影響因子：6.1

研究概述：

系統(tǒng)性硬化癥(SSc)是一種以組織纖維化為特征的自身免疫性疾病，可發(fā)生在軀干和蚪、四肢和內(nèi)臟器官的皮膚中止状。由于缺乏可以停止或逆轉(zhuǎn)纖維化過程的治療方法，肺纖維化可導(dǎo)致間質(zhì)性肺病(ILD)的發(fā)生攒霹，這也是SSc死亡的主要原因怯疤。根據(jù)SSc亞型和用于定義不同國家ILD的標(biāo)準(zhǔn)，SSc患者ILD的患病率在25%至90%之間催束；而系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)的間質(zhì)性肺病(SSc-ILD)主要發(fā)生在30-55歲的女性中集峦。特發(fā)性肺纖維化(IPF)在大約60-75歲的男性中更為普遍。SSc-ILD比IPF發(fā)生得更早、進(jìn)展更快塔淤。研究發(fā)現(xiàn)摘昌，巨噬細(xì)胞通過吸引免疫細(xì)胞和刺激膠原過度產(chǎn)生在肺纖維化中起著關(guān)鍵作用。目前高蜂，以確定了三種類型的巨噬細(xì)胞(FCN1聪黎，F(xiàn)ABP4和SPP1)參與肺纖維化的發(fā)病機(jī)制。攜帶MERTK和LGMN的SPP1巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)促纖維化活性备恤。而SPP1巨噬細(xì)胞組在SSc-ILD和IPF中表達(dá)上調(diào)稿饰。本研究旨在通過單細(xì)胞分析以確定SSc-ILD和IPF之間的差異，同時(shí)闡明其獨(dú)特的病因露泊，為該疾病的預(yù)防和治療提出指導(dǎo)方向喉镰。

研究結(jié)果：

ILD樣本分析

作者首先對四名IPF患者、三名SSc-ILD患者和來自GSE159354數(shù)據(jù)集的三名HCs樣本(健康對照組)進(jìn)行了scRNA-seq(圖1A)惭笑，并通過使用Seurat軟件對過濾后的基因進(jìn)行了批量校正侣姆。接著，作者對兩組SSc-ILD或伴HCs的IPF患者的樣本進(jìn)行了生物信息學(xué)分析脖咐，共分析了約200500個細(xì)胞(圖1B)。最終在含有HCs的SSc-ILD組中鑒定出19個簇(圖1C)汇歹，在和含有HCs的IPF組中鑒定出23個簇(圖1D)屁擅。而根據(jù)用于注釋和識別簇的標(biāo)記基因發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞簇相似(圖1C, D)。

肺巨噬細(xì)胞執(zhí)行SSc-ILD特異性的MAPK信號通路

作者通過對所有樣本的富集分析發(fā)現(xiàn)有2個聚類組與肺纖維化高度相關(guān)：炎癥過程和補(bǔ)體級聯(lián)以及傷口愈合過程(圖1E)产弹。由于這兩組樣本(SSc-ILD, IPF)表現(xiàn)出相似的聚類模式和GO富集結(jié)果派歌，作者進(jìn)一步進(jìn)行了MCODE分析。結(jié)果顯示痰哨，在SSc-ILD組中發(fā)現(xiàn)了絲裂原活化激酶磷酸酶(MAPK)信號通路胶果，但在IPF組中沒有。因此斤斧，作者想確定哪一組細(xì)胞執(zhí)行了MAPK早抠。通過對成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞撬讽、單核細(xì)胞蕊连、肺泡巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的KEGG富集分析分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞執(zhí)行執(zhí)行了MAPK(圖S1G-J, 圖1F)游昼；相比之下甘苍，IPF中的同一組巨噬細(xì)胞經(jīng)歷了Th17細(xì)胞分化(圖1F)。

