編者按：隨著10X genomics于2019年11月發(fā)布Visium Spatial Gene Expression Solution咨堤，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial Transcriptome梦谜，ST）研究如火如荼。
愛麗慕斯（ANIMUS）團(tuán)隊(duì)眶掌，經(jīng)過近一年不懈努力，隆重推出10X 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)巴碗，提供空間轉(zhuǎn)錄組方案設(shè)計(jì)朴爬、實(shí)驗(yàn)定制、生信分析和數(shù)據(jù)可視化等高水平一站式服務(wù)橡淆。隨著2020年8月利用空間轉(zhuǎn)錄組研究AD的Cell文章見刊召噩，國內(nèi)外團(tuán)隊(duì)如斯坦福大學(xué)Robert Roth等、浙江大學(xué)Jie Liao和Xiaohui Fan等對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)綜述文章更是點(diǎn)燃這一領(lǐng)域逸爵。這里愛麗慕斯團(tuán)隊(duì)對相關(guān)文章和進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)具滴， 以饗讀者。
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一 細(xì)胞學(xué)研究時(shí)代
一個(gè)多世紀(jì)前构韵，現(xiàn)代病理學(xué)之父魯?shù)婪颉ぞS喬（Rudolph Virchow）開創(chuàng)了細(xì)胞時(shí)代，他指出所有疾病都起源于細(xì)胞。矛盾的是疲恢，盡管人們一致認(rèn)為細(xì)胞是多細(xì)胞生物的基本單元凶朗，但現(xiàn)代細(xì)胞和分子生物學(xué)知識(shí)主要來源于細(xì)胞群體的批量分析，而目前對器官和組織等進(jìn)行基因表達(dá)分析的主流技術(shù)依然是批量RNA測序（bulk RNA-seq）显拳。雖然bulk RNA-seq能夠全面快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA的序列和表達(dá)信息棚愤，但其分辨率低，結(jié)果是很多細(xì)胞混合后的“平均值”杂数，差異表達(dá)基因存在一定假陽性和假陰性宛畦，組織異質(zhì)性被掩蓋（圖1）。
二 單細(xì)胞研究
因此耍休，對組織和器官進(jìn)行單細(xì)胞分辨率研究越來越重要刃永。早期單細(xì)胞研究主要使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、熒光活化細(xì)胞分選法（FACS）和免疫熒光原位雜交（FISH）羊精，只能研究數(shù)量有限的基因或蛋白質(zhì)斯够。隨著技術(shù)進(jìn)步，鑒定到基因或蛋白的通量日益增加⌒酰現(xiàn)在读规，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（CyTOF）使用金屬結(jié)合抗體可同時(shí)檢測多達(dá)40種蛋白質(zhì)。這些技術(shù)有助于描述細(xì)胞類型和亞型燃少，但它們依賴于一組預(yù)先設(shè)計(jì)的基因或蛋白束亏，這可能會(huì)使研究產(chǎn)生偏倚，并且需要先驗(yàn)知識(shí)阵具，比如提前確認(rèn)細(xì)胞表面的關(guān)鍵分子標(biāo)志物碍遍，而這些分子標(biāo)志物往往是未知的。 相比之下阳液，單細(xì)胞基因組學(xué)提供了在單細(xì)胞水平上以一種無偏倚怕敬、高通量方式來分析組織的方法。2009年帘皿，湯富酬教授等人提出了第一個(gè)基于改進(jìn)的cDNA擴(kuò)增的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法（scRNA-seq）东跪，在含有裂解緩沖液的Eppendorf管中分離單個(gè)卵母細(xì)胞（Tang’s Method）。兩年后鹰溜，Navin等人從乳腺癌樣本中產(chǎn)生了第一個(gè)單細(xì)胞基因組虽填。正是這些開創(chuàng)性研究打開了單細(xì)胞基因組學(xué)新領(lǐng)域大門。近10年來曹动，各種單細(xì)胞研究方法層出不窮（見圖2和表1）斋日，所有步驟都脫胎于bulk RNA-seq protocols。這些scRNA-seq方法都需要解離實(shí)體組織以獲得單細(xì)胞墓陈，并對其RNA進(jìn)行標(biāo)記和擴(kuò)增以進(jìn)行測序桑驱，差別主要在于單細(xì)胞分離技術(shù)竭恬。
目前主流細(xì)胞分離技術(shù)如下：
Micropipetting micromanipulation（口吸管技術(shù)）跛蛋；
Laser capture microdissection（激光捕獲顯微切割技術(shù)）熬的；
Fluorescence activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS（流式細(xì)胞儀技術(shù)）赊级；
Microdroplets（微滴技術(shù)）押框；
Microfluidics（微流體技術(shù)）；
單細(xì)胞技術(shù)主要應(yīng)用于以下方向：
