生信小課堂
影響因子：13.75
小編一直覺得單基因泛癌的文章進可攻（純生信發(fā)文）退可守（補實驗）。小編已經(jīng)有不少客戶發(fā)了單基因生信文章后无切，開始做實驗進行深入研究荡短，后續(xù)可以繼續(xù)發(fā)文章寫基金。比較老的客戶已經(jīng)成功拿到經(jīng)費哆键。
之前小編寫過生信篩選的單基因如何補充實驗
[單基因泛癌如何補實驗掘托？]
當時小編列舉了一些實驗，本文作者做了表達驗證籍嘹，預(yù)后驗證闪盔，與免疫檢查點的相關(guān)性，分子機制辱士，對CD8T細胞浸潤的影響泪掀，與免疫檢查點抑制劑的連用。本文屬于生信與實驗結(jié)合的十分緊密的文章颂碘。對于有時間有經(jīng)費的朋友异赫，在篩選到好的基因后，也可以參考這些做后續(xù)的研究凭涂。下圖中打勾的都是本文做了的內(nèi)容祝辣。
研究背景：
肝細胞癌(HCC)是全球?qū)е掳┌Y相關(guān)死亡的第三大原因，在一線和二線臨床環(huán)境中切油，III期臨床試驗未能顯示免疫檢查點封鎖劑治療的益處蝙斜。當使用這些藥物作為HCC的單一治療時，其有效范圍在15%到20%之間∨旌現(xiàn)有免疫檢查點封鎖療法的主要局限性在于多種免疫檢查點通路孕荠，以及免疫細胞不浸潤腫瘤娩鹉，免疫細胞過度衰竭。因此稚伍，識別新的免疫檢查點和開發(fā)新的聯(lián)合治療已成為HCC免疫治療研究的主要重點弯予。
鋅指蛋白207(ZNF207)是ZNF蛋白家族的一員，在人類胚胎干細胞的自遺傳个曙、多能性和分化中發(fā)揮重要作用锈嫩。HCC細胞中ZNF207的表達升高，這與預(yù)后不良相關(guān)垦搬，但具體機制尚未闡明呼寸，其在腫瘤免疫中的作用尚未確定。
研究結(jié)果：
一猴贰、ZNF207是HCC中潛在的免疫抑制靶點
1对雪、使用癌癥免疫周期評分和HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行WGCNA網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)了兩個具有相似的內(nèi)部表達模式的聚類(圖1A)米绕。聚類1中的模塊與癌癥免疫周期的步驟1-4呈正相關(guān)瑟捣，而聚類2中的模塊與步驟5-7呈負相關(guān)(圖1B)。
2栅干、棕色模塊基因富集在免疫相關(guān)信號通路顯示正相關(guān)的癌癥免疫周期(圖1C)迈套，而綠松石基因模塊主要富集在RNA運輸、RNA剪接和紡錘體組裝過程顯示負相關(guān)步驟5-7的癌癥免疫周期(圖1d)非驮。
3交汤、從兩個標準中篩選了綠松石色模塊中的核心基因。DEAHbox蛋白9(DHX9)和ZNF207均符合篩選標準(圖1E)劫笙。
4芙扎、對22份臨床HCC樣本進行RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)ZNF207與CD4填大、FOXP3戒洼、CD11b、CD68呈很強的正相關(guān)允华。CD8A圈浇、C2、C3和細胞毒性T細胞靴寂、補體免疫反應(yīng)相關(guān)（圖1F-I）
二磷蜀、ZNF207在HCC中高表達，并與不良預(yù)后相關(guān)
1百炬、ZNF207在HCC組織中的表達量高于鄰近樣本(圖2A)褐隆；來自O(shè)ncomine和GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示出了一致的趨勢(圖2B、C)剖踊；在HCC樣本中庶弃，ZNF207在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均顯著增加(圖2D衫贬、E)；免疫組化(IHC)分析顯示歇攻，ZNF207主要在細胞核中過表達(過表達(OE))固惯，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用相一致(圖2F)。