單核細(xì)胞來源的肺巨噬細(xì)胞

在簇2烘豌、簇4和簇7的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中载庭，差異表達(dá)基因(DEGs)包括簇2中的FCN1、S100A8和IL1B；簇4中的APOC1囚聚、MARCO靖榕、FABP4和SPP1；以及簇7中的HLA-DPB1靡挥、GPR183和CCL3(圖2A)序矩。而根據(jù)CellMarker 2.0數(shù)據(jù)庫注釋，簇2跋破、4和7分別對應(yīng)于單核細(xì)胞簸淀、肺泡巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(圖2B)。為了確定這些簇內(nèi)巨噬細(xì)胞的來源毒返，作者進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-seq擬時(shí)序分析以區(qū)分這三種細(xì)胞類型之間的相似性租幕。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從單核細(xì)胞開始到達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞拧簸，首先必須穿過巨噬細(xì)胞劲绪；而從單核細(xì)胞到肺泡巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有不同的分化途徑。因此盆赤，作者推測巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞的關(guān)系更為密切贾富，而肺泡巨噬細(xì)胞可能更早到達(dá)肺組織并經(jīng)歷更多分化，最終導(dǎo)致與單核分子的顯著差異牺六。因此颤枪，作者得出結(jié)論，巨噬細(xì)胞更有可能是從單核細(xì)胞分化而來(圖2C)淑际。

SSc-ILD肺泡巨噬細(xì)胞亞群

最開始畏纲，作者使用已發(fā)表的數(shù)據(jù)集GSE212109，對5名SSc-ILD患者和6名HC患者的肺組織樣本進(jìn)行了分析(圖1A)春缕。在scRNA-seq分析中盗胀，作者共鑒定出27個簇(圖2D)。根據(jù)用于注釋簇和分配標(biāo)識的標(biāo)記基因锄贼，簇2和簇7對應(yīng)于單核細(xì)胞票灰；簇8對應(yīng)于巨噬細(xì)胞；簇1宅荤、簇3米间、簇12和簇26對應(yīng)于肺泡巨噬細(xì)胞。在肺泡巨噬細(xì)胞亞群中膘侮，簇1由表達(dá)FABP4和MARCO標(biāo)志物的細(xì)胞組成屈糊；簇3和簇26為表達(dá)SPP1的細(xì)胞組成；簇12由同時(shí)表達(dá)FAPB4和SPP1的細(xì)胞組成(圖2E)琼了。該結(jié)果與已發(fā)表的數(shù)據(jù)集GSE159354一致逻锐。在這里夫晌，作者確定了兩組簇4-肺泡巨噬細(xì)胞，一組具有關(guān)鍵基因FABP4和MARCO昧诱，另一組具有MARCO和SPP1關(guān)鍵基因(圖2A)晓淀。

細(xì)胞-細(xì)胞相互作用推斷(配體-受體相互作用)

鑒于基因表達(dá)的差異，作者接下來將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞間相互作用是如何導(dǎo)致SSc-ILD以及導(dǎo)致與IPF相比更早的疾病發(fā)作盏档。通過候選信號通路的細(xì)胞簇相互作用之間的功能差異凶掰，作者觀察到II型肺泡細(xì)胞、上皮細(xì)胞蜈亩、分泌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞在損傷后傾向于產(chǎn)生UGPR1懦窘、SAA和補(bǔ)體信號通路(圖3A, B)。UGPR1激活攜帶MARCO的肺泡巨噬細(xì)胞(圖3C)稚配，而補(bǔ)體信號通路影響肺泡巨噬細(xì)胞以驅(qū)動額外的免疫和修復(fù)反應(yīng)(圖3D)畅涂。相比之下，SAA作用于單核細(xì)胞并引發(fā)隨后的炎癥反應(yīng)(圖3E)道川。隨后午衰，肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生SPP1和BAFF(圖3F, G)。值得注意的是冒萄，SPP1不僅作用于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞進(jìn)行即時(shí)修復(fù)(圖3F)臊岸，還靶向單核細(xì)胞進(jìn)一步通過VEGF和VISFATIN信號通路啟動另一種修復(fù)途徑(圖3H, I)。而在單核細(xì)胞內(nèi)尊流，巨噬細(xì)胞的一個獨(dú)特亞群通過與內(nèi)皮細(xì)胞特異性相互作用來執(zhí)行這一信號通路帅戒。研究證實(shí)，BAFF與B細(xì)胞相互作用奠旺，產(chǎn)生被認(rèn)為與自身免疫反應(yīng)相關(guān)的自身抗體蜘澜。

