說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成色冀，侵刪缤弦。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。

主要知識(shí)點(diǎn)：
針對(duì)不同的樣品類型提取蛋白質(zhì)的步驟和方法：

• 動(dòng)物組織樣品
• 動(dòng)物細(xì)胞樣品
• 石蠟包埋樣品
• 植物組織樣品
• 細(xì)菌樣品
• 體液樣品
• 從亞細(xì)胞器中提取蛋白

動(dòng)物組織樣品

image

第一步：剪碎去血

將樣品放入PBS緩沖溶液中剪碎饲帅，倒掉變色的溶液虑鼎，換入新的PBS，繼續(xù)剪刃永，一遍一遍地重復(fù)货矮，直到PBS溶液不變色為止。比如肝臟組織斯够，洗完后整個(gè)是一個(gè)偏黃色的組織囚玫。在這個(gè)過程中，我們需要用剪刀和鑷子剝離血管組織和脂肪組織等读规，這些組織的存在會(huì)對(duì)我們對(duì)樣品抓督，比如肝臟組織的蛋白質(zhì)類型產(chǎn)生干擾。去血的過程中同時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑束亏。

第二步：稱重

為了稱量更精確铃在，洗滌之后可以用濾紙將樣品吸干，然后再稱重，能比較準(zhǔn)確地知道我們大約使用了多少組織樣品定铜。

第三步：碎裂

碎裂樣品的方法在上一篇推文里有詳細(xì)的介紹阳液，包括液氮研磨、勻漿等機(jī)械破碎揣炕，溫差法帘皿、壓力法等物理破碎，以及加入變性劑等化學(xué)處理法畸陡。通常情況下呢鹰溜，用液氮研磨就夠了，研磨到完全變成粉狀罩锐。但如果用單一的方法破碎效果不好奉狈，或者操作起來工作量太大卤唉，也可以進(jìn)行多方法的組合涩惑。比如十幾個(gè)或幾十個(gè)樣品，完全靠手工的液氮研磨桑驱，跟去健身房玩一圈的運(yùn)動(dòng)量估計(jì)也差不多了竭恬，累成狗！這時(shí)候可以考慮使用組織破碎儀熬的，一次可以做八個(gè)十個(gè)的痊硕，一起震碎，那就輕松多了押框。

第四步：裂解

破碎以后岔绸，加入裂解液，反復(fù)震蕩橡伞，讓樣品充分溶解盒揉，裂解液的用量通常是

組織重量：裂解液的體積=1：5

也就是說，1克組織兑徘，通常加入5ml的裂解液刚盈。

在裂解時(shí)，眼睛不要只顧著看手機(jī)或者盯著天花板發(fā)呆挂脑，要好好觀察樣品的情況藕漱，如果發(fā)現(xiàn)仍然有大塊的組織，或者很多絮狀的組織崭闲，則說明上一步碎裂的工作做得還不夠肋联。這時(shí)可以加入超聲的方法，或者用組織勻漿器進(jìn)一步碎裂刁俭，從而保證蛋白提取比較成功牺蹄。

有哪些裂解液可選呢？

• 4%SDS薄翅，溶解性特別強(qiáng)沙兰，很適合對(duì)膜蛋白或疏水性蛋白的提让ツ巍；

• 常規(guī)的8M尿素鼎天，也不弱舀奶。

Tips
如果用的是4%SDS，千萬不要用超聲進(jìn)一步碎裂斋射！因?yàn)镾DS是一種強(qiáng)去污劑（十二烷基磺酸鈉育勺，我們平常用的洗衣粉里就有），如果進(jìn)行超聲罗岖，會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫涧至，既達(dá)不到很好地溶解樣品的目的，又引來干擾桑包，搞得我們很難控制提取蛋白的過程南蓬。

第五步：離心

裂解并震蕩以后，4℃ 12000rpm離心半小時(shí)哑了，然后吸取上清液赘方。

特別注意：
有些樣品脂肪比較多，比如小鼠肝臟樣品弱左，可以看到提取時(shí)上面有很大一層浮油窄陡，下面還有一堆沉淀，如果是新手拆火，又自我要求很高跳夭，通常會(huì)想要把所有清液都吸取出來，不浪費(fèi)一點(diǎn)樣品们镜。這其實(shí)很難做到币叹！弄得不好，就會(huì)帶入脂肪組織和沉淀組織憎账，給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)引入污染套硼，造成更多的損失，得不償失鞍濉邪意！推薦的做法是：吸取離上層浮油及下層沉淀都有一定距離的中間部分，這樣取出來的蛋白就純凈多了反砌。