研究一個(gè)組織中細(xì)胞種類理逊；
識(shí)別罕見或未知細(xì)胞類型或狀態(tài)橡伞；
闡明在分化過程或時(shí)間及狀態(tài)變化中基因表達(dá)的改變；
找出在不同條件下（如生理和病理）在某一特定類型細(xì)胞中差異表達(dá)基因晋被；
探究細(xì)胞類型之間基因表達(dá)的變化兑徘，同時(shí)納入空間、調(diào)控和（或）蛋白質(zhì)信息羡洛；
單細(xì)胞測序常見分析方法包括：
探究異質(zhì)性 (Studying heterogeneity)挂脑；
譜系路徑分析 (Lineage tracing study)；
隨機(jī)基因表達(dá)研究 (Stochastic gene expression study)欲侮；
單細(xì)胞測序揭示了過去我們認(rèn)為透徹研究疾病中存在著未知細(xì)胞類型崭闲，例如發(fā)現(xiàn)肺離子細(xì)胞(ionocyte cells)，這可能與囊性纖維化病理學(xué)機(jī)制有關(guān)威蕉。 單細(xì)胞方法比批量分析的核心優(yōu)勢在于刁俭，保留單細(xì)胞信息可以揭示罕見細(xì)胞特性和生物學(xué)意義上的細(xì)胞間異質(zhì)性。然而韧涨，與循環(huán)血細(xì)胞不同的是牍戚，固體組織和器官必須通過機(jī)械或酶分解才能進(jìn)行單細(xì)胞分析。這個(gè)過程不可避免地會(huì)導(dǎo)致位置信息丟失虑粥，使得無法評(píng)估單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組在整個(gè)組織中空間組織方式如孝，同時(shí)也會(huì)在一定程度上改變細(xì)胞狀態(tài)及其基因表達(dá)狀態(tài)。
三 空間轉(zhuǎn)錄組研究
空間異質(zhì)性是器官功能的一個(gè)重要特征舀奶。人體組織是高度復(fù)雜系統(tǒng)暑竟，由多達(dá)數(shù)萬億個(gè)細(xì)胞組成，這些細(xì)胞在種類育勺、時(shí)間和空間上各不相同但荤，但它們相互協(xié)調(diào)，形成獨(dú)特微環(huán)境涧至，以維持器官功能和處理信息腹躁，進(jìn)而決定細(xì)胞特性。在哺乳動(dòng)物器官中南蓬，具有不同功能類型和發(fā)育（時(shí)間）和區(qū)域（空間）差異的無數(shù)細(xì)胞構(gòu)成了大多數(shù)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性纺非。雖然高通量單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）在推斷細(xì)胞類型和軌跡方面取得了相當(dāng)大成功哑了。目前一些策略已經(jīng)應(yīng)用于揭示細(xì)胞命運(yùn)決定（cell fate decisions）、細(xì)胞譜系（cell lineages）和發(fā)育軌跡（developmental trajectories）烧颖，如偽時(shí)間分析（pseudotemporal analysis）弱左、可標(biāo)記細(xì)胞來源的內(nèi)源性條形碼（endogenous barcoding）、以及在特定時(shí)間間隔內(nèi)連續(xù)取樣（continuous sampling）炕淮。然而拆火，空間異質(zhì)性仍然是一個(gè)棘手問題，因?yàn)榧?xì)胞一旦在懸浮液中分離涂圆，就會(huì)丟失其位置信息们镜。
因此，幾十年來润歉，在空間水平研究組織基因表達(dá)的技術(shù)層出不窮（圖3）模狭。從早期使用熒光原位雜交（FISH）到目前單細(xì)胞分辨率下空間轉(zhuǎn)錄組，以及最近的multiplexed error robust FISH（MERFISH）踩衩。
這里把不同方法根據(jù)其類別用不同形狀、符號(hào)和大小顯示九妈》雌觯縮寫：ExFISH, expansion FISH; FISH, ?uorescencein situhybridization; FISSEQ, ?uorescencein situsequencing; GEO-seq, geographical position sequencing; HDST, high-de?nition spatial transcriptomics; ISS,in situsequencing; LCM, laser capture microdissection; MERFISH, multiplexed error-robust FISH; MAPseq, multiplexed analysis of projections by sequencing; osmFISH, ouroboros single-molecule FISH; PLISH, proximity ligationin situhybridization; secFISH, sequential FISH; smHCR, single-molecule hybridization chain reaction; SRM, super resolution microscopy; STARmap, spatially-resolved transcript amplicon readout mapping; TIVA, transcriptome in vivo analysis; TSCS, topographic single-cell sequencing.
