影響因子：13.75

小編最近模仿該思路篩選與免疫周期相關基因，果不其然篩選的效果非常好逼泣！該思路可做純生信趴泌，即篩選基因+單基因分析/基因集分析，或者干濕結合拉庶，即篩選基因+單基因分析+實驗驗證嗜憔。想做類似分析的朋友歡迎交流！

小編一直覺得單基因泛癌的文章進可攻（純生信發(fā)文）退可守（補實驗）氏仗。小編已經(jīng)有不少客戶發(fā)了單基因生信文章后吉捶，開始做實驗進行深入研究，后續(xù)可以繼續(xù)發(fā)文章寫基金皆尔。比較老的客戶已經(jīng)成功拿到經(jīng)費呐舔。

之前小編寫過生信篩選的單基因如何補充實驗
當時小編列舉了一些實驗，本文作者做了表達驗證慷蠕，預后驗證珊拼，與免疫檢查點的相關性，分子機制流炕，對CD8T細胞浸潤的影響澎现，與免疫檢查點抑制劑的連用。本文屬于生信與實驗結合的十分緊密的文章每辟。對于有時間有經(jīng)費的朋友剑辫，在篩選到好的基因后，也可以參考這些做后續(xù)的研究渠欺。下圖中打勾的都是本文做了的內(nèi)容妹蔽。

研究背景：肝細胞癌(HCC)是全球?qū)е掳┌Y相關死亡的第三大原因，在一線和二線臨床環(huán)境中，III期臨床試驗未能顯示免疫檢查點封鎖劑治療的益處讹开。當使用這些藥物作為HCC的單一治療時盅视，其有效范圍在15%到20%之間。現(xiàn)有免疫檢查點封鎖療法的主要局限性在于多種免疫檢查點通路旦万，以及免疫細胞不浸潤腫瘤闹击，免疫細胞過度衰竭。因此成艘，識別新的免疫檢查點和開發(fā)新的聯(lián)合治療已成為HCC免疫治療研究的主要重點赏半。

鋅指蛋白207(ZNF207)是ZNF蛋白家族的一員，在人類胚胎干細胞的自遺傳淆两、多能性和分化中發(fā)揮重要作用断箫。HCC細胞中ZNF207的表達升高，這與預后不良相關秋冰，但具體機制尚未闡明仲义，其在腫瘤免疫中的作用尚未確定。

研究結果：

一剑勾、ZNF207是HCC中潛在的免疫抑制靶點

1埃撵、使用癌癥免疫周期評分和HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行WGCNA網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)了兩個具有相似的內(nèi)部表達模式的聚類(圖1A)虽另。聚類1中的模塊與癌癥免疫周期的步驟1-4呈正相關暂刘，而聚類2中的模塊與步驟5-7呈負相關(圖1B)。

2捂刺、棕色模塊基因富集在免疫相關信號通路顯示正相關的癌癥免疫周期(圖1C)谣拣，而綠松石基因模塊主要富集在RNA運輸、RNA剪接和紡錘體組裝過程顯示負相關步驟5-7的癌癥免疫周期(圖1d)族展。

3森缠、從兩個標準中篩選了綠松石色模塊中的核心基因。DEAHbox蛋白9(DHX9)和ZNF207均符合篩選標準(圖1E)仪缸。

4辅鲸、對22份臨床HCC樣本進行RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)ZNF207與CD4腹殿、FOXP3、CD11b例书、CD68呈很強的正相關锣尉。CD8A、C2决采、C3和細胞毒性T細胞自沧、補體免疫反應相關（圖1F-I）

二、ZNF207在HCC中高表達，并與不良預后相關

1拇厢、ZNF207在HCC組織中的表達量高于鄰近樣本(圖2A)爱谁；來自Oncomine和GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示出了一致的趨勢(圖2B、C)孝偎；在HCC樣本中访敌，ZNF207在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均顯著增加(圖2D、E)衣盾；免疫組化(IHC)分析顯示寺旺，ZNF207主要在細胞核中過表達(過表達(OE))，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用相一致(圖2F)势决。

2阻塑、在ZNF207高表達組中，HCC患者表現(xiàn)出更多的晚期果复、分級和T期(圖2G)陈莽，在多個數(shù)據(jù)集中也表現(xiàn)出更短的總體和無病生存結果(圖2H)

三、缺氧使HCC中的ZNF207升高

1虽抄、通過基因集合富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)“HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP”基因特征在ZNF207高組中顯著富集(圖3A)走搁。

2、在實驗中极颓，我們觀察到物理和化學模擬的缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平(圖3B朱盐、C) ；相比之下菠隆，BAY87-2243在缺氧條件下對ZNF207有較強的抑制作用(圖3D兵琳，E)。過表達HIF1α和HIF2α骇径，我們發(fā)現(xiàn)缺氧對ZNF207的影響可重復(圖3F躯肌，G)。

3破衔、使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鯤IF對ZNF207的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用清女，結果表明缺氧和氯化鈷均增強了ZNF207啟動子基因的熒光強度(圖3H)；CHIP實驗驗證結合位點（圖3I）

4晰筛、在常氧和缺氧條件下嫡丙，位于TSS-1012/-1017bp的DNA序列與抗HIF2α抗體免疫沉淀(圖3J)。簡而言之读第，缺氧可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來提高HCC中ZNF207的表達曙博。

四、ZNF207促進與CD8+t細胞浸潤和衰竭相關的HCC

1怜瞒、ZNF207-KD或ZNF207-OE并沒有改變免疫缺陷小鼠中異種移植瘤的生長速率(圖4A父泳，B)；ZNF207-KD或ZNF207-OEHepa1-6細胞顯著影響腫瘤生長速率，但體外細胞增殖無差異(圖4C惠窄、D)蒸眠；ZNF207-KD或ZNF207-OE腺相關病毒8顯著改變了免疫活性小鼠(BALB/c小鼠)的腫瘤生長(圖4E)