2缴守、在ZNF207高表達組中葬毫，HCC患者表現(xiàn)出更多的晚期、分級和T期(圖2G)屡穗，在多個數(shù)據(jù)集中也表現(xiàn)出更短的總體和無病生存結(jié)果(圖2H)
三供常、缺氧使HCC中的ZNF207升高
1、通過基因集合富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)“HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP”基因特征在ZNF207高組中顯著富集(圖3A)鸡捐。
2、在實驗中麻裁，我們觀察到物理和化學模擬的缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平(圖3B箍镜、C) ；相比之下煎源，BAY87-2243在缺氧條件下對ZNF207有較強的抑制作用(圖3D色迂，E)。過表達HIF1α和HIF2α手销，我們發(fā)現(xiàn)缺氧對ZNF207的影響可重復(圖3F歇僧，G)。
3锋拖、使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鯤IF對ZNF207的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用诈悍，結(jié)果表明缺氧和氯化鈷均增強了ZNF207啟動子基因的熒光強度(圖3H)；CHIP實驗驗證結(jié)合位點（圖3I）
4兽埃、在常氧和缺氧條件下侥钳，位于TSS-1012/-1017bp的DNA序列與抗HIF2α抗體免疫沉淀(圖3J)。簡而言之柄错，缺氧可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來提高HCC中ZNF207的表達舷夺。
四、ZNF207促進與CD8+t細胞浸潤和衰竭相關(guān)的HCC
1售貌、ZNF207-KD或ZNF207-OE并沒有改變免疫缺陷小鼠中異種移植瘤的生長速率(圖4A给猾，B)；ZNF207-KD或ZNF207-OEHepa1-6細胞顯著影響腫瘤生長速率颂跨，但體外細胞增殖無差異(圖4C敢伸、D)；ZNF207-KD或ZNF207-OE腺相關(guān)病毒8顯著改變了免疫活性小鼠(BALB/c小鼠)的腫瘤生長(圖4E)
2毫捣、ZNF207-KDHepa1-6細胞的條件培養(yǎng)基對自然殺傷細胞帝际、B細胞和巨噬細胞沒有明顯的趨化作用，而對CD8+T細胞有明顯的趨化作用(圖4G)饶辙；條件培養(yǎng)基在體外也抑制了CD8+T細胞的衰竭(圖4H)蹲诀，從而提高了其增殖和細胞因子分泌水平(圖4I)
3脯爪、在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中掖举，ZNF207與耗盡的t細胞基因特征和免疫檢查點分子呈正相關(guān)，與實驗結(jié)果一致(圖4J名秀，K)汁掠。
五负间、ZNF207通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+t細胞浸潤
1态秧、GSEA結(jié)果顯示，ZNF207-KD組的免疫和代謝相關(guān)信號通路顯著富集(圖5A)昏滴；趨化因子，細胞因子-細胞因子受體的相互作用姻几，t細胞受體信號通路表達上調(diào)(圖5B)。
2柑爸、一些細胞因子與t細胞的趨化性密切相關(guān)，CX3CL1在上清液和裂解液中有一致的趨勢(圖5C)。
3飘庄、通過ELISA證實了細胞上清液中CX3CL1的上調(diào)(圖5D)迂求。此外揩局，在人類HCC樣本中，ZNF207和CX3CL1之間存在很強的負相關(guān)關(guān)系(圖5E)涩盾。
