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文章題目：A specialized bone marrow microenvironment for fetal haematopoiesis
期刊：Nature Communications
日期：2022年3月14日
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-28775-x

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文章報(bào)道了胚胎期骨髓微環(huán)境與成年骨髓微環(huán)境的差別，揭示了胚胎骨動(dòng)脈在造血干細(xì)胞首次進(jìn)入胚胎骨髓過程中的重要性淮韭。

摘要

本文中研究人員利用遺傳操作小鼠通過單細(xì)胞測(cè)序?qū)Ρ确治霭l(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境在胚胎期與成年期差異巨大，動(dòng)脈血管在胚胎骨髓中具有重要税弃。在小鼠胚胎發(fā)育第16.5天蜂怎，絕大多數(shù)造血干/祖細(xì)胞都位于動(dòng)脈血管旁劲弦。雖然胎兒股骨基本上缺乏瘦素受體表達(dá)細(xì)胞，但動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（AEC）提供Wnt配體來控制最初的HSPC擴(kuò)張赁严。研究人員發(fā)現(xiàn)此時(shí)的骨髓動(dòng)脈可以釋放Wnt2扰柠，動(dòng)脈來源的Wnt信號(hào)影響造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增。而利用重組蛋白Wnt2在體外處理造血干/祖細(xì)胞疼约，可以促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的增殖卤档、增強(qiáng)造血干/祖細(xì)胞形成體外克隆的能力。而當(dāng)AEC分泌Wnt被基因阻斷時(shí)程剥，造血干/祖細(xì)胞減少劝枣。綜上，該研究揭示了胚胎和成年生物體中骨髓微環(huán)境的細(xì)胞組織和分子調(diào)節(jié)的根本性轉(zhuǎn)變织鲸，未來或有助于提高造血干細(xì)胞移植效率舔腾。

引言

造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell，HSC）是一種生物體內(nèi)稀有細(xì)胞類群昙沦，具有自我更新能力和多能分化潛能的特性琢唾，它們共同維持造血系統(tǒng)中所有細(xì)胞類型的生成。目前治療多種惡性血液疾病的普遍方法就是采用放化療后進(jìn)行造血干細(xì)胞移植盾饮，重建血液系統(tǒng)采桃。因此對(duì)造血干細(xì)胞植入骨髓機(jī)制的研究，有助于提高造血干細(xì)胞移植效率丘损。在成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)普办，造血干細(xì)胞主要存在于骨髓中。造血干細(xì)胞的維持徘钥、靜息和增殖等行為受到其微環(huán)境的調(diào)控衔蹲。成年動(dòng)物骨髓中造血干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境的相互作用，已被較深入研究呈础。但胚胎期骨髓微環(huán)境如何調(diào)控造血干細(xì)胞的行為仍不清楚舆驶。在最新研究中發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞發(fā)育過程中而钞，動(dòng)脈血管調(diào)控造血干細(xì)胞首次進(jìn)入胚胎期骨髓沙廉。在本研究中，作者結(jié)合scRNA-seq臼节、流式細(xì)胞術(shù)撬陵、高級(jí)成像、組織特異性遺傳小鼠模型和BM移植實(shí)驗(yàn)來研究胎兒股骨基質(zhì)細(xì)胞和HSPCs之間的相互作用网缝。這揭示了胎兒BM與成人BM在細(xì)胞組成和HSPC調(diào)控方面有根本的不同巨税。基于本研究結(jié)果粉臊，作者認(rèn)為正在發(fā)育的骨髓中的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞提供了促進(jìn)胚胎骨新生定植的關(guān)鍵信號(hào)草添。