2、ZNF207-KDHepa1-6細胞的條件培養(yǎng)基對自然殺傷細胞杆融、B細胞和巨噬細胞沒有明顯的趨化作用楞卡，而對CD8+T細胞有明顯的趨化作用(圖4G)；條件培養(yǎng)基在體外也抑制了CD8+T細胞的衰竭(圖4H)擒贸，從而提高了其增殖和細胞因子分泌水平(圖4I)

3臀晃、在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中，ZNF207與耗盡的t細胞基因特征和免疫檢查點分子呈正相關介劫，與實驗結果一致(圖4J，K)座韵。

五誉碴、ZNF207通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+t細胞浸潤

1、GSEA結果顯示黔帕，ZNF207-KD組的免疫和代謝相關信號通路顯著富集(圖5A)成黄；趨化因子，細胞因子-細胞因子受體的相互作用思瘟，t細胞受體信號通路表達上調(diào)(圖5B)闻伶。

2、一些細胞因子與t細胞的趨化性密切相關光绕，CX3CL1在上清液和裂解液中有一致的趨勢(圖5C)畜份。

3、通過ELISA證實了細胞上清液中CX3CL1的上調(diào)(圖5D)。此外顶别，在人類HCC樣本中，ZNF207和CX3CL1之間存在很強的負相關關系(圖5E)驯绎。

4剩失、當用CX3CL1中和劑處理時，條件培養(yǎng)基對CD8+T細胞的趨化作用減弱(圖5F)拴孤，說明ZNF207-kd誘導的CX3CL1分泌是否對CD8+T細胞的趨化性至關重要

5演熟、聯(lián)合生存分析還顯示，CX3CL-1低ZNF207高組患者的總生存期(OS)最差芒粹，HR最高化漆，而CX3CL1高ZNF207低組患者的生存結局最好(圖5G)

6、MAPK信號通路在ZNF207-KD組中顯著富集(圖5A座云，H)疙教。證實了p38MAPK抑制劑(SB203580)可以直接抑制Hepa1-6細胞中的CX3CL1，而ZNF207-KD對CX3CL1的過表達也可以被SB203580逆轉(zhuǎn)(圖5I限佩，J)裸弦。

六、ZNF207通過增加核嘌呤水平促進CD8+t細胞衰竭

1晕城、與途徑富集結果一致窖贤，ZNF207-KD處理后，以氨基酸為代表的代謝物差異顯著(圖6A)滤蝠。

2、ZNF207-KD后锣险，色氨酸代謝途徑中的代謝產(chǎn)物水平览闰，包括嘌呤的代謝產(chǎn)物水平被顯著抑制(圖6B)压鉴；ZNF207-kd抑制了細胞上清液中的核嘌呤水平，而增加了ZNF207的穩(wěn)定表達(圖6C)

3掩幢、補充嘌氨酸顯著誘導了CD8+t細胞衰竭(圖6D)

七上鞠、ZNF207轉(zhuǎn)錄調(diào)控IDO1促進腎苷的產(chǎn)生

雙熒光素報告基因和CHIP實驗結果表明ZNF207可結合到IDO1啟動子區(qū)(圖6E-F)芍阎；用特異性抑制劑PF-06840003抑制IDO1，可逆轉(zhuǎn)ZNF207表達介導的kynurenine 水平(圖6G)轮听；PF-06840003處理逆轉(zhuǎn)了來自ZNF207-OE細胞系的條件培養(yǎng)基引起的CD8+t細胞衰竭(圖6H)

八岭佳、ZNF207是聯(lián)合抗pd1治療的潛在治療靶點

1珊随、ZNF207-KD聯(lián)合PD1單克隆抗體可抑制腫瘤生長，具有突出的腫瘤抑制作用(圖7A-C)

2鲫凶、ZNF207-KD+抗PD1治療組PCNA陽性細胞比例最低衩辟，而浸潤性T細胞明顯增加(圖7D)

3、使用腫瘤免疫功能障礙和排除(TIDE)子圖算法來預測TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中不同ZNF207表達的患者的免疫治療反應率(圖7E)

4昼钻、ZNF207低表達組對免疫治療更為敏感、(圖7F)折晦；ZNF207低表達組的患者對PD1單克隆抗體治療的反應優(yōu)于CTLA-4單克隆抗體(圖7G)沾瓦。

5贯莺、圖7H顯示了缺氧如何通過HIF蛋白轉(zhuǎn)錄提高ZNF207

總結：

在本研究中宁改，系統(tǒng)結合生物信息學方法和實驗技術还蹲，評價免疫抑制靶點ZNF207在HCC的體外和體內(nèi)的作用。抑制ZNF207增強了cx3cl1誘導的CD8+T細胞向腫瘤組織的趨化性潭兽。此外斗遏，沉默ZNF207通過抑制IDO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控诵次，減少了嘌呤的合成，從而反過來逆轉(zhuǎn)了CD8+t細胞的衰竭铸本，從而重塑了腫瘤微環(huán)境遵堵。此外，還驗證了其作為抗程序性細胞死亡蛋白1(PD1)治療的生物標志物和聯(lián)合靶點的潛力汪茧。最后研究了ZNF207異常表達在HCC中的作用及其在CD8+t細胞調(diào)控方面加速HCC進展的機制舱污。本研究詳細闡述對HCC進展激活機制的理解弥虐，并為HCC的治療和預后提供潛在的治療靶點。

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