說到這里雾鬼，插一句，以往的經(jīng)驗(yàn)宴树，常規(guī)小鼠和人的組織樣品策菜，提取效率大約為0.7%，也就是說，如果有100mg的組織又憨，能提到的蛋白大概是700 μg 翠霍。做常規(guī)的質(zhì)譜分析，有100-200mg的蛋白就夠了蠢莺。如果樣品充足寒匙，我們可以分成幾份，先提取一部分做實(shí)驗(yàn)試試躏将，整個(gè)流程走下來沒問題的話锄弱，再提一部分，這樣也比較保險(xiǎn)祸憋，不會(huì)出現(xiàn)全軍覆沒的慘劇会宪。余下的樣本，還可以做做Western驗(yàn)證或者酶活啥的蚯窥。

如果樣品量特別少掸鹅，例如小鼠卵巢，一共也就黃豆那么大沟沙，這種情況下可不能用液氮研磨河劝，因?yàn)榇蟛糠謽悠范紩?huì)被刮到研缽的壁上壁榕，損失很大矛紫！可選的方案是：將小鼠卵巢放進(jìn)試管里，直接在管子里剪碎去血牌里，加入裂解液颊咬，用組織破碎儀或者超聲破碎，也可以用4%SDS提饶盗伞（ 95℃喳篇，5分鐘）。這種情況就不要弄太多的碎裂步驟了态辛，步驟越少麸澜，樣品的損失就越少。

動(dòng)物細(xì)胞樣品

針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞樣品的處理方法有很多奏黑，我們來看看幾種常見的套路：

A． 最簡(jiǎn)單的方法：

把細(xì)胞從培養(yǎng)皿里取出來炊邦，先加入PBS把培養(yǎng)基洗掉，再加入裂解液熟史，通常25mm的培養(yǎng)皿加入400-700μL裂解液馁害。然后用細(xì)胞刮直接刮取培養(yǎng)皿表面，不停地刮蹂匹，相當(dāng)于是一個(gè)機(jī)械力的破裂碘菜，而細(xì)胞表面是最容易進(jìn)行破裂的。刮完后收集裂解液和細(xì)胞樣品到EP管里，然后進(jìn)行冰上裂解忍啸。這是最快最直接有效的方法仰坦。

Tips:
通過測(cè)試發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的保存比組織樣品或細(xì)胞樣品的保存來得更加穩(wěn)定计雌，所以拿到細(xì)胞后直接提取出來蛋白進(jìn)行保存更好缎岗。

B．多組細(xì)胞平行實(shí)驗(yàn)處理方法：

當(dāng)需要處理多組細(xì)胞，而每組細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間有間隔時(shí)白粉，如果希望后續(xù)的分析是平行的传泊，那么可以先分別胰酶消化以后，收集每組細(xì)胞鸭巴，液氮或者-80℃保存眷细。等各組細(xì)胞都收集好后，加入裂解液鹃祖，不超過200W超聲溪椎，放在冰上操作。由于不能用SDS（超聲時(shí)會(huì)引起大量的泡泡）恬口，這種情況下校读，常用的是8M尿素或2M硫脲。超聲一定要在冰上進(jìn)行祖能，因?yàn)闇囟忍貏e高歉秫，很容易超過37℃，循環(huán)周期的時(shí)間通常會(huì)設(shè)定為：5秒超聲养铸，停4-5秒雁芙，再5秒超聲，反復(fù)钞螟，整個(gè)過程持續(xù)5分鐘左右兔甘。

C．反復(fù)凍融法：

這種方法用得比較少，因?yàn)闅埩舻募?xì)胞殘片還是比較多鳞滨，我們認(rèn)為提取是不充分的洞焙。

D．化學(xué)處理法：

也是非常簡(jiǎn)單粗暴的方法，直接加入4%SDS拯啦，95℃水浴澡匪，1-5分鐘即可。

通常情況下提岔，我們要求細(xì)胞量需要達(dá)到1E6的數(shù)量級(jí)仙蛉。當(dāng)然，有一些新發(fā)展出來的方法碱蒙，需要的細(xì)胞量會(huì)非常少荠瘪，比較南方醫(yī)科大學(xué)田瑞軍老師課題組做過1000個(gè)細(xì)胞的蛋白提取夯巷，但這些新方法對(duì)操作的要求也很高，如果你還是個(gè)新手哀墓，沒有足夠的經(jīng)驗(yàn)趁餐，直接拿新方法來做，風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)比較高了篮绰。