現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組方法可分為四類：
1.基于計(jì)算策略和組學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的空間重建方法；
2.基于激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection萌朱，LCM）與NGS相結(jié)合的直接測量法宴树；
3.基于成像的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)；
4.基于寡核苷酸空間條形碼和NGS的方法晶疼；
每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)酒贬，比如基因概況（即檢測到基因種類數(shù)）和細(xì)胞數(shù)（即一次分析細(xì)胞個(gè)數(shù)）的差異，圖3和表2顯示了用于解碼空間異構(gòu)性的不同方法的通量翠霍。
計(jì)算策略的空間轉(zhuǎn)錄組
由于基于流式細(xì)胞的scRNA-seq丟失了細(xì)胞坐標(biāo)信息锭吨，而RNA-staining方法只檢測了總轉(zhuǎn)錄物的一部分，因此寒匙，計(jì)算生物學(xué)通過整合多尺度數(shù)據(jù)來重建組織的空間轉(zhuǎn)錄組零如。例如，Satija等提出了Seurat（圖4A）锄弱，這是一個(gè)R包考蕾，通過結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)和marker基因的in situhybridizations來推斷細(xì)胞定位。比如会宪，通過SMART-seq獲得斑馬魚胚胎發(fā)育過程中851個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)肖卧，后續(xù)分析將細(xì)胞分為不同類型，并為每種細(xì)胞類型生成landmark基因掸鹅。然后塞帐，landmark基因的FISH數(shù)據(jù)提供了這些表達(dá)模式的空間分布拦赠，產(chǎn)生了landmark基因在整個(gè)組織中的表達(dá)密度。最后根據(jù)marker基因的表達(dá)譜和標(biāo)記基因的表達(dá)密度可以對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定位葵姥。最近荷鼠，這個(gè)小組發(fā)布了Seurat第三個(gè)版本，用于跨數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞信息綜合集成牌里。類似地颊咬，Achim等提出了一種方法，通過比較scRNA-seq數(shù)據(jù)和從單個(gè)基因表達(dá)圖譜中獲得的空間基因表達(dá)（positional gene expression）來定位單個(gè)細(xì)胞牡辽。
此外，Durruthy-Durruthy等建立了一個(gè)使用單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)的空心球形態(tài)學(xué)來實(shí)現(xiàn)組織3D重建的標(biāo)準(zhǔn)方法敞临。這種計(jì)算方法在單個(gè)細(xì)胞的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中态辛，充分利用其內(nèi)在基因表達(dá)模式或共表達(dá)趨勢，從而獲得細(xì)胞間的context挺尿；然而奏黑，這些演繹方法在某些情況下是受限的，只呈現(xiàn)特定組織的空間趨勢或總體布局编矾。因此熟史，需要更深入的分析，才能實(shí)現(xiàn)對組織中實(shí)際的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的更精確定位窄俏。
基于LCM的方法
獲取攜帶精確位置信息轉(zhuǎn)錄本的另一種策略是使用LCM從組織切片中分離單個(gè)細(xì)胞或整個(gè)目標(biāo)區(qū)域蹂匹，LCM是一種顯微鏡引導(dǎo)的強(qiáng)大切割系統(tǒng)，將紫外光作為無接觸和無污染的刀片凹蜈。目標(biāo)細(xì)胞被切割并收集在不同容器中以盡量減少空間信息丟失限寞。隨后，細(xì)胞可以通過直接RNA-seq或預(yù)先設(shè)計(jì)的空間條形碼來標(biāo)記等多步驟過程來獲得其表達(dá)譜仰坦。
LCM-seq（圖4B）旨在為基于LCM的直接scRNA-seq提供標(biāo)準(zhǔn)方法履植。例如，使用LCM與smart-seq2結(jié)合悄晃，對小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和人類死后組織進(jìn)行精確空間轉(zhuǎn)錄組分析玫霎。研究表明，scRNA-seq是可行的妈橄，基于LCM-seq的成功率為62%庶近，在不同情況下表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)谋憷浴４送猓?016年中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心景乃禾&中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦開發(fā)了geographical position sequencing (GEO-seq）眷细，該方法實(shí)現(xiàn)了對少量細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析的同時(shí)拦盹，利用某些特定關(guān)鍵基因（zip-code基因）將細(xì)胞映射回其原始位置，因此保留了細(xì)胞原始空間位置信息（圖4B）溪椎。
