導語?
膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）干細胞中circMET高表達杆怕，同時鑒定出circMET可以在YTHDF2調(diào)控的m6A修飾基礎上翻譯產(chǎn)生MET404蛋白；MET404作為新鑒定的MET配體蚪腐，MET404可以激活MET受體超凳，刺激不依賴于HGF的下游效應物并驅(qū)動GBM的腫瘤發(fā)生钞澳。用EMT404的單克隆抗體增強了抗HGF/MET療法的功效怠惶，可以作為治療腦惡性腫瘤中的關鍵靶點。
研究背景?
膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是常見的原發(fā)性腦癌轧粟，即使采用了免疫治療策治，GBM患者的生存期仍只有12-15個月。GBM表現(xiàn)出顯著的瘤內(nèi)異質(zhì)性兰吟，其中高水平的MET表達在部分GBM腫瘤內(nèi)被發(fā)現(xiàn)通惫。
CircRNA是部分癌癥中（包括GBM）的關鍵分子靶標；circRNA在IREB(內(nèi)部核糖體進入位點)或m6A修飾的驅(qū)動下混蔼，可以編碼功能性肽履腋，進而影響癌癥干細胞的自我更新和治療抗性變化；同時研究顯示：m6A閱讀器YTHDF2的高表達與膠質(zhì)瘤干細胞（GSC）的癌癥特征保持有密切關聯(lián)，m6A修飾位點也可以作為內(nèi)部核糖體進入位點（IREBs）遵湖，促進circRNA和核糖體的結(jié)合悔政，提高編碼能力。綜上信息表明m6A修飾的circRNA有作為治療靶標的潛力奄侠。
MET是GBM中除EGFR（約4%）外最顯著改變的RTK之一（MET是一種受體酪氨酸激酶（RTK））卓箫，MET可以在癌癥相關內(nèi)皮細胞中檢測到载矿，對于新生血管的生成較為重要垄潮；原發(fā)性GBM的MET的表達頻率從30%變化至100%，利用其先前鑒定的配體HGF（也經(jīng)常在GBM中過表達）闷盔，HGF/MET信號傳導是GBM治療中的合理靶標弯洗。然而，在目前的臨床實驗中逢勾，HGF靶向療法和MET靶向療法效果均不理想牡整，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已被證明增加RTK突變，其損害治療期間的結(jié)合能力和治療效果溺拱。
本研究中逃贝，有編碼潛力的circMET（circMET編碼蛋白質(zhì)MET404）在GBM中高表達，MET404可以驅(qū)動GBM腫瘤的發(fā)生迫摔，同時MET404和MET β亞基形成嵌合MET受體沐扳，該受體會直接激活下游效應子從而不依賴HGF刺激；實驗結(jié)果表明：奧奴珠單抗和MET404抗體的組合最大限度地抑制小鼠GBM異種移植物進展并延長小鼠總體存活句占，展示了靶向MET404在GBM中的未來轉(zhuǎn)化前景沪摄。
研究思路?
研究結(jié)果
1.CircMET是一種具有潛在編碼能力的circRNA
GBM進行circRNA-seq和m6A-seq研究鑒定到1425個m6A修飾的circRNA，通過circRNA-seq鑒定了其中的1005個有高豐度m6A修飾的circRNA纱烘。m6a修飾的circRNA在多個RTK（絡氨酸激酶）途徑富集杨拐；RNC-seq，鑒定到1605個差異RNC-circRNA擂啥，鑒定circRNA（find_circ/CIRIquant）哄陶。結(jié)合上文鑒定的m6A修飾的circRNA，在GSC和NSC之間鑒定到89個有m6A修飾位點差異且具有編碼能力的circRNA哺壶；同時鑒定到255個與YTHDF2相關的circRNA屋吨，其中5個與89個重疊；綜上鑒定了5種候選circRNA（circMET变骡、circSPECCl离赫、circXYLTl、circCDYL和circRBM 33）塌碌，這5種circRNA中渊胸，circMET在GBM腫瘤發(fā)生中具有關鍵作用，作為host circRNA進行進一步研究台妆。
2.CircMET編碼蛋白MET404翎猛，YTHFD2的結(jié)合是circMET翻譯所必需的
CircMET是由MET基因的exon2形成胖翰，CircMET的序列在人、獼猴切厘、大小鼠中是高度保守的萨咳，使用sanger測序驗證了CircMET（1214nt），并預測了其circRNA特征包括編碼能力疫稿。亞細胞定位顯示CircMET主要位于細胞質(zhì)中培他，在GSC中特異性高表達；m6A-IP遗座，驗證了CircMET的m6A修飾位點（TransCirc數(shù)據(jù)庫）舀凛；RNC-seq結(jié)果顯示，在多聚核糖體分級中可以檢測到CircMET途蒋，說明CircMET具有翻譯能力猛遍；CircMET可以編碼蛋白質(zhì)（MET404）,為了驗證MET404是由CircMET產(chǎn)生的，對MET進行外顯子的crispr敲除号坡，敲除外顯子3并沒有影響MET404的表達懊烤；在circMET KO小鼠的多個器官中MET404表達顯著減少和未受影響的MET表達進一步表明circMET編碼該蛋白質(zhì)。