結(jié)果

1、胎兒BM中血管和HSPC的發(fā)育

為了了解胚胎HSPCs和骨髓微環(huán)境細(xì)胞的特性和異質(zhì)性扼仲，研究者首先對(duì)胚胎期骨髓血管和c-Kit+造血干/祖細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行分析远寸。發(fā)現(xiàn)骨髓血管最早在胚胎發(fā)育E15.0至E15.5形成于第一骨化中心促王，在形成初期的E15.5就已完成初步的動(dòng)靜脈分化，出現(xiàn)了CD31+ Emcn-的動(dòng)脈血管而晒。但此時(shí)的骨動(dòng)脈血管尚未完全成熟蝇狼，未被血管平滑肌細(xì)胞包裹。而在E16.5之前倡怎，無法在胚胎骨髓中檢測(cè)到c-Kit+造血干/祖細(xì)胞迅耘。這表明血管進(jìn)入骨髓和完成動(dòng)靜脈分化的發(fā)育時(shí)間，先于c-Kit+造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入骨髓的時(shí)間监署。

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圖1：胚胎和成人BM成分的比較分析

• a-c c-Kit+造血細(xì)胞在E16.5的BM中比較少颤专，在之后的胚胎發(fā)育（E17.5（b），E18.5（c））中迅速增加钠乏。c-Kit（綠色）栖秕；CD31（紅色）; 細(xì)胞核, DAPI（藍(lán)色）。
• d,e UMAP圖展示在去除Lin+細(xì)胞后晓避，胚胎（E18.5）和成年小鼠股骨BM細(xì)胞的分群以及兩者之間的差異簇捍。
• g 條形圖展示每個(gè)亞群的細(xì)胞所占比例。右側(cè)圖表是各群細(xì)胞數(shù)量俏拱。
• h 用差異基因表達(dá)分析（DEGs）比較E18.5和成年小鼠HSPCs的每個(gè)亞群暑塑。
• i 小提琴圖展示E18.5和成年小鼠各亞群中介導(dǎo)HSPCs發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和受體的表達(dá)水平。

2锅必、HSPCs與骨髓基質(zhì)單細(xì)胞比較分析

為了比較成年和胚胎HSPCs以及股骨中的基質(zhì)細(xì)胞事格，作者從成年和E18.5小鼠中分離出BM細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序搞隐。結(jié)果顯示細(xì)胞亞群水平的差異表達(dá)基因(DEG)分析顯示E18.5與成年小鼠HSPCs之間存在顯著差異驹愚，每個(gè)亞簇中有數(shù)百個(gè)DEG，這與之前的報(bào)道一致劣纲。這些DEGs包括介導(dǎo)HSPC發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和受體逢捺。

E18.5與成年小鼠最顯著的差異可見于骨髓基質(zhì)細(xì)胞室(此處定義為BMSCs)(圖2a)。通過細(xì)胞亞聚類味廊，我們檢測(cè)到2組骨鞘細(xì)胞(OLCs-1, OLCs-2)蒸甜、有絲分裂的BMSCs棠耕、成體富集的BMSCs (aBMSC)和兩組胚胎富集的BMSCs (eBMSC-1, eBMSC-2)(圖2a, b)余佛。Lepr + aBMSCs代表了造血干細(xì)胞表達(dá)Lepr的網(wǎng)狀生態(tài)位細(xì)胞，在成體BMSCs中高度豐富(圖2a)窍荧，但在E18.5時(shí)幾乎完全缺失(圖2a)辉巡。基于此作者提出：胎兒骨髓中的另一個(gè)骨髓干細(xì)胞群是否具有LepR+ aBMSCs的功能蕊退。高表達(dá)III型膠原亞基1 (Col3a1high)郊楣、蛋白多糖decorin (Dcn)和c型凝集素結(jié)構(gòu)域家族成員Gsn/Clec3b的eBMSC-1群體占胎兒BMSCs的大多數(shù)(57%)憔恳，但在成人中顯著減少。

通過組織切片免疫染色和對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠基因標(biāo)記細(xì)胞的FACS分析净蚤，證實(shí)胎兒幾乎不存在BM中LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞钥组。DEGs也表明了胚胎和成年全BMSCs群體的獨(dú)特分子特性。眾所周知今瀑，LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞為造血干細(xì)胞提供了關(guān)鍵的生態(tài)位因子程梦，最顯著的是干細(xì)胞因子(SCF;由Kitl編碼)、趨化因子Cxcl12和生長(zhǎng)因子血管生成素-1 (Angpt1)橘荠。與E18.5缺乏LepR+亞群的情況一致屿附，所有這些轉(zhuǎn)錄本在胚胎期BMSCs中的表達(dá)都非常低，這意味著LepR+細(xì)胞分泌的這些骨髓龕因子并沒有被Col3a1+ eBMSCs所取代哥童⊥Ψ荩基于此，作者認(rèn)為小鼠胚胎期的骨髓微環(huán)境中幾乎不存在LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞贮懈。