此外普舆，Casasent等開發(fā)了一種基于LCM方法恬口，稱為topographic single cell sequencing（TSCS），以比較原位導(dǎo)管癌（DCIS）區(qū)域和浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）區(qū)域細(xì)胞之間基因組變異沼侣。將組織切片放在載玻片上祖能，用蘇木精和伊紅（H&E）染色，以便在顯微鏡下識(shí)別單個(gè)細(xì)胞核（圖4B）蛾洛。然后使用LCM系統(tǒng)從組織切片中捕捉單個(gè)細(xì)胞养铸，同時(shí)記錄每組坐標(biāo)。接下來轧膘，將細(xì)胞分離到一個(gè)預(yù)先編碼的緩沖液中钞螟，在緩沖液中進(jìn)行裂解和全基因組擴(kuò)增（WGA）。最后谎碍，對所有cDNA的NGS建庫測序鳞滨。通過LCM總共分離到1293個(gè)單細(xì)胞，隨后進(jìn)行單核測序（SNS）蟆淀。
基于LCM的轉(zhuǎn)錄組學(xué)或基因組學(xué)成功地獲得了單個(gè)細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄本拯啦，盡管其通量很低，然而熔任，在新技術(shù)（即可以標(biāo)記出成千上萬個(gè)單一的特定位置細(xì)胞的空間條形碼技術(shù)）出現(xiàn)之前褒链，它可以粗略地將少數(shù)細(xì)胞的數(shù)據(jù)整合到構(gòu)成器官的巨大背景中，就像向海洋中注入水滴一樣有用疑苔。
基于成像的In Situ轉(zhuǎn)錄組學(xué)
基于成像的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)使得細(xì)胞通量不再是個(gè)問題甫匹。早期能夠檢測單個(gè)轉(zhuǎn)錄本方法被稱為單分子FISH（smFISH），它使用FISH以亞細(xì)胞分辨率同時(shí)測量一到多個(gè)（通常為3或4個(gè)）mRNA夯巷。隨后唯笙，人們致力于用多通路smFISH以增加每個(gè)細(xì)胞位點(diǎn)可檢測的mRNA種類道伟。Expansion FISH（ExFISH）可以從數(shù)十個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中研究7個(gè)靶基因，而proximity ligationin situhybridization（PLISH）可檢測固定組織中8個(gè)基因。隨后的osmFISH能夠同時(shí)從組織切片中鑒定數(shù)千個(gè)細(xì)胞的33個(gè)基因馏予。Sequential FISH（seqFISH）是另一種通過多輪雜交來編碼單個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同轉(zhuǎn)錄本方法晾蜘。隨著這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步缓升，檢測能力已從固定細(xì)胞（?xed cells）中12個(gè)基因增加到組織切片中10000多個(gè)基因咬最。
類似地，另一種MERFISH方法可以顯著增加單個(gè)細(xì)胞中可測量數(shù)量臀突，高達(dá)1000個(gè)mRNA（圖4C）勉抓。MERFISH不是設(shè)計(jì)一個(gè)獨(dú)特探針靶向特定mRNA，而是整合一個(gè)框架候学，將每個(gè)RNA原位轉(zhuǎn)化為一個(gè)獨(dú)特N位字符（N-bit word）藕筋。通過靶向特定RNA集合的子集，如果觀察點(diǎn)上存在熒光點(diǎn)梳码，則輸出結(jié)果為1隐圾，否則為0伍掀。經(jīng)過N輪雜交后，理論上可以探測到2N-1種RNA暇藏。然而蜜笤，隨著N輪的增加，檢測錯(cuò)誤率逐漸增加盐碱，導(dǎo)致可檢測mRNA種類縮小到1000個(gè)把兔。對N位字符進(jìn)行解碼后，可以將相應(yīng)mRNA映射到它們的空間位置瓮顽。值得注意的是县好，近年來MERFISH在分析超過100萬個(gè)細(xì)胞和靶向10000個(gè)mRNA這兩個(gè)方向上得到了極大改進(jìn)。
