生信小課堂
影響因子：13.75
小編最近模仿該思路篩選與免疫周期相關基因驮肉，果不其然篩選的效果非常好！該思路可做純生信已骇，即篩選基因+單基因分析/基因集分析离钝，或者干濕結合，即篩選基因+單基因分析+實驗驗證褪储。想做類似分析的朋友歡迎交流卵渴！
小編一直覺得單基因泛癌的文章進可攻（純生信發(fā)文）退可守（補實驗）。小編已經(jīng)有不少朋友發(fā)了單基因生信文章后鲤竹，開始做實驗進行深入研究浪读，后續(xù)可以繼續(xù)發(fā)文章寫基金。比較老的客戶已經(jīng)成功拿到經(jīng)費宛裕。
之前小編寫過生信篩選的單基因如何補充實驗
[單基因泛癌如何補實驗瑟啃？]
當時小編列舉了一些實驗，本文作者做了表達驗證揩尸，預后驗證蛹屿，與免疫檢查點的相關性，分子機制岩榆，對CD8T細胞浸潤的影響错负，與免疫檢查點抑制劑的連用。本文屬于生信與實驗結合的十分緊密的文章勇边。對于有時間有經(jīng)費的朋友犹撒，在篩選到好的基因后，也可以參考這些做后續(xù)的研究粒褒。下圖中打勾的都是本文做了的內(nèi)容识颊。
研究背景：肝細胞癌(HCC)是全球?qū)е掳┌Y相關死亡的第三大原因，在一線和二線臨床環(huán)境中奕坟，III期臨床試驗未能顯示免疫檢查點封鎖劑治療的益處祥款。當使用這些藥物作為HCC的單一治療時，其有效范圍在15%到20%之間≡律迹現(xiàn)有免疫檢查點封鎖療法的主要局限性在于多種免疫檢查點通路刃跛，以及免疫細胞不浸潤腫瘤，免疫細胞過度衰竭苛萎。因此桨昙，識別新的免疫檢查點和開發(fā)新的聯(lián)合治療已成為HCC免疫治療研究的主要重點检号。
鋅指蛋白207(ZNF207)是ZNF蛋白家族的一員，在人類胚胎干細胞的自遺傳蛙酪、多能性和分化中發(fā)揮重要作用齐苛。HCC細胞中ZNF207的表達升高，這與預后不良相關滤否，但具體機制尚未闡明脸狸，其在腫瘤免疫中的作用尚未確定。
研究結果：
一藐俺、ZNF207是HCC中潛在的免疫抑制靶點
1炊甲、使用癌癥免疫周期評分和HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行WGCNA網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)了兩個具有相似的內(nèi)部表達模式的聚類(圖1A)欲芹。聚類1中的模塊與癌癥免疫周期的步驟1-4呈正相關卿啡，而聚類2中的模塊與步驟5-7呈負相關(圖1B)。
2菱父、棕色模塊基因富集在免疫相關信號通路顯示正相關的癌癥免疫周期(圖1C)颈娜，而綠松石基因模塊主要富集在RNA運輸、RNA剪接和紡錘體組裝過程顯示負相關步驟5-7的癌癥免疫周期(圖1d)浙宜。
3官辽、從兩個標準中篩選了綠松石色模塊中的核心基因。DEAHbox蛋白9(DHX9)和ZNF207均符合篩選標準(圖1E)粟瞬。
4同仆、對22份臨床HCC樣本進行RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)ZNF207與CD4裙品、FOXP3俗批、CD11b、CD68呈很強的正相關市怎。CD8A岁忘、C2、C3和細胞毒性T細胞区匠、補體免疫反應相關（圖1F-I）
二干像、ZNF207在HCC中高表達，并與不良預后相關
1驰弄、ZNF207在HCC組織中的表達量高于鄰近樣本(圖2A)蝠筑；來自Oncomine和GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示出了一致的趨勢(圖2B、C)揩懒；在HCC樣本中，ZNF207在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均顯著增加(圖2D挽封、E)已球；免疫組化(IHC)分析顯示臣镣，ZNF207主要在細胞核中過表達(過表達(OE))，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用相一致(圖2F)智亮。
2忆某、在ZNF207高表達組中，HCC患者表現(xiàn)出更多的晚期阔蛉、分級和T期(圖2G)弃舒，在多個數(shù)據(jù)集中也表現(xiàn)出更短的總體和無病生存結果(圖2H)
三、缺氧使HCC中的ZNF207升高
1状原、通過基因集合富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)“HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP”基因特征在ZNF207高組中顯著富集(圖3A)聋呢。
2、在實驗中颠区，我們觀察到物理和化學模擬的缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平(圖3B削锰、C) ；相比之下毕莱，BAY87-2243在缺氧條件下對ZNF207有較強的抑制作用(圖3D器贩，E)。過表達HIF1α和HIF2α朋截，我們發(fā)現(xiàn)缺氧對ZNF207的影響可重復(圖3F蛹稍，G)。
3部服、使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鯤IF對ZNF207的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用唆姐，結果表明缺氧和氯化鈷均增強了ZNF207啟動子基因的熒光強度(圖3H)；CHIP實驗驗證結合位點（圖3I）