IL-6通常被認(rèn)為是一種炎性細(xì)胞因子施流，作者觀察到IL-6并非由典型的免疫或炎性細(xì)胞產(chǎn)生的响疚，而是由成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生瞪醋，它作用于上皮細(xì)胞以促進(jìn)修復(fù)過程(圖3J)忿晕。作者還發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞，特別是肥大細(xì)胞银受，會產(chǎn)生ANNEXN践盼，主要作用于單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，而不影響巨噬細(xì)胞(圖3K)宾巍。研究表明咕幻，ANNEXIN通過甲酰肽受體(FPR)抑制炎癥反應(yīng)。然而顶霞，巨噬細(xì)胞缺乏膜聯(lián)蛋白FPR軸信號通路肄程。而當(dāng)巨噬細(xì)胞不受ANNEXIN抑制時(shí)锣吼，這可能是VEGF和VISFATIN持續(xù)作用的原因。

作者還發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在單核細(xì)胞的反饋抑制中起著關(guān)鍵作用蓝厌。在之前的研究中玄叠，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞具有FPR1和FPR2兩種膜聯(lián)蛋白受體。FPR1主要表現(xiàn)出抗炎作用拓提，而FPR2有助于單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞读恃，以實(shí)現(xiàn)外排細(xì)胞的作用。然而代态，在SSc-ILD中寺惫，一旦單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，F(xiàn)PR1和FPR2便都消失了(圖S2F)胆数，這使得肥大細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的反饋抑制被消除肌蜻。相比之下，IPF中的單核細(xì)胞僅具有FPR1必尼，分化為巨噬細(xì)胞后蒋搜，剩余的FPR1出現(xiàn)。因此判莉，在IPF中豆挽，肥大細(xì)胞的反饋抑制在單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中持續(xù)存在(圖S2G)券盅。

SSc-ILD的生物學(xué)途徑和發(fā)病機(jī)制

圖3L展示了SSc-ILD的生物學(xué)途徑帮哈。研究表明，當(dāng)肺組織中的前線細(xì)胞(如II型肺泡锰镀、上皮娘侍、分泌和杯狀細(xì)胞)暴露于外部或內(nèi)部損傷時(shí)，它們最初會向肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)送UGPR1信號泳炉。因此憾筏，肺泡巨噬細(xì)胞通過SPP1激活成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞，如肌纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞花鹅。內(nèi)皮細(xì)胞可通過內(nèi)皮細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(EndMT)和伴隨的微血管稀疏來充當(dāng)肌成纖維細(xì)胞的來源氧腰。隨后，通過IL6刨肃、ERK和pI3k-Akt通路驅(qū)動上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞繼續(xù)修復(fù)受損組織古拴，該修復(fù)過程有助于肺纖維化(圖3L)。

此外真友，肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的SPP1驅(qū)動單核細(xì)胞黄痪，在招募的單核細(xì)胞中，由于SSc的缺氧特性盔然，一些分化為特定的巨噬細(xì)胞激活VEGF和VISFATIN信號通路桅打，進(jìn)一步驅(qū)動下游p38-MAPK通路焕参。這一過程有助于肺纖維化的發(fā)展(圖3L)。雖然存在抑制肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的機(jī)制油额，特別是肥大細(xì)胞通過ANNEXIN抑制炎癥叠纷，但這種反饋機(jī)制并不作用于巨噬細(xì)胞。因此潦嘶，氧化應(yīng)激引起的炎癥無法被抑制涩嚣，導(dǎo)致惡性循環(huán)和炎癥誘導(dǎo)的肺纖維化的早期加速發(fā)作。肺泡巨噬細(xì)胞還通過BAFF驅(qū)動B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體掂僵，這可能會持續(xù)影響自身免疫航厚。