18年斯坦福大學(xué)Karl Deisseroth教授新開發(fā)的STARmap（spatially-resolved transcript amplicon readout mapping）趣倾，可直接靶向1000多個(gè)基因聘惦。與其他基于成像的方法相似，水凝膠-組織化學(xué)使得組織內(nèi)每個(gè)細(xì)胞成為RNA成像的可觀察的理想容器（圖4C）儒恋。一個(gè)巧妙的掛鎖系統(tǒng)（padlock system）設(shè)計(jì)，由一對引物和一對掛鎖探針組成黔漂，通過分子內(nèi)交聯(lián)（speci?c ampli?cation of nucleic acids via intramolecular ligation诫尽，SNAIL）對核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增。值得注意的是炬守，只有當(dāng)兩個(gè)引物都與同一個(gè)mRNA對齊時(shí)牧嫉，掛鎖探針才能進(jìn)行滾圈擴(kuò)增并產(chǎn)生一個(gè)稱為擴(kuò)增子的DNA納米球。每個(gè)掛鎖探針都有一個(gè)5位堿基條形碼（庫容量為1024）减途，作為基因特異性標(biāo)識(shí)符酣藻。為降低單堿基測序的錯(cuò)誤率，與傳統(tǒng)僅編碼單個(gè)堿基方法相比鳍置，本研究定制了一種稱為動(dòng)態(tài)退火和交聯(lián)以減少錯(cuò)誤的測序方法（sequencing with error-reduction by dynamic annealing and ligation辽剧，SEDAL），將兩個(gè)連續(xù)堿基編碼為一種顏色税产。經(jīng)過六輪測序后怕轿，每個(gè)條形碼都被解碼并注釋到特定mRNA上。使用這種方法辟拷，可以評(píng)估細(xì)胞類型的空間分布撞羽，并獲得完整組織的三維視圖。相比之下衫冻，有兩種與STARmap原理相似的早期方法诀紊，稱為原位測序（in situsequencing，ISS）和熒光原位測序（fluorescencein situsequencing隅俘，F(xiàn)ISSEQ）邻奠。ISS是一種比STARmap靶向mRNA數(shù)目更少和探測準(zhǔn)確性更低的靶向檢測方法笤喳。FISSEQ通過讀取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的27個(gè)堿基，能夠在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中非特異性檢測到超過8000多種RNA惕澎。然而莉测，由于難以在原位生成長片段reads，因此無法應(yīng)用于組織切片唧喉。最近捣卤，F(xiàn)ürth等提出一種新方法，即原位轉(zhuǎn)錄組可及性測序（in situtranscriptome accessibility sequencing八孝，INSTA-seq）董朝，允許對目前基于雜交的方法或受限于短片段的原位測序無法區(qū)分的小調(diào)控變體（small regulatory variants）進(jìn)行無偏研究。
基于成像的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)在很大程度上增加了可檢測區(qū)域干跛，但也帶來了一些挑戰(zhàn)性問題子姜。例如，一些smFISH方法可以在整個(gè)組織中實(shí)現(xiàn)定量mRNA成像楼入。然而哥捕，單個(gè)細(xì)胞很難從復(fù)雜背景（包括信號(hào)干擾、轉(zhuǎn)錄物積累和細(xì)胞擁擠）中提取出來嘉熊。此外遥赚，與RNA-seq相比，這些靶向方法有較高錯(cuò)誤率并需要預(yù)選基因阐肤。當(dāng)使用一組探針作為誘餌來獲取特定RNA全部信息時(shí)凫佛，很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。與RNA-seq另一個(gè)主要區(qū)別是孕惜，靶向方法不能檢測新序列或小序列變體愧薛。
空間條形碼結(jié)合NGS
考慮到使用探針來原位靶向檢測RNA方法的缺點(diǎn)，人們對直接原位測序或?qū)M織切片進(jìn)行空間標(biāo)記的興趣越來越大衫画。
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial transcriptomics毫炉，ST）（圖4D）通過一種具有大量分散分布100μm大小微孔的特制載玻片來捕獲mRNAs。每個(gè)孔都覆蓋一或多個(gè)寡核苷酸鏈碧磅，該寡核苷酸鏈包含一段每個(gè)微孔特異性的空間條形碼碘箍，和一個(gè)與poly A互補(bǔ)以捕獲mRNA的poly T尾巴。在一個(gè)6 mm×6 mm正方形捕獲區(qū)域中鲸郊，總共產(chǎn)生了1007個(gè)條形碼微孔丰榴。經(jīng)過酶透化后，組織切片中mRNAs從細(xì)胞中釋放到玻片上秆撮，被微孔內(nèi)寡核苷酸捕獲四濒。在載玻片上進(jìn)行cDNA合成。隨后利用NGS進(jìn)行RNA-seq，基于空間條形碼獲取其原始空間位置信息盗蟆。最近戈二，高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（high-definition spatial transcriptomics，HDST）已經(jīng)被開發(fā)出來喳资，它使用分割池方法（split-pool approach）產(chǎn)生高分辨率（2μm）觉吭、高密度（數(shù)百萬）微珠陣列。與ST相比仆邓，HDST明顯提高了空間分辨率鲜滩，但HDST平均每個(gè)微孔（well）有7個(gè)唯一分子標(biāo)識(shí)符（unique molecular identifiers，UMI）节值，嚴(yán)重限制了其測量高豐度基因能力徙硅。