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圖2 ：胚胎和成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的比較分析

• a UMAP圖顯示E18.5和成年小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）的分群匀泊。條形圖展示了各群細(xì)胞所占的百分比，右側(cè)表格是各群細(xì)胞的數(shù)量朵你。
• b UMAP圖顯示每個(gè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞亞群的代表性標(biāo)記基因的分布探赫。顏色代表基因的表達(dá)水平。
• c confocal圖展示了成年小鼠或E18.5 R26-mTmG Cre報(bào)告小鼠骨髓中Lepr-Cre標(biāo)記的血管周圍細(xì)胞數(shù)量撬呢。Lepr-Cre-controlled GFP主要標(biāo)記成年小鼠骨髓中的竇狀血管相關(guān)（網(wǎng)狀）細(xì)胞伦吠，而在E18.5時(shí)GFP+細(xì)胞很少。
• d 在E18.5和成年小鼠的所有BMSCs細(xì)胞之間的DEGs魂拦。
• e 小提琴圖展示E18.5時(shí)或成年時(shí)所有BMSCs中關(guān)鍵生態(tài)位因子的表達(dá)毛仪。y軸表示每個(gè)基因的表達(dá)水平。
• f 每個(gè)E18.5和成年BMSC亞群的DEGs芯勘。
• g 小提琴圖展示在每個(gè)E18.5或成年BMSC亞群中HSPC生態(tài)位相關(guān)基因的表達(dá)箱靴。

骨ECs的無監(jiān)督亞聚類顯示E18.5和成人中類似的主要亞群(圖3a)。兩組都包含Emcn低表達(dá)荷愕、激酶Bmx衡怀、轉(zhuǎn)錄因子Sox17、跨膜配體ephrin-B2 (Efnb2)安疗、縫隙連接蛋白連接蛋白37 (Gja4)和Caveolin-1 (Cav1)高水平轉(zhuǎn)錄的分化aec抛杨。在E18.5和成人樣本中都存在Stab2high ECs，代表BM的ECs在造血中發(fā)揮重要作用(圖3a)荐类。在亞群水平上比較胚胎和成體ECs發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)顯著的deg(圖3c)怖现，而分泌的骨髓龕因子如Kitl、Cxcl12或Pdgfb沒有明顯的改變(圖3d)。作者使用Interactome分析來評(píng)估基質(zhì)細(xì)胞和HSPCs中的DEGs是否在轉(zhuǎn)錄組水平上指示hspc調(diào)控的差異屈嗤。該分析表明潘拨，胚胎骨與成年骨中潛在的HSPCs-微環(huán)境中細(xì)胞相互作用發(fā)生了顯著變化(圖3e, f)。表明小鼠胚胎骨髓單細(xì)胞的結(jié)果表明其具有自身的特征饶号，并且與成年骨髓單細(xì)胞存在顯著差異铁追。

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圖3：胚胎和成年內(nèi)皮細(xì)胞的比較分析

• a UMAP圖顯示E18.5和成年股骨內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的分群。條形圖表示每個(gè)亞群所占百分比茫船。
• b UMAP圖顯示每個(gè)EC亞群的代表性標(biāo)記基因的分布脂信。顏色代表基因的表達(dá)水平。
• c E18.5和成年小鼠EC亞群的DEGs透硝。
• d E18.5或成年時(shí)選出的幾個(gè)EC來源的HSPC支持因子的表達(dá)水平狰闪。
• e,f 非造血支持細(xì)胞與HSPCs（e）或多潛能HSPCs（f）之間潛在的相互作用（箭頭）的互作分析。線條和箭頭的寬度代表基因的相對(duì)log2差異表達(dá)倍數(shù)濒生。藍(lán)色箭頭表示在成年小鼠中富集的信號(hào)埋泵；紅色箭頭表示在E18.5中富集的信號(hào)。