石蠟包埋樣品

對(duì)于這類樣品的處理后雷，去石蠟是比較麻煩的事情。在石蠟包埋過程中吠各，樣品中的蛋白質(zhì)或脂肪會(huì)用福爾馬林或甲醇固定臀突，形成交聯(lián)狀的結(jié)構(gòu)，從中提取蛋白是非常困難的贾漏。難歸難候学，遇到了還是要迎難而上，咱們得想一些合適的辦法把蛋白有效地提取出來纵散。通過很多次的摸索和實(shí)踐梳码，以下是比較可行的處理步驟：

第一步：去石蠟，先用二甲苯室溫浸泡5分鐘伍掀，兩次掰茶，再換甲醇室溫浸泡5分鐘，兩次蜜笤”艚看起來很簡(jiǎn)單，但整個(gè)過程中會(huì)經(jīng)過混旋瘩例。

第二步：蛋白裂解啊胶，因?yàn)榈鞍妆桓栺R林或甲醇固定得非常緊了甸各，有的人會(huì)選擇加入水垛贤，讓樣品泡漲，我們更推薦加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT）趣倾，充分水化被固定的蛋白樣品聘惦，然后勻漿和超聲。

第三步：水化之后儒恋，加入4%SDS善绎。對(duì)于4%SDS，通常的處理?xiàng)l件是95℃诫尽，5分鐘禀酱，但對(duì)于石蠟樣品，交聯(lián)特別厲害牧嫉，所以推薦95℃下處理60分鐘剂跟，再冷卻到室溫减途。

Tips：
SDS并沒有在第二步裂解的時(shí)候就加入，是因?yàn)檫@一步需要使用超聲曹洽，如果加入了會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫鳍置。所以我們先讓樣品在一個(gè)緩沖體系里充分水化和擴(kuò)展，在第三步再加入SDS高溫孵育送淆，之后冷卻至室溫進(jìn)行提取税产。

第四步：離心，參數(shù)為最大相對(duì)離心力16,000 g偷崩，離心10分鐘辟拷，取上清，就達(dá)到分離的目的了阐斜。

石蠟包埋樣品提取的效率通常是梧兼，一平方毫米樣品可提取一微克蛋白，大家可以通過這個(gè)效率值對(duì)樣品中能提取的蛋白進(jìn)行估算智听。

植物組織樣品

image

對(duì)于植物組織樣品羽杰，難點(diǎn)就在于細(xì)胞壁及葉綠素的去除。

第一步：充分再充分地研磨到推。由于細(xì)胞壁十分強(qiáng)壯考赛，所以一定要好好地研磨，充分碎裂莉测。一般的勻漿根本搞不定細(xì)胞壁颜骤，沒辦法碎得充分。

第二步：去色素捣卤∪坛椋可以通過有機(jī)溶劑多次反復(fù)沉淀樣品來去除色素，比如丙酮董朝、TCA（三氯乙酸）鸠项、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的樣品子姜，這樣可以把葉綠素去掉祟绊。

第三步，離心取沉淀哥捕，然后加入裂解液牧抽，讓蛋白充分地溶解。

第四步：進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提遥赚。在抽提的過程中扬舒，要看細(xì)胞的破碎程度或者樣品的類型，葉片樣品相對(duì)來說比較簡(jiǎn)單凫佛，莖的樣品比較麻煩讲坎，它的纖維組織比較大泽腮，再加上植物細(xì)胞壁又比較厚，所以我們得用超聲衣赶、震蕩诊赊，以及各種方法組合，進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提府瞄。

第五步：離心取上清碧磅，就得到了蛋白溶液。

根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)遵馆，像葉片這類的樣品鲸郊，處理起來比較簡(jiǎn)單，例如水稻的葉片組織提取出來可以做到8000多個(gè)蛋白货邓；根的樣品稍微麻煩一點(diǎn)秆撮，因?yàn)楹刻貏e多准验，先得烘干氓拼，盡量去掉它的水份，干燥后再進(jìn)行研磨提取镜撩。否則戈二，我們可能會(huì)加入很多根舒裤，但其實(shí)能提取的樣品并沒有多少【蹩裕花的組織腾供，比如桃花、梨花鲜滩，也是水分太多的問題伴鳖，需要先干燥。種子組織徙硅，例如花生榜聂，在破碎成粉后，也需要多次使用有機(jī)溶劑去掉它的脂肪闷游。