為了給高通量實(shí)驗(yàn)提供足夠空間信息，Slide-seq（圖4D）應(yīng)運(yùn)而生搞疗。在Slide-seq中嗓蘑，首先在涂有橡膠的玻璃蓋玻片表面填充一層10 μm的特異性條形碼微珠（beads）。與其他高通量scRNA-seq方法中使用的微珠類似匿乃，每個(gè)微珠上條形碼是隨機(jī)分布的桩皿。因此，先對每個(gè)微珠上寡核苷酸條形碼進(jìn)行識(shí)別幢炸，再進(jìn)行混合測序业簿。為解決這一問題，Slide-seq后續(xù)利用SOLiD化學(xué)技術(shù)（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）來讀取每個(gè)柱子上不同條形碼阳懂。先識(shí)別每個(gè)10 μm捕獲點(diǎn)（spot）中特異性空間標(biāo)識(shí)符，再行RNA-seq柜思，因此寡核苷酸捕獲的mRNAs可以映射回它們的原始空間坐標(biāo)岩调。Slide-seq以單細(xì)胞分辨率對150萬個(gè)捕獲點(diǎn)進(jìn)行測序。不幸的是赡盘，與Drop-seq相比号枕，Slide-seq每個(gè)微珠的UMI更少。
一旦轉(zhuǎn)錄水平和空間位置有一一對應(yīng)關(guān)系陨享，空間條形碼結(jié)合NGS技術(shù)構(gòu)成了一個(gè)直觀概念來定位大量單點(diǎn)葱淳。因此有兩種方法，一是合成足夠多特異性條形碼并將其分配給特定捕獲點(diǎn)抛姑，二是增加一個(gè)測序步驟以定位每個(gè)編碼的微珠赞厕。然而，這兩種方法都很昂貴定硝，而且都不能在單個(gè)細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)錄本皿桑。
基于條形碼和NGS的空間轉(zhuǎn)錄組，近幾年有了新突破。2016年诲侮，瑞典皇家理工學(xué)院Joakim Lundeberg（瑞典Spatial Transcriptomics公司聯(lián)合創(chuàng)始人）在Science上發(fā)文镀虐，利用基因芯片技術(shù)將位置信息保留在芯片上，再利用二代測序技術(shù)對組織中RNA進(jìn)行測序沟绪，從而生成組織切片上完整的基因表達(dá)圖像刮便。2018年底，10X Genomics宣布收購Spatial Transcriptomics绽慈，并于2019年11月發(fā)布Visium空間基因表達(dá)解決方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）恨旱。
Visium空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程包括4個(gè)步驟：
1.樣本制備（Sample Preparation，SP）久信。新鮮組織樣本進(jìn)行異戊烷固定窖杀、液氮速凍和OCT包埋；隨后用冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片裙士，準(zhǔn)備5~10張切片提取RNA并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估（要求RIN值>7.0）入客；
2.組織透化（Tissue Optimization，TO）腿椎。將切片放置在TO玻片上桌硫，用不同時(shí)間梯度的透化劑處理組織，使細(xì)胞中mRNA落入玻片并與玻片上寡核苷酸標(biāo)簽結(jié)合后啃炸，進(jìn)行cDNA合成铆隘，熒光成像，以確定最佳透化時(shí)間南用。隨后取切片在文庫制備（LP）玻片上進(jìn)行正式透化實(shí)驗(yàn)膀钠。
3.cDNA合成和文庫制備（cDNA generation & Library Preparation）。mRNA的poly A尾巴與探針標(biāo)簽poly T互補(bǔ)裹虫，并合成cDNA肿嘲，構(gòu)建10x Visium文庫 。
4.測序和分析（Sequencing & Data Visualization）筑公。進(jìn)行PE150測序雳窟，并使用相關(guān)工具比如Space Ranger和Loupe Browser 等軟件進(jìn)行可視化分析。
10X Visium空間基因表達(dá)解決方案技術(shù)核心在于2種載玻片匣屡，1種是組織優(yōu)化玻片封救，包含8個(gè)捕獲區(qū)域，其中6個(gè)區(qū)域分別設(shè)置6個(gè)不同透化時(shí)間捣作，另外兩個(gè)區(qū)域1個(gè)為不加透化劑的陰性對照誉结，另1個(gè)為陽性對照，不放組織切片虾宇，而是直接加入RNA搓彻。其實(shí)驗(yàn)流程為：固定→染色→明場拍照→組織透化→熒光cDNA合成→組織移除→熒光掃描如绸，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷最優(yōu)透化時(shí)間。1種是文庫制備玻片（圖6）旭贬，上有4個(gè)捕獲區(qū)域（6.5x6.5mm怔接，圖6中4個(gè)小方框），每個(gè)捕獲區(qū)域含4992個(gè)用條形碼編碼的捕獲點(diǎn)（barcoded spots稀轨，圖6中彩色圓點(diǎn)）扼脐，直徑為55μm，兩個(gè)spot中心的間距為100μm奋刽，每個(gè)spot都有數(shù)百萬條寡核苷酸標(biāo)簽瓦侮，每個(gè)spot上所有寡核苷酸標(biāo)簽的Spatial Barcode序列都是相同的，而不同spot之間Spatial Barcode是不同的佣谐，根據(jù)mRNA對應(yīng)的Spatial Barcode（spot的位置信息）就可以獲取其空間位置信息肚吏。