3罪治、初始植入的HSPCs和HSCs與AECs相關(guān)

接下來丽声，作者探討了在LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞出現(xiàn)之前，哪些細(xì)胞群可能支持胎兒BM中HSPCs的初始植入和增殖觉义。對(duì)染色的骨切片分析顯示雁社，CD150+ CD48?CD41?Lin?造血干細(xì)胞主要與E16.5位點(diǎn)的Caveolin-1+ AECs重合(圖4a, b)。據(jù)統(tǒng)計(jì)晒骇，超過65%的HSC群體位于Caveolin-1+ AECs的10 μ m范圍內(nèi)(圖4c)霉撵，提示動(dòng)脈可能會(huì)影響造血干細(xì)胞對(duì)胎兒BM的初始定植。更近一步的分析還表明洪囤，這些最初植入的造血干細(xì)胞優(yōu)先位于骨干中心徒坡。同樣，c-Kit+ hspc與cavelin -1+ AECs在E16.5位點(diǎn)緊密對(duì)齊(圖4 - f)瘤缩，提示動(dòng)脈在造血干細(xì)胞和造血干細(xì)胞定植胎兒BM中發(fā)揮作用喇完。對(duì)的scRNA-seq數(shù)據(jù)的深入分析表明，胚胎AECs表達(dá)多種作用于HSPCs骨髓龕因子剥啤，如Cxcl12锦溪、Kitl、Jag1和Jag2府怯、Dll4刻诊、Vegfc和Tgfb2，這些已知作用于多能hspc(圖4g;i)富腊。相互作用分析進(jìn)一步支持胎兒AECs和hspc在BM發(fā)育過程中的信號(hào)相互作用(圖4h)坏逢。

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圖4：動(dòng)脈與胚胎BM中的初始HSC和HSPC增殖有關(guān)

• a 免疫熒光圖顯示E16.5時(shí)Lin-CD48-CD41-CD150+HSC（綠色域帐，箭頭）和 Caveolin-1+AEC（紅色）的排列情況赘被。藍(lán)色是整，Lin+CD48+ CD41+。
• b CD150+細(xì)胞（綠色）和 Caveolin-1+動(dòng)脈（紅色）的3D重建圖像民假。
• c 在E16.5時(shí)浮入，根據(jù)3D重建的HSC (N = 48)、Lin+ CD48+ CD41+成熟造血細(xì)胞 (N = 2203) 或 DAPI+細(xì)胞 (N = 6174) 和 Caveolin-1+ AEC之間的距離量化羊异。P-value事秀，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。
• d 在E16.5時(shí)野舶，c-Kit+造血細(xì)胞（綠色）和Caveolin-1+ AEC（箭頭易迹，紅色）的排列。CD31平道，藍(lán)色睹欲。
• e c-Kit+造血細(xì)胞（綠色）和Caveolin-1（紅色）位置的3D重建圖像。
• f 在E16.5時(shí)一屋，根據(jù)3D重建的c-Kit+ (N = 258)窘疮、Lin+ CD48+ CD41+成熟造血細(xì)胞 (N = 2052)或DAPI+隨機(jī)細(xì)胞(N = 6665)和Caveolin-1+ AEC之間的距離量化。
• g 小提琴圖展示在E18.5時(shí)冀墨，AEC或其他EC亞群中編碼血管分泌或HSPC支持因子的標(biāo)志性基因的表達(dá)闸衫。
• h 多潛能HSPC和不同EC亞群之間潛在的相互作用（箭頭）的互作分析。線條和箭頭的寬度代表基因的相對(duì)表達(dá)水平诽嘉。