總之峻汉，根、莖脐往、葉、果實(shí)等扳埂，根據(jù)不同的樣品類型业簿，我們需要根據(jù)它的特點(diǎn)設(shè)計(jì)不用的處理步驟，簡(jiǎn)單來說阳懂，就是通過有機(jī)試劑去掉它的色素和脂肪組織梅尤，水分太多的先烘干再提取柜思，常規(guī)情況就是研磨和去色素。大家清楚了各種處理的用處之后巷燥，就可以針對(duì)自己的樣品靈活地處理了赡盘。比如棉花樣品，因?yàn)樗w維特別多缰揪，你可能就會(huì)想到得通過研磨和反復(fù)沉淀來進(jìn)行純化陨享，再進(jìn)行后續(xù)分析。

細(xì)菌樣品

與植物樣品類似钝腺，細(xì)菌樣品的細(xì)胞壁也是我們提取蛋白的最大障礙抛姑，尤其是像革蘭氏陽性菌，以及一些細(xì)菌的亞型艳狐，細(xì)胞壁特別厚定硝，破碎的時(shí)候需要更強(qiáng)的參數(shù)，更長(zhǎng)的時(shí)間毫目。

image

劉曉慧老師分享了兩個(gè)她遇到的例子：有一次做細(xì)菌樣品蔬啡，不巧它就是一個(gè)細(xì)胞壁特別厚的亞類，最開始采用急熱驟冷镀虐，即從-80℃冰箱取出星爪，95℃煮1分鐘，反復(fù)幾次粉私，然后超聲顽腾，但是提出來的蛋白量特別少。最后還是用了液氮研磨的方法诺核，研磨之后再加入裂解液抄肖，才提取出大量的蛋白。所以窖杀，對(duì)于細(xì)菌的樣品漓摩，我們可以嘗試多種方法，測(cè)試一下入客。

還有一次做酵母樣品管毙，在做超聲的時(shí)候，因?yàn)橛悬c(diǎn)事情離開了桌硫，所以超聲的時(shí)間就特別長(zhǎng)夭咬，并且?guī)状纬曋g做了急熱驟冷處理。另一位同事使用同樣的方法铆隘，只是超聲時(shí)間比較短卓舵。最后發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間長(zhǎng)的樣品，破碎地非常好膀钠，顯微鏡下看到的都是酵母的碎片掏湾，提取到的蛋白也很多裹虫，而超聲時(shí)間短的提取到的蛋白就少很多。所以我們?cè)谒榱褬悠窌r(shí)融击，也可以多嘗試幾種方法筑公，幾種參數(shù)。

體液樣品

體液樣品難點(diǎn)在于高豐度蛋白的去除尊浪。以血清為例匣屡，前14種高豐度蛋白占血清總蛋白的95%以上。而質(zhì)譜是一種離子飽和性檢測(cè)器际长，低豐度離子的信號(hào)很容易被高豐度的抑制耸采，從而無法檢測(cè)到。

我們有很多辦法去掉高豐度蛋白工育。當(dāng)然虾宇，有些情況下，為了保證樣品的完整性如绸，也有人不去除高豐度蛋白嘱朽，這個(gè)視具體情況而定。另外怔接，高豐度蛋白可能還會(huì)與一些低豐度蛋白相結(jié)合搪泳，當(dāng)我們?nèi)サ舾哓S度蛋白時(shí)，往往就會(huì)將這些有意義的低豐度蛋白也去掉扼脐，無法保證分析的完整性岸军。針對(duì)這種情況，用普通的shotgun方法是很難解決的瓦侮，后面我們會(huì)介紹一種方法艰赞，它在高豐度蛋白存在的情況下，仍然可以穩(wěn)定地可重復(fù)地鑒定到很多中低豐度的蛋白肚吏。

要去除高豐度蛋白方妖，很多商業(yè)試劑盒都可以幫到我們。它們的原理各有不同罚攀，我們來看幾個(gè)比較常用的党觅。

第一種是Bio-Rad的Proteominer試劑盒。

image

這類試劑盒的原理是：通過一個(gè)六肽配基與高豐度蛋白結(jié)合斋泄，從而進(jìn)行去除杯瞻。這種方法是非抗體型的，沒啥特異性是己，它不受物種限制和樣品類型限制又兵。當(dāng)樣品進(jìn)來時(shí)，六肽配基會(huì)優(yōu)先結(jié)合豐度高的蛋白質(zhì)卒废，豐度低的嘛沛厨，結(jié)合的機(jī)會(huì)小很多，于是就達(dá)到了分離去除的目的摔认。

通過這個(gè)辦法處理后逆皮，最終能鑒定到的蛋白也是比較多的，從鑒定的數(shù)量上看参袱，與安捷倫的特異性試劑盒差不多电谣。但如果要發(fā)高分的文章，用這種方法容易受到質(zhì)疑抹蚀，也是因?yàn)樗奶禺愋圆粡?qiáng)剿牺，去高豐度有一定的隨機(jī)性，高分雜志不太接受這種隨機(jī)的方法环壤。但如果你的樣品體積特別大晒来，可以先試著用Proteominer做一次，接下來再使用一些特異性的去高豐度蛋白的方法郑现∨缺溃或者你的樣品沒有特異性抗體柱可以用的話，也可以考慮這種方法接箫。