10X Visium空間轉(zhuǎn)錄組，無需解離單細(xì)胞來制備單細(xì)胞懸液狭魂，與其它方法相比罚攀，實(shí)驗(yàn)流程非常簡單，只需提供H&E染色切片雌澄，就可得到切片相應(yīng)位置基因表達(dá)信息斋泄，將傳統(tǒng)組織學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢與RNA測序的高通量特點(diǎn)相結(jié)合，在組織中呈現(xiàn)基因表達(dá)空間分辨率水平的可視化信息镐牺。除切片機(jī)和顯微鏡外無需額外購買昂貴硬件設(shè)備炫掐，可以實(shí)現(xiàn)相對低成本、一次獲取5000~10000個(gè)細(xì)胞和幾乎全部轉(zhuǎn)錄本睬涧，通量相對較高募胃，主要缺陷是沒有達(dá)到單細(xì)胞分辨率（每個(gè)spot中有1-10個(gè)細(xì)胞）。
四 空間轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用
雖然目前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)尚不完善畦浓，但已廣泛應(yīng)用于臨床和生物學(xué)研究中摔认。
發(fā)現(xiàn)疾病的空間異質(zhì)性
基因表達(dá)在許多生物過程中呈現(xiàn)空間模式。然而這些模式很少是通過傳統(tǒng)bulkRNA-seq或經(jīng)典scRNA-seq發(fā)現(xiàn)的宅粥。在疾病發(fā)生發(fā)展中，空間異質(zhì)性至關(guān)重要电谣。同時(shí)研究病變組織中細(xì)胞類型及其定位迫切需要空間轉(zhuǎn)錄組秽梅。例如，在小鼠阿爾茨海默步宋（AD）模型中使用scRNA-seq企垦，發(fā)現(xiàn)一種新的小膠質(zhì)細(xì)胞類型與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。為了定位這些小膠質(zhì)細(xì)胞晒来，作者鑒定了標(biāo)記物并使用smFISH來“照亮”它們钞诡。在該研究中，這些被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞特異性定位在AD斑塊附近，這表明這種細(xì)胞類型可能與AD起源密切相關(guān)荧降，并為開發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞激活藥物作為靶向治療策略提供了新思路接箫。此外，在與大量表型變化相關(guān)疾病中朵诫，如癌癥辛友，不同細(xì)胞的基因表達(dá)可能會(huì)有明顯差異以適應(yīng)各自微環(huán)境。例如剪返，Little等在病理標(biāo)本中使用詳細(xì)的多色FISH技術(shù)研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤废累，在幾乎沒有血管的區(qū)域觀察到癌細(xì)胞。而且這些細(xì)胞表現(xiàn)出表皮生長因子受體的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增脱盲，而血小板衍生生長因子受體基因擴(kuò)增的癌細(xì)胞則在內(nèi)皮細(xì)胞附近富集邑滨。相比之下，基于LCM的方法適合于小樣本（如臨床樣本）和全轉(zhuǎn)錄組或基因組分析钱反，因?yàn)槠浼?xì)胞吞吐量低掖看，但它能實(shí)現(xiàn)全基因覆蓋和無偏見的細(xì)胞分離。
構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組圖譜
利用空間分辨的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)诈铛，在分子水平研究生命體結(jié)構(gòu)的重要步驟是構(gòu)建圖譜乙各。因此美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）將在未來7年內(nèi)投入大量精力，開發(fā)一套史無前例的人類生物分子圖譜幢竹。美國國立衛(wèi)生研究院共同基金人類生物分子圖譜計(jì)劃（Human Biomolecular Atlas Program耳峦，HuBMAP）旨在通過支持技術(shù)開發(fā)、數(shù)據(jù)采集和精細(xì)空間定位焕毫，建立一個(gè)單細(xì)胞分辨率開放式圖譜框架蹲坷。在小鼠中，除了基于MERFISH從小鼠大腦中下丘腦視前區(qū)110萬個(gè)細(xì)胞中繪制了轉(zhuǎn)錄組圖景外邑飒，Deisseroth等擴(kuò)展了他們的STARmap方法循签，在6層完整的小鼠初級(jí)視覺皮層的30000多個(gè)細(xì)胞中研究了23個(gè)細(xì)胞類型marker的表達(dá)譜，以進(jìn)一步研究完整大腦的三維復(fù)雜性疙咸。Zeisel等結(jié)合scRNA-seq和FISH揭示了小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的分子結(jié)構(gòu)县匠。他們繪制了大腦各個(gè)區(qū)域的細(xì)胞圖譜，并提供了一個(gè)按區(qū)域劃分的基因表達(dá)圖景和一個(gè)用于下一步研究的參考圖譜撒轮。Asp等利用ST來研究人類心臟發(fā)育過程的時(shí)空基因表達(dá)譜乞旦。因此建立了一個(gè)跨越時(shí)間和空間的人類心臟發(fā)育圖譜。只有通過這些技術(shù)整合题山，提高細(xì)胞和基因的檢測通量兰粉，同時(shí)保留細(xì)胞空間環(huán)境信息，才有可能建立一個(gè)完整生命體結(jié)構(gòu)的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜顶瞳。