4蔚出、AECs衍生的Wnt調(diào)節(jié)胎兒HSC和HSPCs的發(fā)育

scRNA-seq分析也提示W(wǎng)nt信號(hào)通路在胎骨中ECs和HSPCs之間的通信中發(fā)揮作用，但在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中幾乎檢測(cè)不到許多Wnt通路組分的表達(dá)虫腋。因此身冬，我們使用帶有預(yù)先設(shè)計(jì)的Wnt通路成分引物的定制面板進(jìn)行靶向scRNA-seq分析。該分析顯示AECs是E18.5 BM中Wnt配體的來源岔乔，Wnt2是β-catenin依賴的典型Wnt信號(hào)的激活劑酥筝，表達(dá)最高(圖5a)。相互作用分析支持aec來源的Wnt2在E18.5位點(diǎn)對(duì)造血細(xì)胞的潛在調(diào)控(圖5b)雏门。通過一系列的實(shí)驗(yàn)證明嘿歌，在胎兒BM發(fā)育過程中，AECs是Wnt配體的主要來源茁影。

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圖5：胚胎BM中通過Wnt的AEC-HSPC crosstalk

• a 靶向scRNA-seq表達(dá)分析顯示E18.5和成年小鼠的非動(dòng)脈或動(dòng)脈ECs中的不同Wnt配體宙帝。點(diǎn)大小表示檢測(cè)到基因的細(xì)胞的百分比，顏色表示每簇中基因的平均表達(dá)水平募闲。
• b 在E18.5和成年小鼠BM中潛在的Wnt信號(hào)相互作用的互作分析步脓。線條和箭頭的寬度代表基因的相對(duì)表達(dá)水平。
• c 他莫昔芬處理和WlsiΔBmxmice分析的示意圖。
• d E18.5WlsiΔBmx突變體和同窩對(duì)照中c-Kit+細(xì)胞的免疫熒光圖靴患。柱狀圖展示了c-Kit+細(xì)胞覆蓋面積的量化仍侥。Ctrl = 6; WlsiΔBmx= 8。Error bars鸳君，mean±s.e.m农渊。P values，雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)或颊。
• e CD45.2/CD45.1 長(zhǎng)時(shí)程再增殖實(shí)驗(yàn)的示意圖砸紊。來自兩個(gè)WlsiΔBmx或同窩對(duì)照小鼠的股骨的所有細(xì)胞都作為CD45.2供體。
• f 長(zhǎng)時(shí)程競(jìng)爭(zhēng)性再增殖試驗(yàn)的量化圖表展示了供體來源（CD45.2囱挑，control=12和WlsiΔBmx = 11）骨髓細(xì)胞（CD11b+）醉顽、B細(xì)胞（B220+）和T細(xì)胞（CD4+和CD8+）的百分比。Error bars平挑，mean±s.e.m徽鼎。P values，雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)弹惦。
• g 在E18.5WlsiΔBmx和同窩對(duì)照BM中否淤，通過FACS分選出的HSC和LSK細(xì)胞數(shù)量（Ctrl = 11；WlsiΔBmx=13）標(biāo)準(zhǔn)化后的量化棠隐。將絕對(duì)細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化作為對(duì)照石抡。Error bars，mean±s.e.m助泽。P values啰扛，雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)。
• h 在E18.5WlsiΔBmx（N = 102）和同窩對(duì)照小鼠（N = 272）中嗡贺，基于3D重建的HSC和Caveolin-1+ AEC之間距離的量化隐解。
• i 在E18.5WlsiΔBmx和同窩對(duì)照BM中，通過FACS分選出的Lin- c-Kit+(Ctrl = 11; WlsiΔBmx = 13) 和Lin-c-Kit+CD127+诫睬、Lin-c-Kit+CD34+煞茫、Lin-c-Kit+CD16/32+細(xì)胞數(shù)量(Ctrl = 7；WlsiΔBmx = 9)摄凡。
• j 在E18.5WlsiΔBmx和同窩對(duì)照的股骨BM中续徽，通過FACS分選出的Ter119+、CD45+亲澡、Gr-1+钦扭、B220+、CD4/8+細(xì)胞占比的量化床绪。