m6A讀取蛋白YTHDF2對于circMET翻譯是必需的：GSC細胞敲除YTHDF2（KD）宽堆，敲除后不會影響circMET表達腌紧，但會降低MET404蛋白水平；借助RIP證實了YTHDF 2/circMET相互作用日麸；針對臨床GBM和正常樣品進行檢測寄啼，結(jié)果顯示MET404在癌癥組織中會特異性的高表達，而且高MET 404表達預測GBM患者更差的總體存活率代箭；IHC空間共定位結(jié)果顯示墩划，MET404和YTHDF2在空間上存在共定位表達。
3.?MET404通過激活MET信號傳導促進GBM腫瘤發(fā)生
MET404主要定位到細胞膜上嗡综，對circMET進行沉默或過表達操作的細胞進行RNA-seq乙帮，差異基因主要富集到絡氨酸激酶（RTK）途徑及腫瘤相關途徑，意味著MET404參與多種癌性信號傳導途徑极景；circMET沉默細胞中察净，pMET被顯著抑制，且其下游活化（p-AKT盼樟，p-ERK）受到抑制氢卡。小鼠移植腫瘤發(fā)生檢測結(jié)果顯示，MET404的移植小鼠中晨缴，移植腫瘤后小鼠的存活時間顯著升高译秦，過表達后進一步增強了GBM的進展。
大多數(shù)MET 404 KI(基因編輯-基因插入重組)小鼠在20周時已經(jīng)發(fā)展出腦腫瘤，腫瘤表型與GBM類似筑悴，具有高度活化的MET信號们拙，且MET404KI小鼠存活率更低，可以表明MET404通過激活MET信號傳導阁吝，進而誘發(fā)GBM的腫瘤進展砚婆。
4.MET404與METβ亞基相互作用激活MET受體
MET404激活MET信號傳導的機制：氨基酸序列分析表明MET404具有分泌信號肽的特征，對GSC的培養(yǎng)基上清液IB分析表明MET404被分泌到了細胞培養(yǎng)液中突勇，同時也在GBM的腦脊液中檢測到了一定濃度的MET404（ELISA檢測）装盯；研究使用純化的MET404梯度濃度液可以激活MET下游信號傳導（MET404抗體可以中和），且可激活MET KO的受抑制的MET信號轉(zhuǎn)導通路与境；綜上验夯，可以說明MET404通過MET受體發(fā)揮其作用猖吴。
MET404免疫沉淀質(zhì)譜（IP-MS）摔刁，鑒定了194個潛在結(jié)合蛋白。對潛在蛋白進行富集分析也顯著富集到了細胞外定位和分子相互作用的GO功能海蔽，與MET404作為分泌蛋白的作用一致共屈；Reactome通路分析揭示，MET404互作蛋白與RTK途徑高度相關党窜，特別是MET信號高度相關（MET活性拗引、RAF/MAP激酶級聯(lián)和MAPK家族信號傳導級聯(lián)的調(diào)節(jié)）；借助STRING數(shù)據(jù)庫幌衣，基于鑒定的MET404結(jié)合候選蛋白矾削，建立了以MET為樞紐的蛋白互作網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡包括3個MET直接結(jié)合蛋白和42個間接相互作用蛋白豁护；后續(xù)通過相互IP驗證了GSC細胞中的MET404/MET相互作用哼凯，免疫熒光（IF）結(jié)果顯示：MET404和MET共定位，且多位于細胞膜上楚里。
MET404/MET受體結(jié)合位點鑒定：使用ClusPro服務器断部，模擬MET404和MET在胞外域形成的復合物，穩(wěn)定的復合物結(jié)合位點為542-650殘基（蛋白質(zhì)中殘基的順序?qū)ζ涔δ苤陵P重要班缎，并決定其三維結(jié)構(gòu)）蝴光，研究合成了全長MET受體和幾個短的MET受體結(jié)構(gòu)域與純化的MET404，以鑒定MET上與MET404結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域达址，MET 404與MET受體的PSI+IPTl結(jié)構(gòu)域相互作用蔑祟，HGF與MET受體的SEMA結(jié)構(gòu)域相互作用，突變了MET404的幾個殘基沉唠，發(fā)現(xiàn)Q328和D358的兩個單一突變充分損害了相互作用疆虚；同時用MET404處理比HGF處理可以更早地激活p-MET和下游效應子，并且用MET 404和HGF的組合處理對p-MET活化發(fā)揮協(xié)同作用。