描繪胚胎發(fā)育和空間藍(lán)圖
胚胎發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜過程玖姑，其分子水平動(dòng)態(tài)變化非常迅速愕秫。解析這種時(shí)間和空間維度的微變化一直是個(gè)挑戰(zhàn)。利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)構(gòu)建胚胎發(fā)育的空間表達(dá)藍(lán)圖焰络。在黑腹果蠅（D.melanogaster）與擬果蠅（D.Simulansbias）雜交胚胎發(fā)育過程中戴甩，即使與幾乎同一物種相比其基因調(diào)控也表現(xiàn)出空間差異√蚶牛空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)受空間調(diào)控的不同基因等恐，最后分別鑒定了84個(gè)和39個(gè)具有黑腹果蠅和擬果蠅偏好的特異性表達(dá)的等位基因。此外备蚓，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以與空間環(huán)境相互作用课蔬，從而確定細(xì)胞特性。例如郊尝，Zhu等開發(fā)了一種基于全局基因表達(dá)方法二跋，能夠區(qū)分小鼠視皮層區(qū)域的細(xì)胞類型和空間域相關(guān)異質(zhì)性。根據(jù)該方法流昏，在谷氨酸能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞小室中發(fā)現(xiàn)了明顯的空間相關(guān)而與細(xì)胞類型無關(guān)的信號(hào)扎即。Shinozaki等利用LCM以及手動(dòng)切割結(jié)合RNA-seq，確定了不同區(qū)域和不同成熟度番茄基因表達(dá)模式的空間差異况凉。peng等通過整合時(shí)空信息谚鄙，研究了小鼠早期胚胎中譜系分配（lineage allocation）和組織結(jié)構(gòu)化（tissue organization）的分子架構(gòu)，全面描繪了小鼠胚胎發(fā)育早期關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)刁绒。
五 未來展望
雖然空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在發(fā)現(xiàn)疾病因子闷营、構(gòu)建空間圖譜和繪制空間藍(lán)圖方面得到廣泛應(yīng)用和推廣，但其潛力遠(yuǎn)不止于此知市。例如在細(xì)胞間通訊研究中傻盟，不同細(xì)胞類型的環(huán)境相關(guān)互作是基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和已知的配體-受體復(fù)合物推斷而來的。然而細(xì)胞之間正在進(jìn)行的相互作用很難被瞬時(shí)捕捉嫂丙。無論是在組織還是在培養(yǎng)環(huán)境中娘赴，緊密空間中細(xì)胞更容易相互作用，這正是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域跟啤。將空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)引入細(xì)胞間通訊研究中非常值得期待诽表。一些優(yōu)雅的實(shí)驗(yàn)顯示了缺血神經(jīng)元的體細(xì)胞線粒體和軸突線粒體在單細(xì)胞尺度上的通訊。此外隅肥，scRNA-seq技術(shù)在許多方面促進(jìn)了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展关顷，例如提供細(xì)胞分型標(biāo)記基因，這反過來又幫助scRNA-seq通過基因空間分布來區(qū)分亞群武福。此外，由于基于成像的方法痘番，如seqFISH+捉片、MERFISH和STARmap可以提供觀察單個(gè)細(xì)胞內(nèi)分子行為的亞細(xì)胞視圖平痰，因此分析基因間相互作用組、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和多模式組學(xué)成為可能伍纫。研究表明宗雇，DNA變異與mRNA表達(dá)有關(guān)，因此檢測分子的同時(shí)獲取其原始坐標(biāo)可加深我們對轉(zhuǎn)錄因子如何激活基因表達(dá)莹规、基因間如何相互溝通以及細(xì)胞如何運(yùn)作的理解赔蒲。突破這些瓶頸（懸而未決的問題）已成為未來前進(jìn)方向。
下期預(yù)告：小編解析2020年8月20日發(fā)表于Cell的空間轉(zhuǎn)錄組研究阿爾茲海默癥（AD）文章良漱。
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