5客情、AECs通過β-catenin調(diào)節(jié)HSPCs增殖

接下來其弊，作者探討了aec衍生的Wnt信號(hào)是否會(huì)直接影響HSPC功能。對(duì)攜帶Tcf/Lef:H2B-GFP報(bào)告基因等位基因的E18.5胚胎的流式細(xì)胞術(shù)分析表明膀斋，GFP在LSK細(xì)胞中表達(dá)梭伐。同樣，scRNA-seq分析揭示了幾個(gè)Wnt通路基因在HSPCs中的表達(dá)概页。在功能研究中籽御，我們生成了Vav1- cre +/T Ctnnb1lox/lox (Ctnnb1?Vav1)突變體小鼠练慕，該小鼠的Vav1+造血細(xì)胞中的β-catenin功能發(fā)生缺失惰匙。在E18.5時(shí)，Ctnnb1?Vav1股骨中c-Kit+細(xì)胞面積以及HSCs铃将、LSK細(xì)胞和其他Lin - c-Kit+ HSPC細(xì)胞數(shù)量相對(duì)對(duì)照組減少(圖6a - d)项鬼。為了避免早期造血發(fā)育中的潛在缺陷，并確認(rèn)β-catenin依賴的Wnt信號(hào)在c-Kit+ hspc中的必要性劲阎，作者接下來生成了他莫昔芬誘導(dǎo)的(Ctnnb1i?Kit)小鼠绘盟。在E14.5-E17.5中顯示股骨c-Kit+面積減少，HSCs悯仙、LSK細(xì)胞和其他hspc細(xì)胞數(shù)量減少(圖6e-h)龄毡。表明hspc的減少不是由CreER敲入c-Kit基因座本身引起的，在沒有他莫西芬處理的Ctnnb1i?Kit胚胎中锡垄，HSPCs的數(shù)量沒有顯著改變沦零。這些結(jié)果的總和表明，aec控制的Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胎兒BM中HSPC的增殖货岭。

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圖6 ：AECs通過Wnt和β-catenin調(diào)節(jié)HSPC增殖

• a 在E18.5Ctnnb1ΔVav1敲除和同窩對(duì)照小鼠BM中路操，c-Kit+細(xì)胞覆蓋區(qū)域的免疫熒光圖。
• b c-Kit+細(xì)胞覆蓋區(qū)域的定量（Ctrl = 4千贯；Ctnnb1ΔVav1 = 4）屯仗。
• c, d 在E18.5Ctnnb1ΔVav1和同窩對(duì)照小鼠中，HSC和LSK細(xì)胞(c)和Lin- c-Kit+搔谴、Lin- c-Kit+ CD127+魁袜、Lin- c-Kit+ CD34+、Lin- c-Kit+ CD16/32+細(xì)胞(d)的量化敦第。Ctrl = 7;Ctnnb1ΔVav1= 7慌核。
• e 在E18.5Ctnnb1iΔKit和同窩對(duì)照小鼠BM中，c-Kit+細(xì)胞覆蓋區(qū)域的免疫熒光圖申尼。
• f c-Kit+細(xì)胞覆蓋面積的定量垮卓。Ctrl = 5; Ctnnb1iΔKit = 4。
• g, h 在E18.5Ctnnb1iΔKit和同窩對(duì)照小鼠BM中师幕，基于FACS的HSC和LSK細(xì)胞數(shù)量(g)以及Lin-c-Kit+粟按、Lin-c-Kit+CD127+诬滩、Lin-c-Kit+ CD34+、Lin-c-Kit+CD16/32+細(xì)胞(h)的定量灭将。Ctrl = 7; Ctnnb1iΔKit= 8疼鸟。
• i 用他莫昔芬、EdU處理和分析WlsiΔBmx小鼠的實(shí)驗(yàn)示意圖庙曙，c-Kit+細(xì)胞的EdU染色的免疫熒光圖空镜，以及c-Kit+細(xì)胞中EdU%的量化。Ctrl = 3捌朴；WlsiΔBmx = 3吴攒。
• j 通過FACS分選出WlsiΔBmx和對(duì)照LSK細(xì)胞中EdU+細(xì)胞。Ctrl=3砂蔽；WlsiΔBmx=6洼怔。
• k 通過FACS分選出Ctnnb1ΔVav1和對(duì)照LSK細(xì)胞中EdU+細(xì)胞。Ctrl = 7; Ctnnb1ΔVav1 = 7左驾。
• l 通過FACS分選出Ctnnb1iΔKit和對(duì)照LSK細(xì)胞中EdU+細(xì)胞镣隶。Ctrl = 5; Ctnnb1iΔKit = 4。