HGF KO細胞系中可以觀察到輕微p-MET下調(diào)装蓬，純化的MET 404添加可以增強p-MET和下游信號轉(zhuǎn)導著拭，即單獨的MET 404也可以激活MET受體；RTK的活化需要配體結(jié)合后的二聚化牍帚，引出問題儡遮，單獨的MET 404是否可以誘導MET受體的二聚化；HGF KO細胞系暗赶，通過添加純化的MET 404可以增強MET的二聚化鄙币；研究使用NanoBit系統(tǒng)，將大位（LgBit）和小位（SmBit）殘基融合至MET單體蹂随。MET的二聚化導致這些殘基的近似十嘿，并因此產(chǎn)生發(fā)光信號。將大位（LgBit）和小位（SmBit）殘基融合至MET單體岳锁。MET的二聚化導致這些殘基的近似绩衷，并因此產(chǎn)生發(fā)光信號。綜上激率，證實了MET404單獨誘導MET二聚化和活化的能力咳燕。向MET 404 KO細胞中添加HGF也增加p-MET和p-AKT水平。綜上乒躺，可以證實招盲，HGF和MET404獨立地激活MET受體并協(xié)同作用以最大化MET信號傳導。
MET受體由α和β亞基形成嘉冒，這兩個亞基都是通過切割全長MET產(chǎn)生的曹货；MET外顯子2KO消除了MET受體和MET 404的表達兩者，且使用HGF或MET404均無法激活下游信號轉(zhuǎn)導（p-AKT讳推、p-ERK）顶籽，然后重新表達β亞基，并用HGF或MET404進行刺激娜遵，HGF無法激活（支持經(jīng)典MET工作模型需要α亞基的結(jié)論）蜕衡，但MET404可以激活p-MET和p-AKT，表明MET404可以與METβ亞基形成復合物激活MET受體设拟；鑒于MET404的異常表達慨仿，數(shù)據(jù)表明MET404是GBM中過度活化的MET信號轉(zhuǎn)導的關鍵激活劑。
5.靶向 MET404 和 onartuzumab（抗MET受體） 在抑制 GBM 進展方面的協(xié)同作用
GBM臨床樣品中纳胧，觀察到MET404和MET的共定位镰吆，且MET404與p-MET水平相關（比p-MET與EMT受體的相關性更高），即MET404是GBM種p-MET的主要激活劑跑慕。MET404抗體的梯度添加可以逐步降低GSC細胞中的p-MET水平万皿，說明MET404有作為GBM中靶向治療靶點的臨床潛力摧找；同時MET404與onartuzumab組合可以更好地一直MET信號和下游事件，包括AKT/ERK活化和細胞活力牢硅。在小鼠腫瘤移植實驗中蹬耘，MET404抗體與onartuzumab單抗聯(lián)合治療實現(xiàn)了MET磷酸化和腫瘤進展的部分抑制，即抗體組合在抑制異種抑制物生長和延長小鼠存活方面發(fā)揮了更好的作用减余。
?研究結(jié)論&結(jié)果討論?
本次研究中發(fā)現(xiàn)综苔，MET404結(jié)合MET受體上遠離HGF結(jié)合位點（SEMA）的不同結(jié)構(gòu)域（PSI+IPT1），MET404結(jié)合MET受體上遠離HGF結(jié)合位點（SEMA）的不同結(jié)構(gòu)域（PSI+IPT1）位岔，導致MET信號的獨立激活和與HGF聯(lián)合使用時的協(xié)同效應如筛。HGF作為典型的MET配體，與具有不同位點的MET單體結(jié)合抒抬，因此形成四個界面以促進更延伸的構(gòu)象以引發(fā)活化杨刨。研究驗證了MET404具有誘導MET單體二聚化的能力，MET404激活MET受體的潛在結(jié)構(gòu)基礎值得進一步研究擦剑，以優(yōu)化抗MET404策略妖胀。
綜上，本研究工作確定了GBM含有circMET產(chǎn)生的分子靶標MET404抓于，作為新鑒定的MET配體做粤，MET404激活MET受體，刺激不依賴于HGF的下游效應物并驅(qū)動GBM的腫瘤發(fā)生捉撮。用EMT404的單克隆抗體增強了抗HGF/MET療法的功效，可以作為治療腦惡性腫瘤中的關鍵靶點妇垢。
CircMET可以吸附miRNA以調(diào)節(jié)Snail/CXCL 10軸來驅(qū)動肝細胞癌中的免疫抑制巾遭；本次研究數(shù)據(jù)證實了MET404（不是其RNA，通過放回MET 404 ORF而不是突變體circMET RNA來恢復circMET損失后的表型）在形成GSC惡性腫瘤中的關鍵作用闯估，其他研究中circRNA編碼的功能肽已被證明是癌癥或其他疾病中的關鍵參與者灼舍，這些發(fā)現(xiàn)也表明了不同病理條件下復雜的circRNA功能。
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