄淑，最好用TEAB，而不是碳酸氫銨體系蝇狼。因?yàn)閕TRAQ（或TMT）試劑是標(biāo)記末端氨基迅耘，碳酸氫銨上的氨基也會被標(biāo)記上监署，影響蛋白的標(biāo)記效率钠乏。
酶的用量可以參考以下的公式：
W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50
此外春塌，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素俏拱，且不能與SDS同時(shí)使用吼句。
蛋白質(zhì)及肽段的預(yù)分級
前面提過惕艳，質(zhì)譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產(chǎn)生抑制劣纲，并且質(zhì)譜儀反應(yīng)也需要一定的時(shí)間谁鳍。例如棠耕，人的細(xì)胞內(nèi)通常會表達(dá)20300種蛋白，它們酶解后辉巡，每種蛋白會產(chǎn)生10-20種肽段蕊退，那么就有幾十萬種肽段，質(zhì)譜很難同時(shí)檢測到這么多種肽段净蚤。所以對肽段混合物進(jìn)行分級今瀑，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結(jié)果屿附。
我們既可以從蛋白水平進(jìn)行分離哥童，也可以從肽段水平進(jìn)行分離贮懈，還可以將多種分離手段結(jié)合起來。從蛋白水平的分離各聘，大家都比較熟悉吧撬呢？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術(shù)魂拦，利用蛋白質(zhì)的分子量搁嗓、形狀腺逛、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)的不同，將混合在一起的蛋白質(zhì)分開安疗。
第二種分離方案是在肽段水平上進(jìn)行够委，根據(jù)肽段的不同性質(zhì)，使用不同填料進(jìn)行分離玉罐。
SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質(zhì)的強(qiáng)陽離子交換柱吊输，可以與陽離子結(jié)合铁追，并通過buffer進(jìn)行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來扭屁，達(dá)到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的疯搅。
SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換柱，可以與陰離子結(jié)合罪治，并通過buffer進(jìn)行離子交換礁蔗，將陰離子分離和洗脫出來，達(dá)到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的晒骇。
RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱洪囤，與正相柱在表面鍵合極性官能團(tuán)不同撕氧，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團(tuán)，例如剥啤，鍵合十八烷基官能團(tuán)府怯，稱為C18柱防楷，其它常用的還有C8，C4和C2等赘被。這里我們選用C18柱肖揣，根據(jù)肽段疏水性的不同民假，達(dá)到分離的目的。
HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物龙优。由于強(qiáng)極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差羊异，很難將它們分開事秀，而親水色譜柱卻可以用來固定強(qiáng)極性的肽段，并結(jié)合高比例有機(jī)相與低比例水相組成的流動相野舶，來實(shí)現(xiàn)分離的目的易迹，且這樣的流動相組成尤其有利于提高電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）的靈敏度。
High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件平道，結(jié)合pH2的RPLC酸性條件，進(jìn)行分離一屋。
Tips:
通常窘疮，我們通過RPLC與質(zhì)譜聯(lián)用。因?yàn)镽PLC體系是用水和乙腈冀墨，易揮發(fā)闸衫，不含鹽，可以直接送入質(zhì)譜進(jìn)行檢測诽嘉。而像SCX/SAX這類正相柱蔚出，需要通過高鹽的體系將樣品洗脫下來，所以它與質(zhì)譜不兼容虫腋。我們在做多級分離時(shí)骄酗，前面都會有各種鹽的洗脫，最后才是RPLC悦冀，然后就可以直接連質(zhì)譜了酥筝。
多維分離：例如，先從蛋白水平進(jìn)行分離雏门，再從肽段水平進(jìn)行分離，或者多種肽段水平的分級分離結(jié)合起來使用掸掏。接下來我們重點(diǎn)聊一下各種多維分離的策略和效果茁影。
我們先來看看上面這張圖。左上角的“A圖“展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個(gè)餾分丧凤，然后進(jìn)行叉開的合并募闲，合并為20個(gè)餾分，這樣的合并可以讓樣品中的肽段分布更加均勻愿待。
右上角的”B圖”展示的是通過SDS-PAGE進(jìn)行分離浩螺，也分成20個(gè)餾分，然后用兩種合并方案仍侥，分別合并為5個(gè)餾分和6個(gè)餾分要出，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。
左下角的“C圖”針對同一種樣品农渊，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進(jìn)行了比較患蹂，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過兩種分離方法后，有5408個(gè)蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的传于，而用SDS-PAGE分離囱挑，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個(gè)圖上看沼溜，兩種方法有互補(bǔ)性平挑。
右下角的四幅小圖說明，當(dāng)我們在做分級分離時(shí)系草，分的級別越多通熄，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長并不是呈線性關(guān)系的悄但，分級的級數(shù)達(dá)到一定程度時(shí)棠隐，能鑒定到的蛋白數(shù)量的增長就會飽和。所以比較省時(shí)省力又能保證效果的做法時(shí)檐嚣，選擇一個(gè)合適的分級數(shù)即可助泽。
我們來看一下目前發(fā)表的文獻(xiàn)里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數(shù)量嚎京。
一篇2013年發(fā)表在MCP上的文獻(xiàn)報(bào)道嗡贺，采用RP-RPLC兩級分離，分成常規(guī)的24個(gè)餾分鞍帝，上樣量為100μg诫睬，在一天內(nèi)能檢測到8000多個(gè)蛋白。
一篇2013年發(fā)表在Nat Comm上的文獻(xiàn)報(bào)道帕涌，先采用RP柱分級摄凡，再使用SAX分離，然后通過1米的長柱子反相色譜分離蚓曼。樣品為人的胚胎干細(xì)胞亲澡，上樣量仍然為100μg，在線分離8天檢測了9818個(gè)蛋白纫版，如果分離時(shí)間延長到24天床绪，則可以檢測13075個(gè)蛋白。
一篇2014年發(fā)表在Nat Method上的文獻(xiàn)報(bào)道其弊，采用IEF（等電聚焦電泳癞己，isoelectric focusing）與RPLC結(jié)合，樣品是人的上皮癌細(xì)胞梭伐，上樣量為800μg痹雅，分成了360個(gè)餾分，耗時(shí)超過15天籽御，一共分析到13078個(gè)蛋白练慕。
就像前面說到的惰匙，對蛋白及多肽分離的級數(shù)越多，能鑒定到的蛋白也就越多铃将，但常常因?yàn)闄C(jī)時(shí)的限制项鬼，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個(gè)權(quán)衡劲阎。比如常規(guī)的分10個(gè)餾分绘盟，基本上可以鑒定到5000-8000個(gè)蛋白。如果是血清樣品悯仙，可以餾分更多一些龄毡，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個(gè)餾分锡垄，再合并為10或20個(gè)餾分沦零，比直接分成10個(gè)或20個(gè)餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！
Tips:
對于分餾分货岭，通常是利用C18的色譜柱來分級分餾分路操，這個(gè)沒有試劑盒。
樣品前處理的各個(gè)步驟就介紹到這千贯，下篇將繼續(xù)分享樣品前處理的最新方法與進(jìn)展