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圖7：Wnt2促進(jìn)HSPC增殖和移植

• a FACS圖顯示用Wnt2處理后的LSK細(xì)胞和對(duì)照中的瞬時(shí)EdU結(jié)合率诡右。右側(cè)是LSK細(xì)胞中EdU%的量化安岂。Ctrl = 6; Wnt2 = 7渐扮。
• b 體外培養(yǎng)8天后谓罗，600個(gè)分選出的野生型成年小鼠LSK細(xì)胞的集落形成單位。菌落計(jì)數(shù)典勇，vehicle= 10桅锄；Wnt2 = 9琉雳。細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，vehicle= 6友瘤；Wnt2 = 5翠肘。
• c，d 相對(duì)于成年小鼠細(xì)胞辫秧，造血干細(xì)胞數(shù)量和LSK數(shù)量的差異倍數(shù)的量化(c)束倍；vehicle= 10；Wnt2 = 9盟戏。以及Wnt2處理后的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)(d);vehicle = 15绪妹；Wnt2 = 14。
• e Wnt2對(duì)體外分選出來的成年Vav1-mTmG LSK細(xì)胞的處理柿究，以及移植到輻照后的WT小鼠體內(nèi)5天后進(jìn)行分析的示意圖邮旷。
• f 移植Wnt2、vehicle預(yù)處理的GFP+細(xì)胞蝇摸、新鮮細(xì)胞5天后婶肩，對(duì)應(yīng)的宿主骨切片的免疫染色圖办陷。
• g 移植Wnt2、vehicle預(yù)處理的GFP+細(xì)胞律歼、新鮮細(xì)胞5天后民镜，通過FACS分選出來自宿主的GFP+或GFP+CD11b+細(xì)胞。
• h 移植后5天,BM中通過FACS得到的GFP+险毁、GFP+CD45+和GFP+CD11b+細(xì)胞百分比的定量制圈。input= 5; ctrl = 20; Wnt2 = 15。
• i Wnt2對(duì)體外分選出來的成年WT LSK細(xì)胞的處理畔况，以及移植到輻照后的WT小鼠體內(nèi)2周后進(jìn)行分析的示意圖鲸鹦。
• j FACS分選出的 LSK%、SLAM-LSK%（ctrl = 10问窃；Wnt2 = 10）以及 BMNC亥鬓、Gr-1+骨髓細(xì)胞完沪、B220+ B淋巴細(xì)胞和CD4/8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量的量化域庇。ctrl = 14; Wnt2 = 12。