肺巨噬細(xì)胞MAPK信號通路的p38-MAPK和JUN

作者觀察到激活MAPK信號通路的巨噬細(xì)胞的這一特定亞群導(dǎo)致SSc-ILD的早期發(fā)作。隨后作者使用SCENIC來預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子(TFs)和推斷的靶基因锰蓬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩組調(diào)節(jié)子：第一組包BCLAF1幔睬、IRF1和NFE2L2；第二組包括JUN芹扭、FOS和FOSB(圖4A)麻顶。而在這兩個調(diào)控子組中，每個TF的靶基因都屬于MAPK信號通路(圖4B)舱卡。通過分析TF和靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)辅肾，BCLAF1調(diào)節(jié)IRF1、NFE2L2和JUN轮锥；同時(shí)矫钓，JUN受FOS和FOSB的調(diào)節(jié)，這會影響其下游基因(圖4C)舍杜。

轉(zhuǎn)錄因子的藥物靶向預(yù)測

由于巨噬細(xì)胞TFs是MAPK信號通路的重要靶點(diǎn)新娜。因此作者使用了DrugBank數(shù)據(jù)庫以繪制針對這些TFs的藥物圖譜。在潛在的藥物中既绩，作者選擇了對TFs具有下調(diào)作用的藥物概龄，并排除了具有爭議性性結(jié)果或?qū)ζ渌鸗Fs具有上調(diào)作用的藥物。此外熬词，我們將選擇范圍縮小到adjusted p <0.05 (表1)旁钧。最后發(fā)現(xiàn)二甲雙胍下調(diào)NFE2L2吸重。眾所值周互拾，二甲雙胍是一種雙胍類藥物，用于治療2型糖尿病嚎幸。它在其他疾病中也有優(yōu)勢颜矿，包括癌癥和肝腎疾病。研究也證實(shí)二甲雙胍可以以劑量依賴的方式抑制Raf和ERK的磷酸化嫉晶，從而進(jìn)一步抑制NFE2L2的表達(dá)骑疆。

研究總結(jié)：

本研究基于GEO的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集(GSE159354和GSE212109)田篇，通過對健康對照組、IPF組和SSc-ILD組的肺組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)箍铭，在SSc-ILD的肺損傷初期泊柬，成纖維細(xì)胞在SPP1肺泡巨噬細(xì)胞的影響下激活I(lǐng)L6通路。然而诈火，IL6似乎與其他炎癥和免疫細(xì)胞無關(guān)兽赁。同時(shí)，作者們還觀察到激活MAPK信號通路的巨噬細(xì)胞的特定亞群冷守。而與IPF相比刀崖，由于SSc-ILD缺乏來自膜聯(lián)蛋白的抑制反饋和自身免疫特性，作者推斷這可能是SSc-ILD發(fā)病較早和持續(xù)纖維化的原因拍摇。最后亮钦，作者鑒定出了兩種轉(zhuǎn)錄因子(BCLAF1和NFE2L2)以及它們與MAPK相關(guān)的下游靶基因，這可能是早期預(yù)防和治療的潛在治療靶點(diǎn)充活。同時(shí)蜂莉，作者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍下調(diào)了NFE2L2，而NFE2L2可以作為一種再利用的候選藥物混卵⊙灿铮總之，該研究發(fā)現(xiàn)SSc-ILD和IPF之間存在差異淮菠，這些差異可以作為早期預(yù)防和治療的潛在研究方向男公。