第二種是安捷倫的MARS柱攒读。它含有14種蛋白抗體，針對(duì)血清中的高豐度蛋白能很有針對(duì)性地去除辛友，需要的樣品量通常為20μL-40μL薄扁，20μL的血清樣品可以得到約100微克的蛋白樣品，40μL的量足夠我們做一次iTRAQ或label free實(shí)驗(yàn)了废累。

image

第三種試劑盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的試劑盒邓梅，可以去兩個(gè)高豐度蛋白。現(xiàn)在出了一個(gè)去20個(gè)高豐度蛋白的試劑盒九默，這是基于抗體方法震放，針對(duì)性很強(qiáng)，是比較公認(rèn)的方法驼修。

第四種是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns殿遂，2015年MCP上發(fā)表了一篇文獻(xiàn)，里面用到這個(gè)試劑盒乙各，先是用特異性柱子去掉14個(gè)高豐度蛋白墨礁，然后再特異性去掉50個(gè)中豐度的蛋白，最后可以鑒定到5300多個(gè)血清蛋白質(zhì)耳峦。對(duì)比現(xiàn)在常規(guī)的方法恩静，通常只能鑒定到500-600個(gè)血清蛋白，如果高豐度蛋白去除得比較好，用QE的方法做驶乾，也只能鑒定到1000個(gè)左右蛋白邑飒。這篇文章鑒定出了5300個(gè)蛋白質(zhì)，在血清樣品的蛋白鑒定中確實(shí)是一個(gè)相當(dāng)outstanding的結(jié)果了级乐。

image

以上是四種比較常用的去高豐度的試用盒疙咸。總的來說风科，針對(duì)像尿液這類體積很大的樣品撒轮，可以用Proteominer的方法，因?yàn)槠溆嗟幕诳贵w的方法都對(duì)蛋白含量有所要求贼穆。去掉高豐度蛋白后题山，我們可以對(duì)尿液先進(jìn)行濃縮，使它的濃度達(dá)到50μg/μL或更高故痊，再進(jìn)行后續(xù)的蛋白提取顶瞳，效果會(huì)更好。另外崖蜜，尿液樣品也可以通過沉淀的方法對(duì)蛋白進(jìn)行提取浊仆。

另外，像腦脊液樣品豫领，也可以通過Proteominer方法進(jìn)行提取抡柿，它的蛋白含量也比較低。劉曉慧老師組嘗試過用安捷倫的特異性去除14個(gè)高豐度蛋白的試劑盒與Proteominer的隨機(jī)去除6個(gè)高豐度蛋白試劑盒進(jìn)行比較等恐，最后能檢測(cè)到的蛋白結(jié)果都差不多洲劣。

亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)提取

image

針對(duì)亞細(xì)胞器的提取，我們分幾步來完成：

第一步：對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行勻漿课蔬，不需要?jiǎng)虻梅浅Ｋ榇鸦ǔ騻€(gè)10-20下就可以了；

第二步：初步分離二跋，使用差速離心的方法战惊，具體說明見上圖。

第三步：用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行再分離扎即。蔗糖密度梯度是連續(xù)的吞获，那么相應(yīng)的亞細(xì)胞器會(huì)在等密度的蔗糖密度區(qū)間內(nèi)沉積。于是谚鄙，可以將溶酶體各拷、線粒體，以及其它微體分開闷营。然后取出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞器烤黍，再進(jìn)行裂解和提取。

Tips:
蔗糖密度梯度離心需要使用超速離心機(jī)，平衡及各方面控制都需要比較精準(zhǔn)速蕊，所以操作時(shí)特別需要小心嫂丙。

第四步：對(duì)亞細(xì)胞器進(jìn)行驗(yàn)證。這一步需要引入Western互例，比如用到一些線粒體特異的抗體奢入，或者細(xì)胞膜筝闹、細(xì)胞核特異的抗體媳叨，進(jìn)行樣品純度的確證，之后再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)关顷。否則糊秆，如果樣品中有污染，會(huì)給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)帶來很難解釋的問題议双。

以上是針對(duì)不同樣品的蛋白提取方法痘番，下一篇將繼續(xù)分享樣品前處理的余下幾步，即蛋白提取的質(zhì)量控制平痰、脫鹽汞舱、還原烷基化和酶解。