總結(jié)與討論

我們的工作總結(jié)提供了一些了解的生物學(xué)過程覆积，即HSPCs對(duì)胎兒骨的從頭定植听皿，這對(duì)發(fā)育一個(gè)功能完整的造血系統(tǒng)至關(guān)重要。我們的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了胎兒和成人腦轉(zhuǎn)移之間在細(xì)胞組成宽档、基因表達(dá)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用方面的實(shí)質(zhì)性差異尉姨。LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞，一種與竇狀血管相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞群吗冤，在成年生物中為hspc提供必要的生態(tài)位信號(hào)又厉，在胎兒骨髓中不存在。這一發(fā)現(xiàn)與之前使用免疫染色和FACS研究BMSC發(fā)育的文章一致椎瘟，但我們的scRNA-seq分析表明覆致，LepR+群體的缺失不僅反映了單個(gè)基因(即LepR)的表達(dá)缺失，而且反映了胎兒BM中BMSC亞群的實(shí)際缺失肺蔚。隨著LepR+血管周細(xì)胞在出生后2周變得豐富煌妈，一種可能是它們的功能在胚胎和出生后早期發(fā)育中被另一群血管周間充質(zhì)細(xì)胞接管。我們的研究發(fā)現(xiàn)eBMSC-1是胎兒BM中最豐富的血管周細(xì)胞群宣羊，但這些細(xì)胞不延伸明顯的網(wǎng)纖維璧诵，缺乏主要龕因子的表達(dá)，如SCF仇冯、Cxcl12或angiopoietin-1之宿。在成年BMSCs中也發(fā)現(xiàn)了少量eBMSC-1細(xì)胞，但這些細(xì)胞只占總BMSCs的一小部分苛坚，E18.5位點(diǎn)的eBMSC-1細(xì)胞與成年BMSCs在基因表達(dá)上存在顯著差異比被。除了LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞外坪创，成人BM基質(zhì)的其他主要細(xì)胞成分已經(jīng)存在于胎兒中，因此可能支持骨髓的造血定植姐赡。

大量研究對(duì)成人骨中造血干細(xì)胞的微環(huán)境進(jìn)行了研究莱预。有人提出，小動(dòng)脈小龕維持成年造血干細(xì)胞的靜息项滑，而其他一些研究將靜息的依沮、長(zhǎng)期的成年造血干細(xì)胞置于竇血管附近，從而形成LepR+網(wǎng)狀小龕細(xì)胞枪狂。雖然本研究結(jié)果不排除竇血管危喉、成骨細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞群的潛在貢獻(xiàn)，但表明州疾，在胎兒骨髓中不存在LepR+網(wǎng)狀細(xì)胞辜限，而且胚胎造血干細(xì)胞和造血干細(xì)胞與發(fā)育中的股骨動(dòng)脈相關(guān)。動(dòng)脈在多個(gè)層面上參與造血系統(tǒng)的發(fā)展严蓖。在早期胚胎中薄嫡，主動(dòng)脈是通過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化產(chǎn)生決定性造血干細(xì)胞的主要部位，在發(fā)育后期颗胡，小動(dòng)脈幫助維持胎兒肝臟中的造血干細(xì)胞毫深。本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了動(dòng)脈的作用，表明動(dòng)脈通過激活hspc中典型的毒姨、β-catenin依賴的Wnt信號(hào)哑蔫，促進(jìn)了胎兒BM的首次造血定植。aec衍生的Wnt增強(qiáng)HSPC的定植和增殖弧呐，但是闸迷，我們看到E16.5股骨中這些細(xì)胞的減少，不應(yīng)排除在循環(huán)俘枫、進(jìn)入或植入胎兒HSPC中的額外作用腥沽。除了AECs，其他基質(zhì)細(xì)胞群也可能參與胎兒BM的造血定植崩哩，這可能涉及Wnt配體的釋放巡球，也可能涉及其他分子信號(hào)。

本研究填補(bǔ)了胚胎肝臟造血和出生后成熟骨髓之間造血系統(tǒng)發(fā)育的一環(huán)邓嘹。在出生后骨髓中酣栈，是什么細(xì)胞和分子變化介導(dǎo)造血干細(xì)胞從動(dòng)脈向竇血管轉(zhuǎn)移?eBMSCs的確切性質(zhì)是什么?這些細(xì)胞是否會(huì)產(chǎn)生成人BM中發(fā)現(xiàn)的其他間充質(zhì)細(xì)胞群?照射和BM移植后，這個(gè)過程是否會(huì)再次出現(xiàn)?由于輻照條件作用于HSPC移植會(huì)導(dǎo)致LepR+細(xì)胞的丟失等汹押。因此矿筝，胎兒骨髓的發(fā)現(xiàn)可能為BM再生開辟新的概念途徑。

亮點(diǎn)

小鼠造血干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境的細(xì)胞組成和分子相互作用方面在胚胎期與成年期存在顯著差異棚贾，闡明胚胎期骨髓動(dòng)脈血管在HSPCs首次進(jìn)入骨髓中的關(guān)鍵作用窖维。

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