4十气、當用CX3CL1中和劑處理時，條件培養(yǎng)基對CD8+T細胞的趨化作用減弱(圖5F)春霍，說明ZNF207-kd誘導的CX3CL1分泌是否對CD8+T細胞的趨化性至關(guān)重要
5砸西、聯(lián)合生存分析還顯示，CX3CL-1低ZNF207高組患者的總生存期(OS)最差址儒，HR最高芹枷，而CX3CL1高ZNF207低組患者的生存結(jié)局最好(圖5G)
6、MAPK信號通路在ZNF207-KD組中顯著富集(圖5A莲趣，H)鸳慈。證實了p38MAPK抑制劑(SB203580)可以直接抑制Hepa1-6細胞中的CX3CL1，而ZNF207-KD對CX3CL1的過表達也可以被SB203580逆轉(zhuǎn)(圖5I喧伞，J)走芋。
六、ZNF207通過增加核嘌呤水平促進CD8+t細胞衰竭
1潘鲫、與途徑富集結(jié)果一致翁逞，ZNF207-KD處理后，以氨基酸為代表的代謝物差異顯著(圖6A)溉仑。
2挖函、ZNF207-KD后，色氨酸代謝途徑中的代謝產(chǎn)物水平浊竟，包括嘌呤的代謝產(chǎn)物水平被顯著抑制(圖6B)怨喘；ZNF207-kd抑制了細胞上清液中的核嘌呤水平，而增加了ZNF207的穩(wěn)定表達(圖6C)
3振定、補充嘌氨酸顯著誘導了CD8+t細胞衰竭(圖6D)
七哲思、ZNF207轉(zhuǎn)錄調(diào)控IDO1促進腎苷的產(chǎn)生
雙熒光素報告基因和CHIP實驗結(jié)果表明ZNF207可結(jié)合到IDO1啟動子區(qū)(圖6E-F)；用特異性抑制劑PF-06840003抑制IDO1吩案，可逆轉(zhuǎn)ZNF207表達介導的kynurenine 水平(圖6G)棚赔；PF-06840003處理逆轉(zhuǎn)了來自ZNF207-OE細胞系的條件培養(yǎng)基引起的CD8+t細胞衰竭(圖6H)
八、ZNF207是聯(lián)合抗pd1治療的潛在治療靶點
1、ZNF207-KD聯(lián)合PD1單克隆抗體可抑制腫瘤生長靠益，具有突出的腫瘤抑制作用(圖7A-C)
2丧肴、ZNF207-KD+抗PD1治療組PCNA陽性細胞比例最低，而浸潤性T細胞明顯增加(圖7D)
3胧后、使用腫瘤免疫功能障礙和排除(TIDE)子圖算法來預(yù)測TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中不同ZNF207表達的患者的免疫治療反應(yīng)率(圖7E)
4芋浮、ZNF207低表達組對免疫治療更為敏感、(圖7F)壳快；ZNF207低表達組的患者對PD1單克隆抗體治療的反應(yīng)優(yōu)于CTLA-4單克隆抗體(圖7G)纸巷。
5、圖7H顯示了缺氧如何通過HIF蛋白轉(zhuǎn)錄提高ZNF207
總結(jié)：
在本研究中眶痰，系統(tǒng)結(jié)合生物信息學方法和實驗技術(shù)瘤旨，評價免疫抑制靶點ZNF207在HCC的體外和體內(nèi)的作用。抑制ZNF207增強了cx3cl1誘導的CD8+T細胞向腫瘤組織的趨化性竖伯。此外存哲，沉默ZNF207通過抑制IDO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，減少了嘌呤的合成七婴，從而反過來逆轉(zhuǎn)了CD8+t細胞的衰竭祟偷，從而重塑了腫瘤微環(huán)境。此外打厘，還驗證了其作為抗程序性細胞死亡蛋白1(PD1)治療的生物標志物和聯(lián)合靶點的潛力修肠。最后研究了ZNF207異常表達在HCC中的作用及其在CD8+t細胞調(diào)控方面加速HCC進展的機制。本研究詳細闡述對HCC進展激活機制的理解户盯，并為HCC的治療和預(yù)后提供潛在的治療靶點氛赐。
關(guān)于單基因泛癌分析，我們已經(jīng)介紹了很多先舷。