4饲宿、在常氧和缺氧條件下厦酬，位于TSS-1012/-1017bp的DNA序列與抗HIF2α抗體免疫沉淀(圖3J)。簡而言之瘫想，缺氧可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來提高HCC中ZNF207的表達仗阅。
四、ZNF207促進與CD8+t細胞浸潤和衰竭相關的HCC
1国夜、ZNF207-KD或ZNF207-OE并沒有改變免疫缺陷小鼠中異種移植瘤的生長速率(圖4A减噪，B)；ZNF207-KD或ZNF207-OEHepa1-6細胞顯著影響腫瘤生長速率车吹，但體外細胞增殖無差異(圖4C筹裕、D)；ZNF207-KD或ZNF207-OE腺相關病毒8顯著改變了免疫活性小鼠(BALB/c小鼠)的腫瘤生長(圖4E)
2窄驹、ZNF207-KDHepa1-6細胞的條件培養(yǎng)基對自然殺傷細胞朝卒、B細胞和巨噬細胞沒有明顯的趨化作用，而對CD8+T細胞有明顯的趨化作用(圖4G)乐埠；條件培養(yǎng)基在體外也抑制了CD8+T細胞的衰竭(圖4H)抗斤，從而提高了其增殖和細胞因子分泌水平(圖4I)
3囚企、在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中，ZNF207與耗盡的t細胞基因特征和免疫檢查點分子呈正相關瑞眼，與實驗結果一致(圖4J龙宏，K)。
五伤疙、ZNF207通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+t細胞浸潤
1银酗、GSEA結果顯示，ZNF207-KD組的免疫和代謝相關信號通路顯著富集(圖5A)徒像；趨化因子黍特，細胞因子-細胞因子受體的相互作用，t細胞受體信號通路表達上調(diào)(圖5B)厨姚。
2衅澈、一些細胞因子與t細胞的趨化性密切相關，CX3CL1在上清液和裂解液中有一致的趨勢(圖5C)谬墙。
3今布、通過ELISA證實了細胞上清液中CX3CL1的上調(diào)(圖5D)。此外拭抬，在人類HCC樣本中部默，ZNF207和CX3CL1之間存在很強的負相關關系(圖5E)。
4造虎、當用CX3CL1中和劑處理時傅蹂，條件培養(yǎng)基對CD8+T細胞的趨化作用減弱(圖5F)，說明ZNF207-kd誘導的CX3CL1分泌是否對CD8+T細胞的趨化性至關重要
5算凿、聯(lián)合生存分析還顯示份蝴，CX3CL-1低ZNF207高組患者的總生存期(OS)最差，HR最高氓轰，而CX3CL1高ZNF207低組患者的生存結局最好(圖5G)
6婚夫、MAPK信號通路在ZNF207-KD組中顯著富集(圖5A，H)署鸡。證實了p38MAPK抑制劑(SB203580)可以直接抑制Hepa1-6細胞中的CX3CL1案糙，而ZNF207-KD對CX3CL1的過表達也可以被SB203580逆轉(zhuǎn)(圖5I，J)靴庆。
六时捌、ZNF207通過增加核嘌呤水平促進CD8+t細胞衰竭
1、與途徑富集結果一致炉抒，ZNF207-KD處理后奢讨，以氨基酸為代表的代謝物差異顯著(圖6A)。
2焰薄、ZNF207-KD后拿诸，色氨酸代謝途徑中的代謝產(chǎn)物水平入录，包括嘌呤的代謝產(chǎn)物水平被顯著抑制(圖6B)；ZNF207-kd抑制了細胞上清液中的核嘌呤水平佳镜，而增加了ZNF207的穩(wěn)定表達(圖6C)
3、補充嘌氨酸顯著誘導了CD8+t細胞衰竭(圖6D)
七凡桥、ZNF207轉(zhuǎn)錄調(diào)控IDO1促進腎苷的產(chǎn)生
雙熒光素報告基因和CHIP實驗結果表明ZNF207可結合到IDO1啟動子區(qū)(圖6E-F)蟀伸；用特異性抑制劑PF-06840003抑制IDO1，可逆轉(zhuǎn)ZNF207表達介導的kynurenine 水平(圖6G)缅刽；PF-06840003處理逆轉(zhuǎn)了來自ZNF207-OE細胞系的條件培養(yǎng)基引起的CD8+t細胞衰竭(圖6H)
八啊掏、ZNF207是聯(lián)合抗pd1治療的潛在治療靶點
1、ZNF207-KD聯(lián)合PD1單克隆抗體可抑制腫瘤生長衰猛，具有突出的腫瘤抑制作用(圖7A-C)
2迟蜜、ZNF207-KD+抗PD1治療組PCNA陽性細胞比例最低，而浸潤性T細胞明顯增加(圖7D)
3啡省、使用腫瘤免疫功能障礙和排除(TIDE)子圖算法來預測TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中不同ZNF207表達的患者的免疫治療反應率(圖7E)
4娜睛、ZNF207低表達組對免疫治療更為敏感、(圖7F)卦睹；ZNF207低表達組的患者對PD1單克隆抗體治療的反應優(yōu)于CTLA-4單克隆抗體(圖7G)畦戒。
5、圖7H顯示了缺氧如何通過HIF蛋白轉(zhuǎn)錄提高ZNF207
總結：
在本研究中结序，系統(tǒng)結合生物信息學方法和實驗技術障斋，評價免疫抑制靶點ZNF207在HCC的體外和體內(nèi)的作用。抑制ZNF207增強了cx3cl1誘導的CD8+T細胞向腫瘤組織的趨化性徐鹤。此外垃环，沉默ZNF207通過抑制IDO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，減少了嘌呤的合成返敬，從而反過來逆轉(zhuǎn)了CD8+t細胞的衰竭遂庄，從而重塑了腫瘤微環(huán)境。此外救赐，還驗證了其作為抗程序性細胞死亡蛋白1(PD1)治療的生物標志物和聯(lián)合靶點的潛力涧团。最后研究了ZNF207異常表達在HCC中的作用及其在CD8+t細胞調(diào)控方面加速HCC進展的機制。本研究詳細闡述對HCC進展激活機制的理解经磅，并為HCC的治療和預后提供潛在的治療靶點泌绣。
